用医用金属丝捕获循环肿瘤细胞的肿瘤细胞: 基于免疫荧光和 DNA 的3D 方法

ctc 代表癌细胞传播的一个关键步骤¹。他们的存在在患者的外周血与 (转移) 复发和疾病进展相关^2,3。CTC 从血液中分离和鉴定肿瘤患者是一种非侵入性液体活检。近年来, 越来越明显的是, 使用这种分析方法监测肿瘤对不同治疗的进展和反应, 提供了重要的临床信息^4,5。液体活检是更有用的, 当手术是不可行的, 或当原发肿瘤组织不可用,即, 为 non-biopsiable 病变。因此, 这种方法是有希望在特定的癌症的设置, 如转移性 NSCLC, 其中存在的 ctc 已经证明有一个负面的预后的作用⁶。NSCLC 是一种肿瘤, 特别是受益于靶向治疗方法^7,8,9 , 旨在对特定分子 (分子靶) 采取行动, 已知参与生长, 进展, 和疾病的传播。因此, 需要在疾病进展过程中检测特定的靶点。反恐委员会的调查是一个非常有趣的诊断方法, 以检测和监测药物的目标, 而无需主要或转移组织。例如, 在 NSCLC 细胞中检测易位基因, 与 crizotinib 的敏感性有关, 这是一种特定的靶向治疗¹⁰。然而, 目前, 易位的检测只在细针物或小活检上执行;因此, 没有肿瘤组织的分析是不可能的。ctc 是一个潜在的替代肿瘤组织调查, 并代表了一个非常有希望的同伴诊断方法。

尽管他们的潜在重要性, ctc 仍然是一个大争论的主题在研究之中, 主要由于他们的稀有 (1-10 细胞/毫升的外周血¹¹)。目前的液体活检方法使用有限的血量 (即, 1-30 毫升)^12,13, 但这会造成 ctc 检测的次优灵敏度的情况. 因此, 有必要研究寻找方法和开发用于在更大的外周血量上执行 CTC 靶向液体活检的装置。

另一种装置, 一种功能化的医用金属丝 (参见材料表), 已经开发来克服血液取样限制, 并获得更具代表性的 ctc 分析。这种功能化的电线是一个 CE 认证的医疗设备, 捕获 ctc 直接从血液中的癌症患者¹。它是由一个16厘米长的不锈钢线 (图 1a) 组成, 2 厘米长的功能性尖端涂有 0.2-µm 厚的金层。该层依次由1至5µm-厚羧酸水凝胶地层共价结合, 抗体针对 EpCAM, 其中最广泛表达的抗原的表面 ctc¹⁴。导线的官能化的末端被介绍入患者的胳膊的静脉并且保持在位置至少30分钟。这种方法允许隔离 ctc在体内,直接在外周血, 并筛选约 1.5-3.0 升的血液 (大约300倍以上的其他方法使用的体积)¹.

、 et al。证明了这种方法的效果, 将 ctc 直接分离到肺癌患者的臂静脉中¹⁵。他们进行了线免疫荧光染色识别 ctc 使用常规抗体针对 EpCAM 和泛角, CD45 白细胞检测。导线在光学荧光显微镜下被审查了¹⁵。作者证明, 该装置能够隔离 ctc, 但他们没有调查任何与治疗有关的目标, 如易位。

所提出的方法旨在根据型参数,例如, EpCAM 阳性和分子生物标志物的存在, 例如 ctc 的状态 (图 1b), 来识别 NSCLC 细胞系中的假定的不确定因素。这3天长的过程结合了功能化线和免疫荧光染色与 dna 荧光-原位杂交 (dna 鱼), 命名为免疫 dna 鱼。鉴于 ctc 是稀有的实体, 该协议的优点是, ctc 可以在同一条线上的型特征和 DNA 重的特点。

