本文描述了Drosophila guttifera蛹期的分期方法以及翅部色素沉积的测量方案。蛹期的准确分期和色素沉积的定量分析为研究成体性状的发育机制提供了坚实基础，并可实现不同物种间性状发育的比较研究。
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摘要
摘要
多种多样的果蝇属（Drosophila）物种为研究发育机制以及导致进化变化的遗传改变提供了机会。特别是成虫阶段具有丰富的形态特征，可用于种间比较，包括翅部色素沉着的比较。为了研究不同物种间的发育差异，需要进行细致的观察并采用准确的分期方法，以实现精确比较。本文描述了斑点果蝇 Drosophila guttifera 蛹期分期及翅部色素沉着量化的方法。首先，我们介绍了基于形态特征进行详细形态学观察并定义蛹期阶段的方法，该方法包括去除蛹壳的技术——蛹壳是蛹体外层的几丁质外壳，去除后可实现对蛹体形态的细致观察。其次，我们介绍了测定所定义蛹期各阶段持续时间的方法。最后，我们介绍了基于数字图像和 ImageJ 软件进行图像分析的翅部色素沉着量化方法。通过这些方法，我们可以为比较蛹期成体性状的发育过程建立坚实的基础。
引言
Drosophila 的某些形态特征在不同物种之间存在差异1,2,3,4,5。我们可以通过比较这些形态结构的形成机制，来探究形态多样性是如何产生的。这类形态结构的例子包括幼虫刚毛、成虫性梳、外生殖器装置、腹部色素沉着以及翅部色素沉着6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。为了研究成虫之间的形态差异，对蛹期的观察与分析至关重要，因为成虫特征的命运在晚期幼虫阶段即已确定，随后的形态发生过程则在蛹期进行。
发育生物学研究中 黑腹果蝇, "小时后成虫羽化" （成蛹后小时数）是表示蛹期的常用方法16该系统采用蛹形成后的绝对时间，便于常规实验操作。然而，不同蛹之间的发育速度可能存在差异，并受轻微的遗传、表观遗传或微环境差异的影响，因此即使蛹形成后的绝对时间相同，也不能保证其处于相同的发育阶段。在多数情况下，基于形态特征定义的发育阶段更适合用于多个个体间的比较。特别是物种间的比较，需要在精确的、相互对应的（同源）发育阶段之间进行。
贝恩布里奇和布朗斯17 根据形态特征识别出20个蛹期阶段（P1至P15(ii)） 黑腹果蝇 蛹。该分期系统是目前最广泛使用的形态发育分期体系18在之前的一项研究中，我们进行了蛹期分期 Drosophila guttifera 为翅部色素沉着研究奠定基础19. D. guttifera 翅膀上具有黑色圆点图案，是研究翅色素形成机制的模式物种之一20尽管我们参考了Bainbridge和Bownes研究中描述的形态学标准17我们通过连续观察直接测量了各阶段持续时间19，而不是采用Bainbridge和Bownes根据观察频率估算的时期持续时间。本文描述了蛹期分期的方法以及蛹各发育阶段持续时间的测定方法 果蝇 用于福光（Fukutomi）实验中 等19.
