直接注射癌源性细胞外囊泡（EVs）可导致骨髓重编程，从而促进肿瘤进展；然而，介导这一效应的具体细胞类型尚不明确。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，用于研究EV介导的肿瘤-间充质干细胞（MSC）相互作用。 体内，揭示了经细胞外囊泡教育的间充质干细胞在转移中的关键作用。
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方法文章
一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在肿瘤微环境中，定植或募集而来的间充质干细胞（MSCs）可促进多种癌症类型的恶性进展。在特定环境信号的影响下，这些成体干细胞能够释放旁分泌介质，从而加速肿瘤生长和转移。明确肿瘤细胞与间充质干细胞之间的相互作用，对于理解癌症进展的潜在机制并确定新的治疗干预靶点具有重要意义。
癌细胞会产生大量细胞外囊泡（EVs），这些囊泡可显著影响肿瘤微环境中或远端部位靶细胞的行为。肿瘤来源的EVs包裹着多种功能性生物分子，包括炎性RNA和（致癌）蛋白，能够“教育”间充质干细胞（MSCs），促进癌细胞的转移行为，或参与转移前微环境的形成。本文中，我们描述了一种可临床前应用的小鼠癌症模型的建立方法，该模型可用于特异性评估肿瘤细胞与间充质干细胞之间由EV介导的相互作用。首先，我们介绍了肿瘤细胞分泌的EVs的纯化与表征方法，以及MSCs对EVs内吞作用的检测。随后，采用基于多重微球的免疫分析法，评估癌源性EVs诱导的MSCs细胞因子表达谱的改变。最后，我们展示了构建发光标记的原位骨肉瘤异种移植小鼠模型的方法，该模型可真实再现肿瘤细胞与MSCs之间的相互作用，并揭示经EV“教育”后的MSCs在肿瘤生长和转移形成中的作用。
我们的模型为阐明癌症来源的细胞外囊泡（EV）如何塑造支持肿瘤的微环境提供了机会，并可用于评估阻断肿瘤细胞与间充质干细胞（MSCs）之间EV介导的通讯是否能够防止癌症进展。
引言
肿瘤微环境积极参与肿瘤发生和癌症进展的大多数（即使不是全部）方面，包括转移灶的形成以及对治疗药物耐药性的产生1。这凸显了建立临床前原位癌症小鼠模型的重要性，此类模型可用于解析肿瘤微环境中复杂的肿瘤-间质相互作用。
在肿瘤微环境的多种细胞成分中，间充质干细胞（MSCs）在包括乳腺癌、前列腺癌、脑肿瘤、多发性骨髓瘤和骨肉瘤在内的多种癌症类型中显著促进癌症进展2,3,4,5,6,7. 间充质干细胞（MSCs）是存在于多种成体和胎儿组织（包括骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带血等）中的多能干细胞8,9在癌症引发的炎症信号刺激下，间充质干细胞（MSCs）会迁移至肿瘤部位，融入肿瘤微环境，并最终分化为支持癌症发展的细胞。10。这些与癌症相关的MSC提供了必要的因子（即， 生长因....
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方案
用于分离间充质干细胞的人类脂肪组织在获得机构伦理委员会批准并取得书面知情同意后，由荷兰希尔弗瑟姆特尔戈伊医院（Tergooi Hospital）整形外科提供。GFP阳性的脂肪间充质干细胞由摩德纳和雷焦艾米利亚大学（University of Modena and Reggio Emilia）儿童与成人内外科科学系提供。
动物实验遵循荷兰动物实验法进行，实验方案经荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心动物实验委员会批准。
1. 肿瘤分泌的细胞外囊泡的分离。
- 使用超速离心转头，在 4 °C 条件下以 70,000 × g 离心胎牛血清（FBS）过夜（16 小时），不启用刹车功能（减速过程预计需 1 小时）。小心收集上清液（即去外泌体 FBS），避免扰动沉淀。使用 0.22 µm 滤器过滤去外泌体 FBS。
- 通过在 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）中添加 100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、2 mM 谷氨酰胺（1× P/S/G）以及 5% 去外泌体 FBS，制备去外泌体培养基。
- 将 3 × 106 个 143B 细胞接种于 175 cm2 培养瓶中，并在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中，使用去外泌体培养基进行培养。当细胞融合度达到 80–90% 时（通常在....