1. 2D 片上的免疫 DNA 鱼

1. 片制备及附着细胞播种
   注: 在无菌条件下, 在层流罩下执行以下所有步骤。
   1. 将片浸入100% 乙醇消毒。
      注: 我们使用 12 mm ×12 mm 硅胶支持的平方片 (所有试剂都列在材料表)。
   2. 将片放在培养皿中 (直径100毫米)。干燥使用强迫空气流动5分钟。
   3. 用15毫升无菌 1x Dulbecco 磷酸缓冲盐水 (PBS) 洗涤培养皿。
   4. 用10毫升完全介质清洗培养皿 (参见表 1)。
   5. 种子黏附细胞 (大约165万个细胞在10毫升媒介, 计数由外地资产管制系统分析) 通过轻轻地下降细胞悬浮到培养皿上获得均匀的细胞电镀 (大约3万细胞/cm²)。
      注: 对于 ~ 70% 汇合, 黏附细胞应该培养在片至少 48 h。
2. 固定和性
   注意: 丙酮是一种易燃易怒的挥发性物质。仅使用耐丙酮的塑料或玻璃容器 (无 PVC 或 PVDF)。
   注: 在化学油烟罩下执行这些步骤。
   1. 使用一次性吸气吸管去除培养基。
   2. 用 1x PBS 清洗培养皿。
   3. 使用镊子, 把它们浸入一个装有5毫升 1x PBS 的玻璃烧杯中, 清洗片。
   4. 把片在印迹纸上晾干。
   5. 在室温 (RT) 中浸泡成100% 丙酮溶液, 固定在片上的细胞。
   6. 用镊子除去片。干片使用强迫气流5分钟。
      注意: 在此点可以暂停协议。片应贮存在-20 ° c。
3. 免疫荧光日1
   注: 此阶段涉及一夜 (O/N) 孵化 (约16小时)。
   1. 两次洗 1x PBS 的片。
   2. 将100µL 的抗体稀释缓冲液 (详见表 1 ) 放到片上, 在 RT 处孵育30分钟。
      注: 解决方案体积应根据片表面进行调整, 以覆盖整个片, 避免溢出风险。
   3. 准备抗体混合 (表 1) 使用1:20 稀释的单克隆主抗体共轭荧光和抗体稀释缓冲, 在数据表中指定的制造商提供。
      注意: 强烈建议使用与耐热荧光共轭的单克隆抗体。如果使用的是 non-thermostable 荧光, 则在该协议的 DNA 鱼步骤中利用的温度可能会破坏荧光和熄灭荧光的排放。在这个协议中, 我们选择了一个 EpCAM-FITC 抗体 (1:20 稀释), 它没有显示任何显着的问题与使用的温度。
   4. 在 1x PBS 中冲洗两次片。
   5. 将片细胞侧放在潮湿的室内, 在片上放置100µL 的抗体混合。
      注: 溶液体积应根据片表面进行调整, 以覆盖整个片, 减少溢流的风险。
   6. 在4° c 的黑暗中孵育 O/N (约16小时)。
4. 免疫荧光日2
   1. 1x PBS 片两次冲洗, 阻断抗体培养。
      注: 将片浸泡在100µL 的 1x PBS 中, 在4° c 的室内, 在黑暗的潮湿环境中, 直到进行鱼化验。
5. 2D DNA-鱼日2
   警告: 必须特别注意仪器和潮湿室的高温。
   1. 建立杂交烤箱和干热烘箱 (在开始 DNA 鱼协议前3小时)。设置杂交烤箱在75° c, 设置干燥热烘箱在37° c 和冷却 0.4× ssc 解答 (pH 值 = 7.0 ± 0.1) (为 SSC 食谱参见表 1) 到4° c。
      注: 鱼类缓冲液的 ph 值非常重要: ph 值 = 7.0 ±0.1。
   2. 在 ice-cold 0.4× SSC 溶液中清洗片三次。
   3. 在一个化学油烟罩下片10分钟, 在黑暗中干燥。
   4. 漩涡为十年代和执行快速自旋下来 (在最大率) 探针从探针管的墙壁。
   5. 将片的细胞侧下降到5µL 的鱼探针上, 然后用橡胶水泥封住片的所有边缘。
      注意: 接下来的两个步骤涉及高温。戴上防护手套。
   6. 将滑块放入杂交烤箱中的深色湿润腔中, 在75° c 下进行8分钟的完全 DNA 变性。
   7. 将潮湿的房间移到37° c 的干热烘箱中。
6. 2D DNA-鱼日3
   1. 设置水浴在72° c 和放置一个滑动染色罐与 0.4× SSC 缓冲入它 (表 1)。30分钟后, 检查 0.4× SSC 缓冲器的温度, 必须在72±1° c。
   2. 准备两个玻璃烧杯: 一个与 2x SSC + 0.05% 补间缓冲 (pH = 7.0 ± 0.1) (表 1) 和第二个与蒸馏水。
   3. 从烤箱中取出潮湿的房间, 小心地从滑梯上取下橡胶水泥, 用镊子将片分离。
   4. 洗涤片通过浸泡在 0.4× SSC 2 分钟在72° c。
   5. 洗片通过浸泡在 2x SSC + 0.05% 补间缓冲三十年代。
   6. 用蒸馏水冲洗片。
   7. 在一个化学油烟罩下片10分钟, 在黑暗中干燥。
   8. 将片装在液体安装介质中, 用1.5 µg/毫升的 4´, 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 到 counterstain 总 DNA。将片细胞侧向下放置在一张幻灯片上的5µL 安装介质上, 按片上的镊子以获得空气, 并用指甲油密封。
      注: 安装介质容积应根据片表面尺寸进行调整。
7. 2D 显微镜观察与分析
   注: 图像可以用不同的显微镜系统获取。

