方法文章

一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

DOI：

10.3791/56932

⸱

2018年5月6日

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

直接注射癌源性细胞外囊泡（EVs）可导致骨髓重编程，从而促进肿瘤进展；然而，介导这一效应的具体细胞类型尚不明确。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，用于研究EV介导的肿瘤-间充质干细胞（MSC）相互作用。 体内，揭示了经细胞外囊泡教育的间充质干细胞在转移中的关键作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在肿瘤微环境中，定植或募集而来的间充质干细胞（MSCs）可促进多种癌症类型的恶性进展。在特定环境信号的影响下，这些成体干细胞能够释放旁分泌介质，从而加速肿瘤生长和转移。明确肿瘤细胞与间充质干细胞之间的相互作用，对于理解癌症进展的潜在机制并确定新的治疗干预靶点具有重要意义。

癌细胞会产生大量细胞外囊泡（EVs），这些囊泡可显著影响肿瘤微环境中或远端部位靶细胞的行为。肿瘤来源的EVs包裹着多种功能性生物分子，包括炎性RNA和（致癌）蛋白，能够“教育”间充质干细胞（MSCs），促进癌细胞的转移行为，或参与转移前微环境的形成。本文中，我们描述了一种可临床前应用的小鼠癌症模型的建立方法，该模型可用于特异性评估肿瘤细胞与间充质干细胞之间由EV介导的相互作用。首先，我们介绍了肿瘤细胞分泌的EVs的纯化与表征方法，以及MSCs对EVs内吞作用的检测。随后，采用基于多重微球的免疫分析法，评估癌源性EVs诱导的MSCs细胞因子表达谱的改变。最后，我们展示了构建发光标记的原位骨肉瘤异种移植小鼠模型的方法，该模型可真实再现肿瘤细胞与MSCs之间的相互作用，并揭示经EV“教育”后的MSCs在肿瘤生长和转移形成中的作用。

我们的模型为阐明癌症来源的细胞外囊泡（EV）如何塑造支持肿瘤的微环境提供了机会，并可用于评估阻断肿瘤细胞与间充质干细胞（MSCs）之间EV介导的通讯是否能够防止癌症进展。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤微环境积极参与肿瘤发生和癌症进展的大多数（即使不是全部）方面，包括转移灶的形成以及对治疗药物耐药性的产生1。这凸显了建立临床前原位癌症小鼠模型的重要性，此类模型可用于解析肿瘤微环境中复杂的肿瘤-间质相互作用。

在肿瘤微环境的多种细胞成分中，间充质干细胞（MSCs）在包括乳腺癌、前列腺癌、脑肿瘤、多发性骨髓瘤和骨肉瘤在内的多种癌症类型中显著促进癌症进展2,3,4,5,6,7. 间充质干细胞（MSCs）是存在于多种成体和胎儿组织（包括骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带血等）中的多能干细胞8,9在癌症引发的炎症信号刺激下，间充质干细胞（MSCs）会迁移至肿瘤部位，融入肿瘤微环境，并最终分化为支持癌症发展的细胞。10。这些与癌症相关的MSC提供了必要的因子（即， 生长因子、趋化因子、细胞因子和免疫抑制介质）通过作用于肿瘤细胞及周围间质，促进肿瘤进展2,3,11,12,13尽管癌症相关间充质干细胞（MSCs）的促肿瘤作用已在多种癌症模型中得到研究，但肿瘤细胞重编程MSCs以形成促癌微环境的机制仍不清楚。本文描述了一种原位异种移植模型的建立，该模型可特异性地用于研究骨癌细胞与间充质干细胞通过细胞外囊泡（EVs）介导的促肿瘤发生相互作用。

细胞外囊泡（EVs）是肿瘤细胞与基质细胞之间细胞间通讯的关键介质14。EVs 携带来源细胞的功能性生物分子，包括蛋白质、脂质和调控性 RNA。一旦释放到细胞外空间，这些囊泡可被周围细胞摄取，或通过血液或淋巴循环运输至远端部位，从而显著影响靶细胞的行为15,16,17。例如，癌细胞来源的 EVs 被基质成纤维细胞摄取后，可能诱导其向肌成纤维细胞分化，从而在体内促进血管生成并加速肿瘤生长in vivo18,19；被内皮细胞内化后可刺激肿瘤血管生成并增加血管通透性16,20；与免疫细胞相互作用则可能导致抗肿瘤免疫反应受到抑制21。