为了研究翅部色素沉着的发育机制，我们需要了解色素沉着发生在蛹期或成虫期的哪个阶段。Fukutomi et al.19 通过翅图像的图像分析，量化了蛹期和成虫期色素沉着的光密度（OD）。人们认为，Drosophila 翅部的色素沉着是由黑色素的积累引起的21。在量化光密度时，使用了灰度图像和 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）22。为了识别并量化特定斑点的色素沉着（ΔOD），我们用斑点内部的光密度减去斑点外部的光密度。为了使该方法具有可重复性和客观性，应利用翅脉作为解剖标志来确定光密度的测量位置。本文详细描述了在 Drosophila guttifera 中量化翅部色素沉着的方法。
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方案
1. 果蝇品系
- 所有以下实验方案均使用 Drosophila guttifera。
- 保种时使用塑料小瓶（直径 25 mm × 高 96 mm）和纤维素塞（直径 23 mm × 高 26 mm）。使用标准的玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基，并参考已发表文献中描述的该物种其他三种替代配方2。
注意：D. guttifera（保种编号 15130-1971.10）由加利福尼亚大学圣迭戈分校的果蝇物种保种中心提供。尽管 D. guttifera 属于 immigrans-tripunctata 辐射进化支，在属内与 D. melanogaster 亲缘关系较远23，但它在许多生物学特性上与 D. melanogaster 相似。因此，本实验方案可适用于多种 Drosophila 物种，尽管某些物种可能需要特定的培养基和/或特殊技术手段来维持种群2。
2. 蛹的观察及蛹期阶段的界定
注意：用于观察的蛹取自在25 °C、12:12小时光暗循环条件下维持培养的果蝇品系。Bainbridge 和 Bownes17 描述了一种将黑腹果蝇（D. melanogaster）蛹从原始化蛹位置转移到湿润滤纸上的低风险方法（转移的946个蛹中存活率达97%）。D. guttifera 蛹可采用基本相同的方法进行制备。
- 放置健康的成年个体 果蝇 在塑料小瓶（直径 25 mm × 高 96 mm）中的新鲜食物（标准玉米粉/蔗糖/酵母/琼脂培养基）上放置果蝇，让其产卵。等待 7 天以获得晚期三龄幼虫。
- 将1 mL标准玉米粉/蔗糖/酵母/琼脂培养基放入每个1.5 mL微量离心管中。使用图钉在微量离心管盖上刺出3个针孔，孔间距为2 mm，以利于通气。
- 在微型离心机中以860 × g离心含有食物的微量管7秒。
- 倒置并轻敲小瓶，以移除瓶内所有成虫。
- 加入 5 - 10 mL 去离子水2将 O（或反渗透水）加入小瓶中。
- 将幼虫随水倒入塑料培养皿（直径90 mm × 高度15 mm）中。根据其较大的体型（体长3 - 4 mm）鉴定三龄末期幼虫。
- 用镊子将晚期三龄幼虫轻轻转移至含有食物的微量管中（每管10只幼虫），在25 °C下过夜培养。
- 将新形成的蛹转移至经ddH₂O润湿的滤纸片上2O，并置于一个塑料培养皿（直径 35 mm × 高度 10 mm）中。
- 将培养皿置于湿润的培养盒中（内含 10 mL ddH₂O）2在底部，等待蛹发育至所需阶段。
- 将蛹移至塑料培养皿（直径60 mm × 高度15 mm）中湿润的滤纸上。
注意：阶段的定义主要可依据各阶段的特征进行划分 D. melanogaster17通常，蛹期的 果蝇 可分为 P1 至 P15(ii) 阶段，但具体分期定义可能需根据所用物种进行适当调整。若条件允许，去除蛹壳可实现精确且细致的观察。详见下文（步骤 3）。 - 在体视显微镜下观察蛹，使用连接体视显微镜的数码相机进行拍照。
3. 去除蛹壳