1. 使用12位数码相机和 20×/0.50 na 和 40×/0.65 na 目标获取图像, 用适当的滤镜进行红色 (激发: 599 毫微米, 放射: 588 毫微米), 绿色 (励磁: 509, 放射: 524) 和蓝色 (励磁: 367 毫微米, 放射: 452 毫微米) 探针。
2. 使用软件选择工具分析图像。
   注意: 为了评价免疫荧光染色和测向探针的定位, 我们采用了 ImageJ。幻灯片可以在-20 ° c 的黑暗中储存3周。对于长时间存储, 我们建议使用特定的安装介质进行长期存储。

2. 电线上的免疫 DNA 鱼

1. 线 spike-in (3D 支持)
   注: 初步设置包括基于 EpCAM 阳性的黏附细胞线的准确选择。该导线是功能化的抗 EpCAM 抗体, 使只有 EpCAM 阳性细胞染色。
   注意: 请勿触摸导线的功能化部分以避免损坏。
   注: 所有步骤应在无菌条件下的层流罩下进行。
   1. 用4毫升完全培养基重5毫升瓶中的 T75 烧瓶 (80% 汇合) 的全部内容;对于一个单一的 spike-in, 约200万细胞被推荐最大化细胞粘附在电线。
   2. 从玻璃包装上取下电线。
   3. 将金属丝的功能性黄金部分浸入小瓶中, 确保钢丝塞子是一个水密适合的瓶子。密封与实验室膜。
      注: 建议使用5毫升管, 以便在铁丝瓶塞和瓶子之间进行正确的匹配。
   4. 在试管转子 (0-120 角) 的 RT 中孵育30分钟。
   5. 使用3不同的清洁小瓶, 在 1x PBS 溶液中冲洗三次金属丝。
2. 固定和性
   注意: 丙酮是一种可刺激呼吸道的易燃物质。只使用耐丙酮塑料或玻璃容器 (无 PVC 或 PVDF)。
   注: 在化学油烟罩下执行这些步骤。
   1. 空气干燥的电线。
   2. 通过蘸在丙酮100% 溶液中的丝在 RT 10 分钟来固定细胞. 使用5毫升管。
      注意: 线塞不能与定影液接触。
   3. 空气干燥的电线在 RT 5 分钟。
      注意: 协议可以在此处暂停。电线必须储存在-20 ° c。当为长期储存的电线包装, 放置在功能化的尖端旁边的电线塞子, 小心地插入到存储玻璃管的电线, 注意不要损坏功能化的提示。在-20 ° c 下关闭存储玻璃和存储 (垂直或水平)。
3. 免疫荧光日1
   注: 此阶段涉及一个 O/N 孵化 (约16小时)。
   1. 使用5毫升管冲洗两次 1x PBS 溶液。
   2. 用5毫升管在 RT 中孵育抗体稀释缓冲液30分钟。
   3. 根据数据表中的规定, 在抗体稀释缓冲液中制备150µL 抗体混合物, 并将其与荧光结合的单克隆主抗体稀释。例如, EpCAM-FITC 抗体被用于1:20 稀释。
   4. 使用 p200 提示进行孵化, 如下所示: 从丝塞中抽出导线, 然后通过尖端的大孔轻轻地插入导线。先插入 unfunctionalized 端, 然后慢慢将导线穿过较小的孔, 直到黄金部分刚好超出较大的孔。
   5. 轻轻滴150µL 抗体混合 (例如抗 EpCAM_FITC 抗体1:20 稀释) 到提示。为了避免气泡形成的风险, 轻轻地旋转导线, 直到官能化部分完全暴跌。
   6. 封住小费的洞。环绕实验室膜的孔可以帮助。
   7. 在4° c 下, 在黑暗中垂直孵育 O/N (约16小时)。
4. 免疫荧光日2
   1. 通过在 1x PBS 中洗两次丝来阻断抗体的孵化。
   2. 将导线重新插入钢丝塞。
      注意: 在4° c 的5毫升的小瓶中储存 1X PBS, 直到进行鱼化验。
5. 3D DNA-鱼日2
   警告: 必须特别注意仪器和潮湿室的高温。
   1. 建立杂交烤箱和干热烘箱 (在开始 DNA 鱼协议前3小时)。设置杂交烤箱在75° c, 设置干燥热烘箱在37° c, 并且冷却 0.4× SSC 解答 (pH 值 = 7.0 ± 0.1) 到4° c。
      注: 鱼类缓冲液的 pH 值非常重要, 必须为7.0 ±0.1。
   2. 在 ice-cold 0.4× SSC 溶液中清洗3次导线。
      注意: 在下列过程中, 保持电线在黑暗中避免荧光漂白。
   3. 在通风柜下的黑暗中干10分钟。
   4. 漩涡和旋转探针 5 s。
   5. 将探针的10µL 放到玻璃管内。盖上实验室胶片。
   6. 旋转管内如下: 将微在干燥的吸收剂中, 把纸放入50毫升的管子中, 然后简要地旋转。
   7. 小心地将干丝放入微, 并插入铁丝塞子。密封用橡胶水泥。
      注意: 接下来的两个步骤涉及高温。

