Drosophila guttifera 蛹期分期方法及翅色素沉积测量

摘要

本文描述了Drosophila guttifera蛹期的分期方法以及翅部色素沉积的测量方案。蛹期的准确分期和色素沉积的定量分析为研究成体性状的发育机制提供了坚实基础，并可实现不同物种间性状发育的比较研究。

摘要

多种多样的果蝇属（Drosophila）物种为研究发育机制以及导致进化变化的遗传改变提供了机会。特别是成虫阶段具有丰富的形态特征，可用于种间比较，包括翅部色素沉着的比较。为了研究不同物种间的发育差异，需要进行细致的观察并采用准确的分期方法，以实现精确比较。本文描述了斑点果蝇 Drosophila guttifera 蛹期分期及翅部色素沉着量化的方法。首先，我们介绍了基于形态特征进行详细形态学观察并定义蛹期阶段的方法，该方法包括去除蛹壳的技术——蛹壳是蛹体外层的几丁质外壳，去除后可实现对蛹体形态的细致观察。其次，我们介绍了测定所定义蛹期各阶段持续时间的方法。最后，我们介绍了基于数字图像和 ImageJ 软件进行图像分析的翅部色素沉着量化方法。通过这些方法，我们可以为比较蛹期成体性状的发育过程建立坚实的基础。

引言

Drosophila 的某些形态特征在不同物种之间存在差异^1,2,3,4,5。我们可以通过比较这些形态结构的形成机制，来探究形态多样性是如何产生的。这类形态结构的例子包括幼虫刚毛、成虫性梳、外生殖器装置、腹部色素沉着以及翅部色素沉着^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}。为了研究成虫之间的形态差异，对蛹期的观察与分....

方案

1. 果蝇品系

1. 所有以下实验方案均使用 Drosophila guttifera。
2. 保种时使用塑料小瓶（直径 25 mm × 高 96 mm）和纤维素塞（直径 23 mm × 高 26 mm）。使用标准的玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基，并参考已发表文献中描述的该物种其他三种替代配方²。
   注意：D. guttifera（保种编号 15130-1971.10）由加利福尼亚大学圣迭戈分校的果蝇物种保种中心提供。尽管 D. guttifera 属于 immigrans-tripunctata 辐射进化支，在属内与 D. melanogaster 亲缘关系较远²³，但它在许多生物学特性上与 D. melanogaster 相似。因此，本实验方案可适用于多种 Drosophila 物种，尽管某些物种可能需要特定的培养基和/或特殊技术手段来维持种群²。

2. 蛹的观察及蛹期阶段的界定

注意：用于观察的蛹取自在25 °C、12:12小时光暗循环条件下维持培养的果蝇品系。Bainbridge....

结果

蛹期 D. guttifera 分为17个阶段（P1 - P15(ii)）；展示了三个代表性阶段（P1、P5 - 6、P10）的图像 图3，所有17个阶段均有图示说明 图4）。尽管 Bainbridge 和 Bownes¹⁷ 识别出20个阶段 D. melanogaster，其中某些阶段无法应用于 D. guttifera两个发育事件的顺序，即黄色体（中肠内脱落细胞团）的出现²⁶）以及马氏管变绿的时间，并未受到严格控制 D. guttifera，因此我们无法区分P5(i)、P5(ii)和P6。此外，与 D. melanogaster，胸腹部刚毛变黑的时间是同步的，因此我们无法区分P11(i)和P11(ii)¹⁹.