我们最近利用骨肉瘤的生物发光原位异种移植小鼠模型证明，肿瘤细胞释放大量细胞外囊泡（EVs），可诱导间充质干细胞（MSCs）获得促肿瘤和促转移表型。该效应源于MSCs细胞因子表达谱的显著改变（称为 "间充质干细胞教育"），可通过给予治疗性白细胞介素-6受体（IL-6R）抗体加以预防7我们的研究证明，肿瘤来源的细胞外囊泡（EV）是间充质干细胞（MSC）行为的关键调节因子，从而为靶向微环境以抑制骨肉瘤进展的策略提供了理论依据。本文中，我们描述了一种逐步研究EV介导的肿瘤-MSC相互作用的实验方案。 体内该模型旨在：1）明确定义肿瘤微环境中由癌症来源的细胞外囊泡（EV）诱导的间充质干细胞（MSC）行为改变；2）评估这种相互作用如何促进骨肿瘤生长及转移灶形成；3）研究干扰EV介导的细胞间通讯是否能够抑制上述过程。 体内 抑制癌症进展。

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方案

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用于分离间充质干细胞的人类脂肪组织在获得机构伦理委员会批准并取得书面知情同意后，由荷兰希尔弗瑟姆特尔戈伊医院（Tergooi Hospital）整形外科提供。GFP阳性的脂肪间充质干细胞由摩德纳和雷焦艾米利亚大学（University of Modena and Reggio Emilia）儿童与成人内外科科学系提供。

动物实验遵循荷兰动物实验法进行，实验方案经荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心动物实验委员会批准。

1. 肿瘤分泌的细胞外囊泡的分离。

  1. 使用超速离心转头，在 4 °C 条件下以 70,000 × g 离心胎牛血清（FBS）过夜（16 小时），不启用刹车功能（减速过程预计需 1 小时）。小心收集上清液（即去外泌体 FBS），避免扰动沉淀。使用 0.22 µm 滤器过滤去外泌体 FBS。
  2. 通过在 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）中添加 100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、2 mM 谷氨酰胺（1× P/S/G）以及 5% 去外泌体 FBS，制备去外泌体培养基。
  3. 将 3 × 106 个 143B 细胞接种于 175 cm2 培养瓶中，并在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中，使用去外泌体培养基进行培养。当细胞融合度达到 80–90% 时（通常在 36 至 48 小时后），收集来自 8 个 175 cm2 培养瓶（每瓶 28 mL）的上清液用于外泌体（EV）分离。
  4. 通过差速离心法对细胞上清液进行预清除，以去除细胞及细胞碎片（每次离心后均取上一次离心所得上清液进行下一步操作），具体步骤如下：
    1. 以 500 × g 离心上清液两次，每次 10 分钟。
    2. 以 2000 × g 离心上清液两次，每次 15 分钟。
    3. 以 10,000 × g 离心上清液两次，每次 30 分钟。
    4. 所有离心步骤均在 4 °C 下进行，并设置为最大加速度和减速度。每步完成后，小心收集含外泌体的上清液，保留约 1 mL 液体。立即进入步骤 1.5，或在 -80 °C 下保存预清除后的条件培养基，待后续进行外泌体分离。
  5. 将预清除后的条件培养基转移至超速离心管（每管终体积为 38.5 mL），使用超速离心转头在 4 °C 下以 70,000 × g 离心 1 小时，采用慢速刹车模式，以分离外泌体（EVs）。
  6. 小心移除上清液，保留约 1 mL 液体，将含外泌体的沉淀重悬于残留液体中，合并所有样品至同一超速离心管中，并加入磷酸盐缓冲液（PBS）至完全充满（终体积为 38.5 mL）。
  7. 再次在 4 °C 下以 70,000 × g 离心 1 小时，不启用刹车（减速过程预计需 1 小时）。小心移除上清液，避免扰动沉淀，保留 100–200 µL 液体。
  8. 将外泌体沉淀重悬，并用 PBS 调整终体积至 200 µL（所有外泌体分离均标准化为此体积）。外泌体制剂可立即使用，或保存于 -80 °C 待用22。
    注意：外泌体可在 -80 °C 下保存长达 6 个月。