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结果
本研究探讨了骨肉瘤分泌的细胞外囊泡（EV）将间充质干细胞（MSCs）诱导为促肿瘤和促转移表型的能力。我们发现骨肉瘤细胞释放出类似外泌体的EV，这些EV可被MSCs内化。我们检测了肿瘤来源EV诱导的MSC细胞因子表达谱的改变，并评估了经EV诱导后的MSC对肿瘤生长和转移形成的影响。研究设计的整体示意图见图1。
通过差速离心法纯化了143B骨肉瘤细胞或对照人成纤维细胞释放的细胞外囊泡（EVs）。通过电子显微镜确认EVs的纯度，结果显示制备物主要包含直径在40 - 100 nm之间的囊泡（图2A）。为了评估肿瘤来源的EVs是否与间充质干细胞（MSCs）发生相互作用，我们使用绿色荧光脂质亲和性标记染料（GFLD）对囊泡进行标记，并与靶细胞共孵育过夜。荧光显微镜观察显示MSCs能够高效摄取EVs（
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讨论
肿瘤分泌的细胞外囊泡（EVs）可改变局部和远端间充质细胞的生理状态，从而形成支持肿瘤生长的微环境。本文描述了一种骨肉瘤的临床前小鼠模型的建立方法，该模型可用于解析肿瘤细胞与间充质干细胞（MSCs）之间由EV介导的相互作用。 体内我们证明，在携带骨肉瘤异种移植瘤的小鼠中，全身注射经人肿瘤细胞外囊泡（EV）诱导的间充质干细胞可显著促进肿瘤生长和转移形成，其机制是通过激活IL-6/STAT3信号通路。7.
近期研究表明，肿瘤来源的细胞外囊泡可促进转移前微环境的形成 通过改变局部或骨髓来源的基质细胞的行为16,28,29这些研究大多通过将肿瘤来源的囊泡直接注射到受体小鼠体内进行，这使得难以确定介导促瘤效应的具体细胞类型。在本方案中，间充质干细胞（MSCs）与肿瘤来源的细胞外囊泡（EVs）的共培养过程发生于体外 体外
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S.R. Baglio 获得了意大利癌症研究协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro，AIRC）提供的博士后奖学金资助，该奖学金由欧盟共同资助。此外，本项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No 660200（授予 S.R. Baglio）下的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>仪器设备 | |||
| 超速离心机 | 贝克曼 | Optima L-90K | |
| 转子 SW32Ti | 贝克曼 | 369650 | 在文稿中称为超速摆动桶转子 |
| 透射电子显微镜 | Zeiss | EM109 | 或类似的透射电子显微镜 |
| 数码相机 | 尼康 | DMX 1200F | 或类似型号的相机 |
| 成像软件 TEM | 尼康 | ACT-1 | |
| 荧光显微镜 | Zeiss | Imager.D2 | 荧光显微镜或类似设备 |
| 成像软件 FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| 培养箱 | Nuaire | 4750E | |
| 离心 | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80℃ 冰箱 | Thermo Electro Corporation | 未提供 | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | 或类似的流式细胞仪 |
| 钻孔 | 费米 | FCT-300 | 使用0.8 mm钻头 |
| HSS 微型麻花钻，0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm 钻头 |
| IVIS 相机 | Xenogen | Ivis Lumina | 在文稿中称为生物发光相机。Xenogen 现已并入 Perkin Elmer。 |
| 活体成像软件2.60 | Xenogen / Igor Por | 无 | Xenogen 现为 Perkin Elmer 的一部分 |
| 10 µL型注射器 | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| 针头：Hamilton RN 注射器针头，26 号规格，AS 型针尖，定制长度 2 cm | Hamilton | 未提供 | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| 高压灭菌 | Astell | 无可用数据 | |
| 加热灯 | 飞利浦 | 未提供 | |
| <强>培养基 | |||
| 胎牛血清 | Hyclone | RYG35912 | |
| 血小板裂解液 | 未提供 | 未提供 | |
| IMDM培养基 | Lonza | BE12-722F | |
| α-MEM 培养基 | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM 培养基 | Lonza | BE12-614F | |
| 青霉素/链霉素/谷氨酰胺 | GIBCO | 10378-016 | |
| 肝素 | LEO | 012866-08 | |
| 胰蛋白酶/EDTA（10倍浓缩液） | GIBCO | 15400-054 | |
| <强>细胞 | |||
| 脂肪来源的间充质干细胞 | 未提供 | 未提供 | |
| GFP阳性MSCs | 未提供 | 未提供 | |
