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方法文章

一种采用新型磁性吻合技术进行肝上腔静脉重建的原位肝移植大鼠模型

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DOI：

10.3791/56933

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2018年3月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shaanxi Provincial Center for Regenerative Medicine and Surgical Engineering, First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, 2Institute of Advanced Surgical Technology and Engineering, First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, 3Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, 4Organ Transplantation Center, Tianjin First Center Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在大鼠原位肝移植中，肝上腔静脉（SHVC）的重建仍是一个困难的步骤。本文介绍了一种利用新型磁性吻合技术进行大鼠SHVC重建的逐步操作方案。

摘要

大鼠原位肝移植（OLT）模型对移植研究至关重要。该模型技术要求高，学习曲线陡峭。套管技术在门静脉（PV）和肝下腔静脉（IHVC）吻合中的应用显著简化了大鼠肝移植手术。然而，由于受体肝上腔静脉（SHVC）前壁较短，套管技术难以用于SHVC的重建。该领域大多数研究人员仍采用手工缝合技术进行SHVC重建，这使其成为大鼠原位肝移植中的瓶颈步骤。磁性吻合技术（即 magnamosis）是一种利用两块磁铁之间的吸引力连接两个血管的方法。我们近期的研究表明，在大鼠SHVC重建中，磁性吻合技术优于手工缝合技术。本文中，我们展示了采用新型磁性吻合技术进行大鼠SHVC重建的逐步操作方案。在该模型中，PV和IHVC的重建采用标准套管技术，胆管（BD）重建采用支架技术，未进行肝动脉再通。磁性吻合技术使SHVC重建更加简便，并显著缩短了无肝期。经过合理的学习过程后，即使不具备高级显微外科技能的研究人员，也能利用该大鼠OLT模型获得可靠且可重复的结果。

引言

大鼠原位肝移植（OLT）模型对移植研究至关重要1,2。首例大鼠OLT由Lee et al. 于1973年报道3。在该模型中，所有血管均采用手工缝合技术进行重建。手工缝合技术需要高超的显微外科技能，因而显著限制了其应用。此后，已有多种对原始大鼠OLT方案的改良方法被报道。其中，Kamada et al. 于1979年报道的用于门静脉（PV）和肝下腔静脉（IHVC）吻合的套管技术，被认为是该模型的重要改进，因其显著简化了重建过程4。然而，由于受体肝上腔静脉（SHVC）前壁较短，套管技术难以应用于SHVC的重建。目前该领域大多数研究者仍采用手工缝合技术进行SHVC重建，使其成为大鼠OLT中的瓶颈步骤5,6,7。

磁性吻合技术（即，磁吻合（magnamosis）是一种利用两个磁体之间的吸引力连接两个血管或其他管状结构的方法8,9,10,11磁力逐渐压缩并重塑组织，形成牢固的无缝合吻合。12,13这种压缩吻合术在人体中已被证明是有效的14,15我们专门设计了一对用于大鼠次肝静脉（SHVC）吻合的磁环。我们最近的研究表明，在大鼠原位肝移植（OLT）中，磁性吻合技术在SHVC重建方面优于手工缝合技术。16本文的目的是提供一种利用新型磁性吻合技术在大鼠中进行肝下腔静脉重建的详细分步操作方案。

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方案

该实验方案严格遵循《实验动物护理与使用指南》的要求，并经中国陕西省西安市西安交通大学实验动物伦理委员会批准。

注意：本方案中的任何步骤均未在手术显微镜下进行。

1. 术前准备

  1. 磁环的设计与形状（图1）
    1. 通过配对钕铁硼磁环组装磁性吻合装置。
    2. 根据大鼠SHVC的参数设计磁环，其长轴直径、短轴直径、厚度和重量分别为8 mm、5.5 mm、1 mm和0.5 g。
    3. 采用线电极切割技术将磁环弯曲成所需形状，然后用氧化钛喷雾涂层处理所获得的磁环，并在55–60 °C条件下使用500 mg/L环氧乙烷灭菌6小时。
  2. 套管（图2）
    1. 通过切割聚乙烯管制备用于IHVC和PV吻合的套管。确保套管主体长度为5 mm，套管延伸部分为2 mm。
      注：PV套管的内径和外径分别为1.8 mm和2.1 mm，而IHVC套管的内径和外径分别为2.6 mm和2.8 mm。
  3. 支架（图2）
    1. 通过切割24G静脉留置针制备用于BD吻合的支架，长度为5 mm，并在两端切成斜面。
  4. 实验动物
    1. 选用体重在250至280 g之间的雄性Sprague Dawley大鼠作为供体和受体。确保受体体重与供体相同或略重（< 10 g）。
    2. 术前将大鼠饲养于环境可控的房间内，自由摄食和饮水。