2. 细胞外囊泡表征。

纯化的细胞外囊泡（EVs）可通过透射电子显微镜（TEM）进行观察23。

  1. 将EV样本与等体积的4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液混合。
  2. 在室温下，用5 µL EV悬液孵育200目Formvar-碳支持膜镍网20分钟。
  3. 用含1%戊二醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）固定TEM载网上的EV样本，以草酸铀酰（pH 7.0）进行对比染色，并在冰上用4%醋酸铀酰与2%甲基纤维素按1:9比例混合液包埋。
  4. 使用不锈钢金属环取出载网，并用滤纸吸去多余液体，以确保甲基纤维素膜具有适当厚度。
  5. 干燥后，使用透射电子显微镜观察载网，并通过连接相应图像软件的数字相机采集图像。

3. 肿瘤来源的细胞外囊泡对间充质干细胞的教育作用。

  1. 通过在α-最小必需培养基（alpha-MEM）中添加4% 去除细胞外囊泡的人血小板裂解液（hPL），制备MSC培养基24，肝素（10 U/mL）和1×青霉素/链霉素/谷氨酰胺（P/S/G）。
    注意：无细胞外囊泡的hPL是根据第1.1节所述步骤制备的。
  2. 种子 1.4 x 106 每75 cm²的脂肪来源的MSCs2 烧瓶，并在37 °C、5% CO2的培养箱中，用去除EV的MSC培养基进行培养。
  3. 当细胞达到70%融合度时，加入143B骨肉瘤细胞或对照人成纤维细胞（hf）-EVs，每平方厘米加入10 µL EV制备物2 培养瓶中孵育24小时，然后加入等量的EVs，继续孵育6小时。注：人成纤维细胞在含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，EVs的分离方法见第1节。
  4. 收集MSC上清液，于4 °C以500 × g离心1次，5分钟（离心机加速度和减速度均设为最大），转移至新离心管，将澄清的上清液于-80 °C保存，用于后续细胞因子分析（第5节）。
  5. 对于 体内 实验（第6节），培养GFP阳性MSCs25 如第3.1至3.3节所述，收集细胞并将其重悬于PBS中，终浓度为106 每 100 µL 含相应细胞数。细胞在注射前需置于冰上保存。

4. 细胞外囊泡内化实验。

为了观察间充质干细胞（MSCs）对细胞外囊泡（EV）的摄取，按照生产商的方案，使用绿色荧光连接染料（GFLD）（可商业获得）对EV进行标记：

  1. 简而言之，向200 µL EV样本中加入180 µL稀释液。将1 µL GFLD染料溶于50 µL稀释液中，取20 µL稀释后的染料加入稀释后的EV样本中。
  2. 用移液器轻轻混匀，室温避光孵育3分钟。
  3. 加入5 mL含0.1% BSA的PBS，转移至超速离心管中，并用PBS加满离心管（终体积为38.5 mL/管）。
  4. 在 4 °C 条件下，以 70,000 × g 离心 1 小时（无刹车，预计减速耗时 1 小时）。小心吸去上清液，并将标记的 EV 沉淀重悬于终体积为 200 µL 的溶液中（用 PBS 调整体积）。
  5. 添加 将标记的EVs加入MSC培养物中，或于-80 °C保存。经一夜孵育后，通过荧光显微镜和流式细胞术评估囊泡的内化情况7.

5. 评估间充质干细胞的细胞因子表达谱。

  1. 为了在间充质干细胞条件培养基（参见步骤3.4）中对白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-12p70（IL-12p70）蛋白水平进行多重定量，可使用市售的人类炎症性细胞因子流式微球阵列（CBA）试剂盒，并按照制造商提供的说明书操作。
  2. 简言之，混匀抗体偶联的捕获微球后，将其加入所有检测管中；随后向各管中加入细胞因子标准品稀释液或条件培养基样本。
  3. 加入检测试剂，在室温下孵育3小时。
  4. 使用提供的洗涤液洗涤微球，然后通过流式细胞仪检测样本，并根据制造商说明书分析数据。