| 人成纤维细胞 | 无 | 未提供 | |
| 143B 细胞 | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B 细胞 | ATCC | CRL-8303 | 转导的 |
| <强>一次性用品 | |||
| 175 cm² 培养瓶 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner bio-one | 210261 | |
| 冻存管 | 赛默飞世尔科技 | 377224 | |
| 超透明管 | 贝克曼 | 344058 | 在文稿中称为超速离心管 |
| 0,22 µm 滤膜 | Millex | SLGV033RS | |
| 200目 Formvar-碳支持膜镍网 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | ||
| 0.5 mL 胰岛素注射器，带 29G 针头 | Terumo | U-100 | |
| 培养皿 | Sigma-Aldrich | P7612 | |
| 滤纸 | 赛默飞世尔科技 | 50363215 | |
| <强>试剂/试剂盒 | |||
| 多聚甲醛 | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | 布劳恩 | 220/12257974/110 | |
| 戊二醛 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 16300 | |
| 草酸铀酰 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 22510 | |
| 醋酸铀 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 22400 | |
| 甲基纤维素 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | 在文稿中称为 GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - 人炎症性细胞因子检测试剂盒 | BD | 551811 | |
| 甲醛 37% | VWR | 104003100 | |
| 碳钢外科手术刀片 | Swann-Morton | 206 | 在文稿中称为手术刀 |
| 抗人波形蛋白抗体 | 圣克鲁斯 | sc-6260 | 克隆 V9 |
| 抗体稀释液 | DAKO | S0809 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG抗体 | Life Technologies | 32230 | |
| DAB试剂盒 | DAKO | K500711 | |
| 苏木精 | Sigma | GHS232 | |
| EDTA缓冲液 | 未提供 | 无可用数据 | |
| 柠檬酸盐缓冲液 | 未提供 | 未提供 | |
| 兔多克隆抗GFP抗体 | Abcam | 无可用数据 | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| 对乙酰氨基酚，120 mg / 5 ml 糖浆 | 拜耳 | 未提供 | Sinaspril，儿童用对乙酰氨基酚溶液 |
| 异氟烷 1000 mg/g | 范德比尔特大学医学中心药房 | 无可用数据 | |
| 盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | 未提供 | |
| 利多卡因-HCL 2% | 范德比尔特大学医学中心药房 | 未提供 | |
| 70% 乙醇 | VWR | 93003.1006 | |
| 组织胶 | Derma+Flex，配方医用氰基丙烯酸酯 | Vygon | LB604060 |
| 滴眼液：Vidisec Carbogel，2 mg/ml | 博士伦 | 未提供 | |
| D-荧光素钾盐 | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| 载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 630-0954 | |
| 不锈钢环 | 未提供 | 未提供 | |
| <强>小鼠实验 | |||
| 小鼠，Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 雌性，6周龄到达，细菌状态符合FELASA标准 | ENVIGO | 未提供 | |
| 纸浆智能家居（笼内环境丰富化） | 生物服务 | 未提供 | |
| Alpha-dri 垫料材料 | 谢泼德特种纸业 | 未提供 | |
| 小鼠饲料：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿类动物饮食 | ENVIGO | 2918-11416M | |
| 缝合线 | Ethicon | V926H | |
| 剪刀 | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | （或类似物） |
| 镊子 | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | （或类似物） |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. ....
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