2. 供体手术

  1. 术前1小时皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）作为镇痛剂。
  2. 通过异氟烷吸入麻醉供体大鼠。使用5 vol%异氟烷，以1.5 L/min的流速在有机玻璃箱中诱导麻醉，随后以2 vol%异氟烷，0.6–0.8 L/min的流速通过锥形面罩维持麻醉。通过夹捏足趾和皮肤来确认麻醉深度。
  3. 使用电动剃须刀剃除大鼠整个腹部的皮肤毛发，以便更清晰地暴露手术区域。用聚维酮碘溶液对相应皮肤进行消毒。
  4. 使用手术剪从阴茎根部开始，沿腹中线向上至剑突上方1厘米处，做十字形切口以打开腹腔 白线，从纵切口的中点延伸至腋中线。将胃肠道向左侧外翻，并用湿纱布覆盖。
  5. 用止血钳夹住剑突并朝头部方向牵拉。解剖镰状韧带及肝脏周围的结缔组织。分离并用6-0丝线结扎左下膈静脉。
  6. 将支架置入胆管。
    1. 在胃十二指肠静脉汇入门静脉的位置稍上方用微血管夹夹闭胆总管，并用显微镊轻轻牵拉以保持轻微张力。然后进行 "V" 用显微剪刀在胆管汇合处近端约5 mm的前壁做一长约1 mm的切口。
    2. 使用弯头显微镊将支架插入胆管管腔内，确保至少有半段支架位于胆管外。
    3. 用6-0丝线固定支架。剪断缝线的一端，保留另一端用于后续吻合时牵拉。在支架下方横断胆管，并确保胆汁可从支架中流出。
  7. 分离下腔静脉至左侧肾静脉水平。使用棉签解剖法从前方和侧方周围组织中游离下腔静脉，直至下腔静脉完全裸化。分别以6-0丝线结扎右侧肾上腺静脉和右侧肾静脉。
  8. 通过阴茎背静脉注射将50 U肝素溶于2 mL生理盐水中，对大鼠进行肝素化处理。
  9. 灌注肝脏。
    1. 在左肾静脉下方分离腹主动脉。将22号导管插入主动脉。
    2. 行胸廓切开术，使用显微镊夹闭胸主动脉。
    3. 通过主动脉中的导管，使用输液泵以 3 mL/min 的速度向供体肝脏灌注 20 mL 含 25 U 肝素的生理盐水溶液（4 °C）。同时，剪断右肾静脉下方的下腔静脉 使灌注液从肝脏流出。
    4. 当供体肝脏变为苍白时，在左肾静脉水平横断下腔静脉（SHVC）、部分膈肌和下腔静脉（IHVC）。
  10. 用两把显微镊子分离PV周围的结缔组织。使用8-0 Prolene缝线结扎并切断幽门静脉。在脾静脉水平横断PV。切除供体肝脏，并用冷生理盐水冲洗。将其置于4 °C的冷盐水浴中。

3. 移植物制备

注意：肝脏移植物制备的所有操作均在4 °C的冷盐水浴中进行。

  1. 将套管连接至供体的下腔静脉（IHVC）（图3）。
    1. 将IHVC插入其套管中，使套管的延伸部分朝向肝脏方向，并将套管延伸部分置于IHVC的后壁。使用弯头显微镊子固定套管延伸部分和IHVC，并通过文件夹将镊子固定在浴槽容器上。
    2. 使用两把显微镊子将IHVC远端外翻覆盖在套管主体上。
    3. 用6-0丝线固定边缘。确保操作过程中IHVC未发生扭转。
  2. 对门静脉（PV）重复步骤3.1，以将套管连接至供体的PV。
  3. 将磁环连接至供体的上腔静脉（SHVC）（图4）。
    1. 通过四把镊子牵拉膈肌，并修剪SHVC。
    2. 使用钛合金显微镊子将SHVC穿过磁环。
    3. 将SHVC远端外翻覆盖在磁环上。
    4. 用6-0丝线固定磁环。确保操作过程中SHVC未发生扭转。
    5. 切除肝脏周围多余的膈肌组织。
  4. 将供体肝脏浸入冷生理盐水浴中，并在4 °C条件下保存。