6. 骨肉瘤异种移植小鼠原位模型的建立。

  1. 让6周龄的雌性Athymic Nude-Foxn1nu小鼠在开始实验操作前适应环境至少一周。
  2. 手术前一天及围手术期镇痛期间，将对乙酰氨基酚加入饮水中稀释使用。 "儿童用对乙酰氨基酚溶液" （参见 材料表) 加水至终浓度为 2 mg/mL。根据平均饮水量 150 mL/kg/天和平均体重 20 g，该剂量足以达到每只小鼠 6 mg/天（300 mg/kg/天）的给药量。
  3. 术后继续给予镇痛治疗至24小时，若动物仍表现出疼痛症状，则应延长镇痛时间。
  4. 手术当天，通过300 × g离心10分钟收集培养的荧光素酶阳性（Fluc）143B细胞（此前通过慢病毒转导获得），并将细胞重悬于浓度为2 × 10⁶细胞/毫升的悬液中。5 细胞/µL，置于PBS中，冰上保存不超过6小时。
  5. 高压灭菌手术器械。准备并清洁操作区域，将灭菌的剪刀和镊子放置在无菌纱布上。手术前20分钟（步骤6.8），使用0.5 mL胰岛素注射器（29号针头）皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg，用0.9%生理盐水稀释）作为镇痛剂 针）
  6. 在对每只动物进行麻醉前，用10 µL注射器吸取至少1 µL浓缩的（Fluc）143B细胞悬液（见步骤6.4）。
  7. 使用异氟烷吸入麻醉（氧气中浓度为 2 - 3%）对动物进行麻醉。通过夹捏足趾检查动物的麻醉深度，当动物对夹捏无反应时， 即， 动物深度麻醉后，需在眼睛上涂抹眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。
  8. 将动物仰卧位固定，头部置于麻醉面罩中，四肢朝向操作者。屈曲左侧膝关节。用70%乙醇擦拭皮肤，并用棉签蘸取利多卡因（2%）涂抹3次，作为局部镇痛。
  9. 使用无菌外科手术刀在膝关节下方皮肤处做一个小切口（约5 mm），以暴露胫骨。在距膝关节约2 mm处，使用0.8 mm微型麻花钻在胫骨上钻一个小孔。注意避免穿透胫骨双侧皮质。
  10. 注射1 µL细胞悬液（约2 x 105 使用26号针头在约5秒内缓慢将细胞注入孔中。用一滴组织胶封闭孔洞，以防止悬液回流。
  11. 用单丝缝线缝合皮肤，并涂抹一滴组织胶。将动物置于加热良好的环境中恢复（可使用加热灯）。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。只有在动物完全从麻醉中恢复后，方可将其放回原有笼具中。
  12. 肿瘤接种后两天，注射经细胞外囊泡（EV）诱导或未经诱导的GFP阳性MSCs（106 用0.5 mL胰岛素注射器将100 µL PBS中的细胞静脉注射，参见步骤3.5 小鼠尾静脉
  13. 通过生物发光成像监测肿瘤生长26 每周两次。为此，使用胰岛素注射器向小鼠腹腔注射 150 µL D-荧光素钠（30 mg/mL）。注射后 10 分钟，将动物置于生物发光成像系统中，检测肿瘤细胞产生的光子通量。
  14. 此外，使用游标卡尺测量原发性骨肿瘤的直径。肿瘤体积（单位：mm3通过宽度乘以长度来估算2 × 0.5
  15. 注：人道终点定义为肿瘤直径 >15 毫米或体重减轻 >15%.

7. 肺结节数量的评估

  1. 当某只动物达到第6.14步中定义的人道终点（大约在3至4周内），终止实验并收集和分析所有相关组织。
  2. 在实施安乐死前10分钟，使用0.5 mL胰岛素注射器注射150 µL D-荧光素（30 mg/mL）。
  3. 使用异氟烷吸入麻醉法对动物进行麻醉（参见第6.7步）。通过轻捏脚趾无反应来确认小鼠麻醉深度。采用颈椎脱位法处死小鼠27。
  4. 使用灭菌剪刀和镊子收集肺、肝、脾和肾。用PBS冲洗器官以去除血迹，并将其置于培养皿中。
  5. 将装有器官的培养皿放入生物发光成像系统中。检测器官两侧的生物发光信号。测量完成后，立即将器官浸入4%甲醛溶液中固定 （24–72小时，室温），以备后续组织学分析。
  6. 使用适当的成像软件对获得的图像进行手动阈值处理。统计每张图像中肺结节数量，并计算双侧肺组织中肺结节的总数。