注意：Drosophila（果蝇）的蛹被一种称为蛹壳（puparium）的结构包裹。双翅目蝇类（Muscomorpha）昆虫在化蛹时不会蜕去幼虫期的角质层；相反，在脱皮（apolysis）之后，其幼虫角质层会硬化，并作为蛹的保护性外壳，即蛹壳24。位于蛹壳内的蛹具有真正的蛹期角质层，该角质层非常柔软且脆弱。在P4(ii)期脱皮发生之前，上皮组织与蛹壳是紧密附着的，因此在此阶段无损伤地去除蛹壳极为困难。而在P5期之后，虽然去除蛹壳较为费力，但对于形态学观察及蛹期阶段的界定仍具有重要意义。具体操作步骤如下。
- 将一片双面胶带贴在一张纸巾上。
- 将一只蛹腹面朝上放置在双面胶带上（图1A）。
- 找到蛹壳前端与内部蛹体之间的缝隙。用镊子夹住并从此处开始移除蛹壳，暴露蛹头部的前端。
- 将镊子尖端沿前后轴方向平行插入，然后上抬镊子尖端，局部撬破蛹壳。重复此操作，直至破裂延伸至蛹壳后端。确保蛹壳与蛹的足之间也形成间隙，并打破蛹壳腹侧，同时尽量减少对内部蛹体的损伤（图1B）。
- 尽可能将蛹壳破碎后，使用细毛笔（#5/0）取出蛹体（图1C）。
- 将蛹置于已用ddH2O润湿并放置于塑料培养皿（直径60 mm × 高15 mm）中的滤纸上。应尽快拍照，因为暴露的蛹较为脆弱，容易失水干燥。
注意：无蛹壳的蛹不适用于蛹期持续时间的测量（步骤4），因为应激（如干燥）和物理损伤可能干扰其正常发育。
4. 测量蛹期持续时间
- 按照步骤2所述方法准备用于测量蛹期持续时间的蛹。收集化蛹后1-2天、2-3天和3-4天的蛹（每组20只）。为每只蛹分配独立的编号（1-60），以便识别。在后续操作过程中继续收集新形成的蛹，以获得额外20只年轻的蛹，并为这些新形成的蛹分配独立编号（61-80）。将一只蛹放置于12孔细胞培养板的一个孔（3.9 cm2）内湿润的去离子水（ddH2O）浸湿的滤纸片上（每孔1只蛹，每板12只蛹）。在板孔之间的空隙中加入去离子水（ddH2O）以维持湿度，盖上盖子，将培养板置于25 °C、持续光照（24:0 h 光/暗）条件下。
注意：无蛹壳（puparium）的蛹不适合用于测量蛹期持续时间。请勿去除蛹壳。 - 每30分钟观察所有蛹的形态特征，包括体色、刚毛、马氏管和黄体，并在记录表中记录所观察到的发育阶段（P1 - P15(ii)，依据参考文献17,19）。
- 由三名（或更多）人员轮班，连续记录四整天（96小时）。
- 统计每个特定阶段的记录次数，并计算其平均值（观察次数总和 / 蛹数），然后乘以0.5（h），得到各阶段持续时间的估计值（小时）。
5. 翅膀上黑斑强度的测量
注意：可通过测量光学密度（OD）来量化蛹或成虫翅膀上黑斑的强度。使用已知OD值的玻璃滤光片（阶梯密度滤光片）进行校准25，从而能够从翅膀的数字图像中计算特定区域的OD值。分别测量斑点区域内的OD值和斑点区域外的OD值，后者从前者中减去，得到斑点的强度（ΔOD）。本文描述了进行解剖、测量和计算ΔOD的方法。该步骤可在完成步骤2后独立于步骤3和步骤4进行。一旦完成步骤2并掌握所有蛹期发育阶段，即可直接开始或重复步骤5。
- 图像准备
- 按照步骤2所述方法准备一个目标发育阶段的新蛹。用镊子去除蛹壳的前部，用镊子取出蛹体，放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS，表2）的塑料培养皿中（直径35 mm × 高度10 mm）。
- 剪下翅的基节（基节是翅近端较窄的部分）。由于翅呈折叠状态，将其放入盛有ddH2O的塑料培养皿（直径35 mm × 高度10 mm）中，利用渗透压使其展开（翅会自行展开）。
- 每隔10分钟从保种管中收集一次新羽化的成虫。使用CO2麻醉垫对果蝇进行CO2麻醉，通过观察其不动确认麻醉成功，然后剪下翅的基节。
- 在载玻片上滴加10 µL PBS，将翅置于液滴中，加盖盖玻片（18 mm × 18 mm）。
- 打开体视显微镜的光源，将光强调至最大。将物镜倍数设为11.5X，光圈调至最开放状态。打开相机，将相机设置为（ISO：100，模式SHQ 3136 × 2352像素，快门速度：1/20 s）。通过调节显微镜的调焦旋钮对样本进行对焦。