使用上述步骤, 可以对 ctc (或其他等效细胞) 进行免疫-DNA 鱼的检测, 这是由官能化的金属丝所丰富的。在建立这个协议之前, 两种技术的相容性被确定 (免疫荧光与鱼) 在标准2D 支持。两个不同的 NSCLC 细胞线表达 EpCAM (需要坚持与抗体结合抗 EpCAM) 被选中。它们具有不同的状态, 这对测试不同的初始条件很有用。第一种, NCI-H1975, 有野生型 (重量) 与基因, 而第二, NCI-H3122, 是以易位为特征的。

采用了一种用于鱼检测的基因分离检测系统。该系统由两个探针, 一个 (橙色) 杂交到近端区域内的2p23 和一个 (绿色) 杂交远端到。在2D 支持, 免疫 DNA 鱼为抗体和探针提供了明确的信号 (图 2)。特别是, 两个细胞线显示明确的 EpCAM 膜定位。此外, 探针信号出现明亮和尖锐: NCI-H1975 细胞显示重叠的橙色和绿色探针, 确认野生的地位的基因 (图 2a, b)。相反, NCI-H3122 细胞显示重叠的信号和单一的绿点, 反映了一个删除的表达基因 (图 2c, d)。当免疫 DNA 鱼检测在3D 支持功能化线上进行时, 抗体和探针信号的定义一般少于2D 支持。EpCAM 染色可见。测向探测信号的定义较少, 但仍反映了预期的通信状态 (图 3)。结果表明, 免疫荧光染色不干扰 DNA 鱼的信号。探针专门与他们的目标杂交。NCI-H3122 细胞系显示出一个异常的, 与 NCI-H1975, 与野生类型的 "与" (图 3a) 的基因状态 (图 3b)。

图 1: 功能化导线、与分离探头的示意图排列、对重排的预期模式和特殊持有者的方案.(a) 红色方框突出显示线的三主要部分: 功能化的尖端、线塞和 un-functionalized 尖端。功能性的尖端是最微妙的部分, 在处理过程中必须不接触, 以避免细胞脱落或损害。(b) 绿色和红色探针分别与序列的上游和下游基因 (在左边) 的顺序绑定。在右边, 显示了 exemplificative 模式的安排。正常细胞上的红色和绿色共存信号;分离的绿色和红色信号表明, 一个与之有关的基因染色体断裂 (易位基因) 和一个绿色橙色的定位信号 (异常 cell-1)。一个红色信号和两个绿色信号表明一个红色信号的丢失, 提示染色体易位和删除 (异常 cell-2)。(c) 导线架;在显微镜分析过程中, 红色方框强调在处理导线时需要注意的部位。通过转动转子, 导线可以经受360°分析。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 基于2D 支持 (片) 的免疫 DNA 鱼检测.(a, b)NCI-H1975 细胞弱阳性的 EpCAM。EpCAM FITC 信号是可观的。在 NCIH1975 细胞系中, 与之分离的橙色和绿色探针重叠, 证实了该基因的重度状态。显示两个以上配对信号的细胞由于其倍而存在。(c, d)在高 EpCAM 表达的 NCIH3122 细胞系中, 免疫荧光信号是明亮的, 在细胞间的连接中更加突出。鱼分析证实了该基因的缺失, 这是典型的细胞系。红色箭头表示单绿色探针 (没有相应的橙色探针), 反映了对基因的删除。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3:免疫-DNA 鱼检测使用功能化金属丝作为3D 支持.(a) 线上 NCI-H1975 细胞的代表性图像。虽然在导线上的细胞的3D 形状很难获得充分对焦图像, EpCAM 信号是很好的可见的所有细胞。(b) 线上 NCI-H3122 细胞的代表性图像。与先前在2D 支持上看到的一样, 测向探针显示了基因缺失 (红色箭头)。可见的背景信号很可能是由于聚合物层的存在。然而, 它没有显着影响细胞识别或荧光分析。请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: 解决方案食谱。

作者声明他们没有竞争的金融利益。