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讨论

本文介绍了定义蛹期阶段、去除蛹壳以进行详细观察、测量蛹期持续时间以及测定 D. guttifera 翅膀上黑斑强度的实验方案。这些方案可应用于多种 Drosophila 及相关蝇类物种，尤其是具有翅色素沉着的物种。

对更详细的发育事件进行深入观察和描述，将能够进一步细分发育阶段。在许多情况下，需要解剖或切片蛹才能观察到的发育事件不适合用于定义阶段，因为对蛹进行分期需要将其杀死，从而难以继续利用该个体。对于新种 Drosophila 的研究，应首先选用可通过蛹壳外部观察区分的发育事件作为分期依据。根据研究目的，可进一步基于特定的器官发生或其他发育事件对阶段进行细分。

在对多个发育阶段进行种间比较时，一个潜在的困难是不同物种间发育事件顺序可能发生颠倒（异时性²⁷）。例如，在 D. melanogaster 中，马氏管先变为绿色，随后黄体开始可见；而在某些 D. guttifera 蛹中，这一顺序.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Drosophila guttifera	加州大学圣地亚哥分校果蝇物种保种中心	15130-1971.10	Drosophila guttifera一种在本文中使用的果蝇物种
塑料离心管	高科技	MKC-30	用于果蝇品系保种的塑料小瓶
嗡嗡声检测玻璃小瓶和瓶盖的密封性	Fisher Scientific	AS-271	用于果蝇品系保种的纤维素塞
白色软糖	三井制糖	J-500g	白色软质糖，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基
玉米粉	日本制粉株式会社	F	玉米粉，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基
玉米粗粉 - C	日本制粉株式会社	GC	玉米粗粉 - C，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基
琼脂粉	松木寒天产业	602号	琼脂粉，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基
干啤酒酵母	Asahi Food &和医疗保健	Y2A	干啤酒酵母，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基
对羟基苯甲酸丁酯	Nacalai Tesque	06327-02	对羟基苯甲酸丁酯，用于标准玉米粉/蔗糖/酵母/琼脂培养基
乙醇	和光	057-00456	乙醇，用于标准玉米粉/蔗糖/酵母/琼脂培养基
平底微量离心管	Ina Optica	CF-0150	1.5 mL 微量离心管，用于收集蛹
CAPSULEFUGE	Tomy	PMC-060	迷你微型离心机，用于收集蛹
无菌Schale NB培养皿	三生医药	01-013	塑料培养皿（直径 90 mm × 高度 15 mm）
血清管架	岩木	9796-050	用作观察蛹的保湿培养室
康宁Falcon易握式组织培养皿	康宁	353001	塑料培养皿（直径 35 mm × 高度 10 mm）
Falcon 标准组织培养皿	康宁	353002	塑料培养皿（直径 60 mm × 高度 15 mm）
图钉	Kokuyo	51233709	推针，用于在微量离心管盖上制作针孔
体视显微镜	Olympus	SZX16	体视显微镜，用于形态学观察
数码相机	Olympus	DSE-330-A	数码相机，用于成像
NICETACK 双面胶带	Nichiban	NW-15SF	双面胶带，用于去除蛹壳
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20	镊子，用于移除蛹壳
Van Gogh VISUAL 画笔	Talens Japan	GWVR-#5/0	画笔，用于去除蛹壳
Greiner CELLSTAR 12孔细胞培养板	默克	665-180	12孔细胞培养板，用于测量蛹期持续时间
NaCl	和光	191-01665	NaCl，用于 PBS
KCl	Nacalai Tesque	285-14	KCl，用于 PBS
Na2HPO4·12H2O	和光	196-02835	Na2HPO4·12H2O，用于 PBS
KH2PO4	Nacalai Tesque	28721-55	KH2PO4，用于 PBS
阶梯式中性密度（ND）滤光片 0.04 - 3.0	Edmund Optics	64-384	用于色素沉着测量校准的阶梯密度滤光片
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	1.8.0-101	ImageJ 软件，用于测量翅膀上黑斑的强度（https://imagej.nih.gov）
FINE FROST 玻片	Matsunami Glass Ind	FF-001	载玻片，用于测量翅上黑斑的强度
18 x 18 方形显微镜盖玻片	Matsunami Glass Ind	C018181	盖玻片，用于测量翅上黑斑的强度