- 按下遥控器的快门按钮拍摄图像。每片翅拍摄3张图像，每张图像必须分别以杯状感器、纵脉端点或后横脉为中心，且翅的远端位于左侧，翅的前端位于上方。
- 校准
- 使用与拍摄翅图像相同的相机设置，拍摄阶梯密度滤光片的9个部分的图像。
- 启动ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）22。
- 点击 文件 | 打开 |，选择一张阶梯密度滤光片的图像。
- 点击 图像 | 类型 | 8位 |，将图像转换为8位图像。
- 点击 编辑 | 选择 | 指定 |，勾选 椭圆 和 居中 选项。在 宽度 栏中输入100（像素），在 高度 栏中输入100（像素），在 X坐标 栏中输入1568，在 Y坐标 栏中输入1176，点击 确定。
- 点击 分析 | 测量|。所选区域的"平均灰度值"将被测量。
- 对剩余的8张图像重复步骤5.2.3至5.2.6。
- 点击 分析 | 校准，在 函数 栏中选择 Rodbard25，并在中间右侧栏中输入以下数值（0.04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408；这些数值取决于阶梯密度滤光片的密度）。
- 勾选 全局校准 选项，点击 确定。
注：通过此操作，"平均灰度值"将使用Rodbard函数转换为"光密度（OD）"。完成此步骤后，可在ImageJ软件中对特定选定区域计算光密度。
- 选择测量区域
注：斑点通常与某些标志点相关，例如杯状感器、纵脉末端和横脉。这些及其他翅上的标志点可用于确定测量区域。此处以D. guttifera为例（图2）进行说明。- 点A（杯状感器斑点）的定义
- 打开一张杯状感器斑点位于图像中心的图像。点击 图像 | 类型 | 8位 |，将图像转换为8位图像。
- 在 区域选择工具 中点击 矩形 并绘制一个矩形。将矩形的左上顶点设置在第三纵脉后缘线上，并位于杯状感器斑点的远端方向。将矩形的右侧设置在杯状感器斑点的右侧。
- 点击 编辑 | 选择 | 添加到管理器 |。勾选 显示全部 选项。
- 在 线段选择工具 中点击 角度工具。在第三纵脉后缘线上绘制第一条线，将该线的左端点设置在步骤1中绘制的矩形的顶点上。在矩形的上边绘制第二条线。按下"m"键以测量这两条线之间的夹角。点击计算机屏幕上的图像窗口。
- 点击 编辑 | 选择 | 添加到管理器 |。
- 在 区域选择工具 中点击 矩形，绘制一个大小约为图像窗口1/9的矩形。点击 编辑 | 选择 | 旋转 |。在 角度 栏中输入步骤5.3.1.4测得角度的负值，点击 确定 以旋转本步骤绘制的矩形。
- 使用方向键移动步骤5.3.1.6中绘制的矩形。将第二纵脉后缘线的端点置于矩形左侧，矩形下边与第三纵脉后缘线相接。确认在此过程中绘制了从第二纵脉端点到第三纵脉后缘线的垂线。将该垂线的垂足定义为点A（图2A）。
- 当光标置于点A时，记录位于 区域选择工具 下方显示的点A的x坐标和y坐标。
- 点B（纵脉末端斑点）的定义
- 打开一张纵脉末端斑点位于图像中心的图像。点击 图像 | 类型 | 8位 | ，将图像转换为8位图像。
- 重复步骤5.3.1（点A，杯状感器斑点的定义）中的相同操作，在图像中确定点A。
- 点击 编辑 | 选择 | 添加到管理器 |。
- 在 区域选择工具 中点击 矩形 并绘制一个矩形。将矩形的左上顶点设置在第三纵脉后缘线的端点处。
- 点击 编辑 | 选择 | 添加到管理器 |。
- 在 线段选择工具 中点击 角度工具。绘制第一条线连接点A和第三纵脉后缘线的端点，将此线定义为线A。在步骤5.3.2.4中绘制的矩形的上边绘制第二条线。按下"m"键以测量两条线之间的夹角。
- 点击 编辑 | 选择 | 添加到管理器 |。
- 在 区域选择工具 中点击 矩形，绘制一个大小约为图像窗口1/9的矩形。点击 编辑 | 选择 | 旋转 |。在 角度 栏中输入步骤5.3.2.6测得角度的负值，点击 确定 以旋转本步骤绘制的矩形。使用方向键移动矩形，使其上边与线A相接，第四纵脉前缘线的端点位于矩形左侧。
- 点击 编辑 | 选择 | 添加到管理器 |。