4. 受体操作

注意：受体大鼠中移植物植入的示意图见图5。

  1. 术前1小时皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）作为镇痛剂。通过吸入异氟烷麻醉供体大鼠。使用5 vol%异氟烷以1.5 L/min的流速在亚克力盒中诱导麻醉，随后以2 vol%异氟烷以0.6–0.8 L/min的流速通过锥形面罩维持麻醉。
  2. 剃除大鼠整个腹部皮肤的毛发，并用聚维酮碘溶液对相应皮肤进行消毒。
  3. 通过一条4 cm长的腹正中切口打开腹腔。放置腹腔牵开器，将肋骨尽可能向两侧拉开。
  4. 使用止血钳夹住剑突并向头部方向牵拉。解剖肝脏周围的结缔组织和韧带。结扎并切断肝食管韧带。使用8-0聚丙烯缝线结扎并切断肝动脉。
  5. 从第一肝门处游离出胆总管。在胆总管分叉下方用6-0丝线环绕胆总管并进行结扎。
  6. 向下解剖下腔静脉至右肾静脉水平。结扎并切断右肾上腺静脉。将一条牵引带穿过肝脏的肝上腔静脉（SHVC）。
  7. 使用微血管夹在右肾静脉上方夹闭下腔静脉（IHVC）。使用微血管夹在幽门静脉水平夹闭门静脉（PV）。
    1. 为冲洗肝脏内的血液，通过门静脉缓慢注入2 mL生理盐水。通过牵拉先前放置的牵引带将肝脏向下牵拉。使用Satinsky钳夹闭肝上腔静脉及部分膈肌。
    2. 在靠近肝实质处切断下腔静脉，在肝门处切断门静脉。在肝脏上方稍远处切断肝上腔静脉以完整切除供体肝脏。迅速移除受体肝脏。
  8. 将磁性环连接至受体的肝上腔静脉（SHVC）。
    1. 将受体残余的肝上腔静脉插入磁性环内。
    2. 通过磁力将磁性环固定在Satinsky钳上。
    3. 将肝上腔静脉外翻覆盖在磁性环上，直至血管完全覆盖环的边缘。
  9. 将供体肝脏移植物原位植入，并用冷湿纱布覆盖。
  10. 用生理盐水充满供体和受体肝上腔静脉（SHVC）的管腔，彻底排除气泡以防止空气栓塞。通过磁力将嵌入供体和受体SHVC中的磁性环对接，完成SHVC的重建。
  11. 重建门静脉（PV）。
    1. 通过牵拉8-0聚丙烯缝线来牵引受体门静脉的左右分支，以维持门静脉张力。
    2. 将受体门静脉的夹子从幽门静脉下移至脾静脉，以充分暴露静脉。
    3. 切开受体门静脉前壁，用生理盐水充满PV管腔。
    4. 用弯头镊子夹住供体门静脉的套管延伸部分。
    5. 在持续用生理盐水冲洗PV管腔的同时，将供体门静脉的套管主体插入受体门静脉内。
    6. 使用6-0丝线行环形结扎固定。松开PV和SHVC上的夹子，恢复移植物肝脏的血流。
  12. 对下腔静脉（IHVC）重复步骤4.11，完成IHVC的重建。
  13. 采用支架技术重建胆管。
    1. 在受体胆总管前壁切开一个"V"形切口。
    2. 将供体支架插入受体胆管（BD）管腔，并用6-0丝线行环形缝合固定。将两根胆管上的缝线拉紧并打结，使胆管紧密对合。
    3. 用大网膜组织包裹吻合口，防止胆汁渗漏。
  14. 用温热的生理盐水冲洗腹腔。使用连续的3-0不可吸收外科缝线分两层关闭腹部切口。
  15. 术后立即皮下注射头孢呋辛（16 mg/kg，抗生素）和布托啡诺（0.05 mg/kg，镇痛剂）。
  16. 将大鼠置于清洁笼中，自由摄食和饮水ad libitum。
  17. 每12小时向腹腔内注射头孢呋辛（16 mg/kg）和布托啡诺（0.05 mg/kg），持续3天。