8. 组织学分析

  1. 肺组织的组织学分析：
    1. 将经甲醛固定的器官包埋于石蜡中，并制备6 µm厚的组织切片。
    2. 对肺组织切片进行脱蜡处理，并在0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6）中煮沸15分钟以进行抗原修复。
    3. 将切片在室温下水平孵育，使用抗体稀释液（商品化产品）将抗人波形蛋白抗体（200 µg/mL）按1:150比例稀释，随后加入HRP标记的二抗（0.5 mg/mL，稀释比例1:500）。用3'-二氨基联苯胺（DAB）染色，并以苏木精复染。
    4. 使用配备相应相机和图像软件的光学显微镜观察染色后的组织切片。
  2. 检测小鼠胫骨中GFP阳性间充质干细胞的存在：
    1. 使用0.24 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（pH 7.2–7.4）对胫骨进行脱钙处理。每隔一天更换一次EDTA缓冲液，直至骨骼变软（约1周）。
    2. 对胫骨进行脱水并浸润石蜡。将胫骨（包括骨肉瘤组织）包埋于石蜡块中。
    3. 使用切片机制备6 µm厚的石蜡切片，并将切片转移至载玻片上。干燥后，在室温下存放过夜。
    4. 采用加热介导的抗原修复方法（参见8.1.2），使用抗体稀释液将抗GFP抗体（全抗血清）按1:900比例稀释后对组织进行染色，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。
    5. 使用配备相应成像软件的荧光显微镜观察组织切片。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究探讨了骨肉瘤细胞分泌的细胞外囊泡（EV）诱导间充质干细胞（MSC）向促肿瘤和促转移表型转化的能力。我们发现，骨肉瘤细胞释放出类似外泌体的EV，并可被MSC摄取。我们检测了肿瘤来源EV诱导的MSC细胞因子表达谱的改变，并评估了经EV诱导后的MSC对肿瘤生长和转移形成的影响。研究设计的整体示意图见图1。

通过差速离心法纯化了143B骨肉瘤细胞或对照人成纤维细胞释放的细胞外囊泡（EVs）。通过电子显微镜确认EV的纯度，结果显示制备物主要包含直径在40–100 nm之间的囊泡（图2A）。为了评估肿瘤来源的EVs是否与间充质干细胞（MSCs）发生相互作用，我们使用绿色荧光脂质亲和染料（GFLD）标记囊泡，并与靶细胞共孵育过夜。荧光显微镜观察显示MSCs能有效摄取EVs（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤分泌的细胞外囊泡（EVs）可改变局部和远端间充质细胞的生理状态，从而形成支持肿瘤生长的微环境。本文描述了一种骨肉瘤的临床前小鼠模型的建立方法，该模型可用于解析肿瘤细胞与间充质干细胞（MSCs）之间由EV介导的相互作用。 体内我们证明，在携带骨肉瘤异种移植瘤的小鼠中，全身注射经人肿瘤细胞外囊泡（EV）诱导的间充质干细胞可显著促进肿瘤生长和转移形成，其机制是通过激活IL-6/STAT3信号通路。7.

近期研究表明，肿瘤来源的细胞外囊泡可促进转移前微环境的形成 通过改变局部或骨髓来源的基质细胞的行为16,28,29这些研究大多通过将肿瘤来源的囊泡直接注射到受体小鼠体内进行，这使得难以确定介导促瘤效应的具体细胞类型。在本方案中，间充质干细胞（MSCs）与肿瘤来源的细胞外囊泡（EVs）的共培养过程发生于体外 体外