- 在 区域选择工具 中点击 矩形，绘制一个大小约为图像窗口1/9的矩形。点击 编辑 | 选择 | 旋转 |。在 角度 栏中输入步骤6测得角度的负值，点击 确定 以旋转本步骤绘制的矩形。使用方向键移动矩形，使其左下顶点与步骤5.3.2.8中绘制的矩形的左上顶点重合，从而获得从第四纵脉前缘线端点到线A的垂线。将该垂线与第三纵脉后缘线的交点定义为点B（图2B）。
- 当光标置于点B时，记录位于 区域选择工具 下方显示的点B的x坐标和y坐标。
- 点C（后横脉斑点）的定义
- 打开一张后横脉斑点位于图像中心的图像。点击 图像 | 类型 | 8位 | ，将图像转换为8位图像。
- 将点C定义为后横脉与第四纵脉交界区域中第四纵脉前缘线的最远端点（图2C）。
- 当光标置于点C时，记录位于 区域选择工具 下方显示的点C的x坐标和y坐标。
- 点D（对照区域）的定义
- 打开一张杯状感器斑点位于图像中心的图像。点击 图像 | 类型 | 8位 |，将图像转换为8位图像。
- 在 线段选择工具 中点击 直线，绘制一条连接第二纵脉前缘线端点与第四纵脉后缘线端点的线。将点D定义为该线与第三纵脉后缘线的交点（图2D）。
- 当光标置于点D时，记录位于 区域选择工具 下方显示的点D的x坐标和y坐标。
- 点A（杯状感器斑点）的定义
- 测量
- 打开一张翅斑图像（测量点A时，打开点A位于中心的图像）。点击 图像 | 类型 | 8位 |，将图像转换为8位图像。
- 在 区域选择工具 中点击 矩形，绘制一个大小约为图像窗口1/9的矩形。
- 点击 编辑 | 选择 | 指定 |。勾选 椭圆 和 居中 选项。在 宽度 和 高度 栏中均输入100（像素），在 X坐标 栏中输入点A（或点B或点C）和点D的x坐标，在 Y坐标 栏中输入点A（或点B或点C）和点D的y坐标。点击 确定。
- 点击 分析 | 测量 |。若步骤5.2所述的校准已完成，则OD值将显示在 平均 栏中。
- 通过将点A、B、C的OD值减去点D的OD值，计算ΔOD值。
注：点D位于翅的透明区域，不含色素沉着，因此适合作为背景对照。
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结果
蛹期 D. guttifera 分为17个阶段（P1 - P15(ii)）；展示了三个代表性阶段（P1、P5 - 6、P10）的图像 图3，所有17个阶段均有图示说明 图4）。尽管 Bainbridge 和 Bownes17 识别出20个阶段 D. melanogaster，其中某些阶段无法应用于 D. guttifera两个发育事件的顺序，即黄色体（中肠内脱落细胞团）的出现26）以及马氏管变绿的时间，并未受到严格控制 D. guttifera，因此我们无法区分P5(i)、P5(ii)和P6。此外，与 D. melanogaster，胸腹部刚毛变黑的时间是同步的，因此我们无法区分P11(i)和P11(ii)19.
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讨论
本文介绍了定义蛹期阶段、去除蛹壳以进行详细观察、测量蛹期持续时间以及测定 D. guttifera 翅膀上黑斑强度的实验方案。这些方案可应用于多种 Drosophila 及相关蝇类物种，尤其是具有翅色素沉着的物种。
对更详细的发育事件进行深入观察和描述，将能够进一步细分发育阶段。在许多情况下，需要解剖或切片蛹才能观察到的发育事件不适合用于定义阶段，因为对蛹进行分期需要将其杀死，从而难以继续利用该个体。对于新种 Drosophila 的研究，应首先选用可通过蛹壳外部观察区分的发育事件作为分期依据。根据研究目的，可进一步基于特定的器官发生或其他发育事件对阶段进行细分。
在对多个发育阶段进行种间比较时，一个潜在的困难是不同物种间发育事件顺序可能发生颠倒（异时性27）。例如，在 D. melanogaster 中，马氏管先变为绿色，随后黄体开始可见；而在某些 D. guttifera 蛹中，这一顺序...