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结果

经过约10次尝试后，一名无显微外科训练背景的研究人员成功掌握了用于SHVC重建的磁性吻合技术。SHVC重建耗时少于2分钟。受体大鼠的无肝期约为10分钟。再灌注后1天、5天和30天，SHVC吻合部位未观察到血栓形成、出血或血管狭窄。移植术后2周行下腔静脉造影。如图所示 图6，磁环保持完整，经SHVC吻合处血流通畅。移植后存活率在第1天为95%，第3天为90%，第7至30天为85%（图7).

椭圆形垫片的制备；带尺寸标注的示意图及完成后的垫片照片（含比例尺）。

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讨论

许多肝脏移植领域的临床进展均可归功于动物研究。大鼠原位肝移植（OLT）是器官保存、移植免疫学、生理学及病理学研究中广泛使用且被普遍接受的模型。然而，该手术操作极为复杂，需要高超的显微外科技术。尽管大鼠OLT手术已有多项改进，但肝上下腔静脉（SHVC）吻合仍是一个具有挑战性的步骤。本文中，我们介绍一种用于大鼠OLT中SHVC重建的新型磁性吻合技术。该技术的应用使SHVC重建时间缩短至2分钟以内，大鼠OLT的无肝期缩短至约10分钟。我们认为，该技术在移植研究领域具有重要意义。

采用磁性吻合技术重建下肝静脉（SHVC）的关键步骤是将磁环分别固定在供体和受体的SHVC上。操作时应格外小心，避免扭转SHVC。此外，在连接两个磁环时，应彻底排除SHVC内的气泡。

该技术的应用存在一些局限性。某些大鼠品系，如Fischer-344大鼠和Buffalo大鼠，其肝上下腔静脉（SHVC）极短，无法在其SHVC上安装磁环，因此不适合使用该技术。然而，该技术可轻松应用于大多数大鼠品系的原位肝移植（OLT），包括Sprague Dawley大鼠、Lew...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了中国教育部创新团队发展计划（编号：IRT16R57）、国家自然科学基金（编号：81470896）以及西安交通大学青年人才引进计划研究基金（RW）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉机哈佛大学 台式动物麻醉
PLX7000B HF 移动式数字化 C 形臂系统Perlong MedicalPLX7000B主要用于各种手术的血管造影和摄影
注射泵迈瑞BeneFusion SP5静脉输注
异氟烷RWD生命科学有限公司麻醉剂：用于麻醉的诱导和维持
碘海醇上海通用制药有限公司 血管内对比剂  
肝素钠注射液SPH No.1 生化培养基 &制药有限公司  预防血栓形成 
头孢呋辛 葛兰素史克英国运营有限公司 一种抗生素
丁丙诺啡 TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd一种镇痛药
弯曲显微镊上海医疗器械（集团）有限公司W40350手术器械
止血钳（直型）上海医疗器械（集团）有限公司J31010手术器械
止血钳（弯型）上海医疗器械（集团）有限公司J31020手术器械
Satinsky钳上海医疗器械（集团）有限公司XEC050手术器械
持针器上海医疗器械（集团）有限公司J32010手术器械
微针贴片 holder上海医疗器械（集团）有限公司WBA040手术器械
带凹口镊子上海医疗器械（集团）有限公司J42010手术器械
带钩组织镊上海医疗器械（集团）有限公司J41010手术器械
组织剪上海医疗器械（集团）有限公司Y00040手术器械
手术剪上海医疗器械（集团）有限公司Y00030手术器械
微型剪刀上海医疗器械（集团）有限公司MR-S121T手术器械
微血管夹上海医疗器械（集团）有限公司XEC240手术器械
直头显微镊（钛合金）上海医疗器械（集团）有限公司WCC010手术器械
弯曲显微镊  （钛合金）上海医疗器械（集团）有限公司WCC020手术器械

参考文献

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