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.R. Baglio 获得了意大利癌症研究协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro，AIRC）提供的博士后奖学金资助，该奖学金由欧盟共同资助。此外，本项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No 660200（授予 S.R. Baglio）下的资金支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>仪器设备
超速离心机贝克曼Optima L-90K
转子 SW32Ti贝克曼369650在文稿中称为超速摆动桶转子
透射电子显微镜ZeissEM109或类似的透射电子显微镜
数码相机尼康DMX 1200F或类似型号的相机
成像软件 TEM 尼康ACT-1
荧光显微镜ZeissImager.D2荧光显微镜或类似设备
成像软件 FMZeissZEN Blue
培养箱Nuaire4750E
离心HettickROTANTA 460R
-80℃ 冰箱Thermo Electro Corporation未提供
FACSBDBD FACScalibur或类似的流式细胞仪
钻孔费米FCT-300使用0.8 mm钻头
HSS 微型麻花钻，0.8 mmProxxon28 8520.8 mm 钻头
IVIS 相机XenogenIvis Lumina在文稿中称为生物发光相机。Xenogen 现已并入 Perkin Elmer。
活体成像软件2.60Xenogen / Igor Por无Xenogen 现为 Perkin Elmer 的一部分
10 µL型注射器HamiltonNeuros Model 1701 RN
针头：Hamilton RN 注射器针头，26 号规格，AS 型针尖，定制长度 2 cmHamilton未提供
CaliperMitutoyoG08004463
高压灭菌Astell无可用数据
加热灯飞利浦未提供
<强>培养基
胎牛血清HycloneRYG35912
血小板裂解液未提供未提供
IMDM培养基LonzaBE12-722F
α-MEM 培养基LonzaBE02-002F
DMEM 培养基LonzaBE12-614F
青霉素/链霉素/谷氨酰胺GIBCO10378-016
肝素LEO012866-08
胰蛋白酶/EDTA（10倍浓缩液）GIBCO15400-054
<强>细胞
脂肪来源的间充质干细胞未提供未提供
GFP阳性MSCs未提供未提供
人成纤维细胞无未提供
143B 细胞ATCCCRL-8303
FLUC-143B 细胞ATCCCRL-8303转导的
<强>一次性用品
175 cm² 培养瓶CELLSTAR660175
50 mL 离心管Greiner bio-one210261
冻存管赛默飞世尔科技377224
超透明管贝克曼344058在文稿中称为超速离心管
0,22 µm 滤膜MillexSLGV033RS
200目 Formvar-碳支持膜镍网电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）
0.5 mL 胰岛素注射器，带 29G 针头TerumoU-100 
培养皿Sigma-AldrichP7612
滤纸 赛默飞世尔科技50363215
<强>试剂/试剂盒
多聚甲醛Alfa Aeser43368.9M
PBS布劳恩220/12257974/110
戊二醛电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）16300
草酸铀酰电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）22510
醋酸铀电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）22400
甲基纤维素电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）1560
PKH67Sigmamini67-1kt在文稿中称为 GFLD
BSASigmaA8412
CBA - 人炎症性细胞因子检测试剂盒BD551811
甲醛 37%VWR104003100
碳钢外科手术刀片Swann-Morton206在文稿中称为手术刀
抗人波形蛋白抗体圣克鲁斯sc-6260克隆 V9
抗体稀释液DAKOS0809
HRP标记的抗小鼠IgG抗体Life Technologies32230
DAB试剂盒DAKOK500711
苏木精SigmaGHS232
EDTA缓冲液未提供无可用数据
柠檬酸盐缓冲液未提供未提供
兔多克隆抗GFP抗体Abcam无可用数据Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
对乙酰氨基酚，120 mg / 5 ml 糖浆拜耳未提供Sinaspril，儿童用对乙酰氨基酚溶液
异氟烷 1000 mg/g范德比尔特大学医学中心药房无可用数据
盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/mlIndivior UK Limited未提供
利多卡因-HCL 2%范德比尔特大学医学中心药房未提供
70% 乙醇VWR93003.1006
组织胶Derma+Flex，配方医用氰基丙烯酸酯VygonLB604060
滴眼液：Vidisec Carbogel，2 mg/ml博士伦未提供
D-荧光素钾盐Gold BiotechnologyLUCK-1
载玻片赛默飞世尔科技630-0954
不锈钢环 未提供未提供
<强>小鼠实验
小鼠，Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu  雌性，6周龄到达，细菌状态符合FELASA标准ENVIGO未提供
纸浆智能家居（笼内环境丰富化）生物服务未提供
Alpha-dri 垫料材料谢泼德特种纸业未提供
小鼠饲料：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿类动物饮食ENVIGO2918-11416M
缝合线EthiconV926H
剪刀Sigma-AldrichS3146-1EA（或类似物）
镊子Sigma-AldrichF4142-1EA（或类似物）

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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