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致谢
感谢 Sean B. Carroll 和 Thomas Werner 提供果蝇品系，Naoyuki Fuse 提供设备，Byung Seok Jin 在拍摄过程中给予协助，Kiyokazu Agata 提供指导，以及 Elizabeth Nakajima 对英文稿件的编辑。本工作由 KAKENHI 17K19427 和武田科学振兴财团资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Drosophila guttifera | 加州大学圣地亚哥分校果蝇物种保种中心 | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera一种在本文中使用的果蝇物种 |
| 塑料离心管 | 高科技 | MKC-30 | 用于果蝇品系保种的塑料小瓶 |
| 嗡嗡声检测玻璃小瓶和瓶盖的密封性 | Fisher Scientific | AS-271 | 用于果蝇品系保种的纤维素塞 |
| 白色软糖 | 三井制糖 | J-500g | 白色软质糖，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基 |
| 玉米粉 | 日本制粉株式会社 | F | 玉米粉，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基 |
| 玉米粗粉 - C | 日本制粉株式会社 | GC | 玉米粗粉 - C，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基 |
| 琼脂粉 | 松木寒天产业 | 602号 | 琼脂粉，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基 |
| 干啤酒酵母 | Asahi Food &和医疗保健 | Y2A | 干啤酒酵母，用于标准玉米粉/糖/酵母/琼脂培养基 |
| 对羟基苯甲酸丁酯 | Nacalai Tesque | 06327-02 | 对羟基苯甲酸丁酯，用于标准玉米粉/蔗糖/酵母/琼脂培养基 |
| 乙醇 | 和光 | 057-00456 | 乙醇，用于标准玉米粉/蔗糖/酵母/琼脂培养基 |
| 平底微量离心管 | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL 微量离心管，用于收集蛹 |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | 迷你微型离心机，用于收集蛹 |
| 无菌Schale NB培养皿 | 三生医药 | 01-013 | 塑料培养皿（直径 90 mm × 高度 15 mm） |
| 血清管架 | 岩木 | 9796-050 | 用作观察蛹的保湿培养室 |
| 康宁Falcon易握式组织培养皿 | 康宁 | 353001 | 塑料培养皿（直径 35 mm × 高度 10 mm） |
| Falcon 标准组织培养皿 | 康宁 | 353002 | 塑料培养皿（直径 60 mm × 高度 15 mm） |
| 图钉 | Kokuyo | 51233709 | 推针，用于在微量离心管盖上制作针孔 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX16 | 体视显微镜，用于形态学观察 |
| 数码相机 | Olympus | DSE-330-A | 数码相机，用于成像 |
| NICETACK 双面胶带 | Nichiban | NW-15SF | 双面胶带，用于去除蛹壳 |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-20 | 镊子，用于移除蛹壳 |
| Van Gogh VISUAL 画笔 | Talens Japan | GWVR-#5/0 | 画笔，用于去除蛹壳 |
| Greiner CELLSTAR 12孔细胞培养板 | 默克 | 665-180 | 12孔细胞培养板，用于测量蛹期持续时间 |
| NaCl | 和光 | 191-01665 | NaCl，用于 PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl，用于 PBS |
| Na2HPO4·12H2O | 和光 | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O，用于 PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4，用于 PBS |
| 阶梯式中性密度（ND）滤光片 0.04 - 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | 用于色素沉着测量校准的阶梯密度滤光片 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | 1.8.0-101 | ImageJ 软件，用于测量翅膀上黑斑的强度（https://imagej.nih.gov） |
| FINE FROST 玻片 | Matsunami Glass Ind | FF-001 | 载玻片，用于测量翅上黑斑的强度 |
| 18 x 18 方形显微镜盖玻片 | Matsunami Glass Ind | C018181 | 盖玻片，用于测量翅上黑斑的强度 |
参考文献
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