从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。
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本文内容
摘要
摘要
在为癌症患者使用特定的分子靶向药物进行治疗前，确定肿瘤的突变状态至关重要。在临床实践中，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织被广泛用于基因检测。然而，福尔马林固定过程通常会导致DNA受损和片段化。因此，由于DNA质量和数量较低，FFPE样本有时并不适合进行基因检测。本文介绍一种触印细胞学（TIC）方法，用于从可在显微镜下观察到的癌细胞中获取基因组DNA。利用TIC样本可评估细胞形态及癌细胞数量。此外，从TIC样本中提取基因组DNA可在两天内完成。采用该方法获得的TIC DNA总量和质量均高于FFPE DNA。这种快速且简便的方法使研究人员能够获得高质量的DNA用于基因检测（例如，下一代测序分析、数字PCR和实时定量PCR），并缩短结果报告的周转时间。
引言
下一代测序技术为研究人员在遗传变异、孟德尔疾病、遗传易感性以及癌症等领域的基因组信息分析带来了显著进展1,2,3。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium, ICGC）已致力于识别多种常见癌症中的遗传改变4。数百个关键的癌症驱动基因已被成功鉴定，其中部分分子正作为药物研发的靶点1,5,6。
在临床环境中，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本常用于多种疾病（包括癌症）的病理诊断和分子检测。然而，在福尔马林固定过程中，会发生DNA-蛋白质或DNA-DNA交联，并导致DNA片段化。因此，由于DNA的质量和数量较低，FFPE DNA样本并不总是适用于遗传学分析7,8,
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方案
1. 使用普通载玻片进行快速显微评估的组织印片制备
- 在获得临床病理组织材料后，应尽快进行TIC制备。若无法立即制备TIC标本，需将组织材料用生理盐水浸湿的无菌纱布覆盖，并置于冰箱中保存，以防止组织干燥。
- 准备体积约为5 mm3的组织材料，例如通过手术或内镜临床获取的实体瘤（例如，肝、肺和乳腺组织）。
- 若组织表面血液较多，应用生理盐水润湿的无菌纱布轻轻擦拭组织表面，并去除血液。
- 对于活检等显微标本，应使用浸有生理盐水的无菌纱布保持样本湿润。
- 若肿瘤团块肉眼不可见，应用修整刀切除并修整正常组织，暴露肿瘤病灶的表面。
- 戴手套用手将切除标本的肿瘤表面多次轻触普通玻璃载片。肉眼确认接触区域覆盖普通玻璃载片面积超过80%。
- 将普通玻璃载片轻轻按压在聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载片上，并戴手套轻柔摩擦2–3次。肉眼确认细胞已从普通玻璃载片转移至PEN膜载片。
- 将玻璃载片和PEN膜载片在室温下自然干燥5分钟。
- 对普通玻璃载片进行染色，用于直接细胞学检查。先将载片浸入固定液中5秒，随后用吉姆萨染色液染色15秒。
- 在显微镜下全面评估普通玻璃载片上的肿瘤成分和细胞密度，进行快速筛查。根据以下多个标准评估肿瘤细胞：细胞核增大、核型异常、染色质丰富、细胞分布不均、核质比、细胞大小及....
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结果
图1展示了从制备TIC样本到DNA提取的完整流程。值得注意的是，该方法仅需两天即可从TIC样本中获得基因组DNA。我们评估了在制片处理前肿瘤组织储存对结果的影响。结果发现，当组织样本直接接触载玻片，或在生理盐水浸润的无菌纱布中保存1小时后，肿瘤细胞均能良好地附着于载玻片上（图2）。然而，若组织在室温下放置，则肿瘤细胞无法很好地附着于载玻片。制备好的载玻片可在4 °C下保存三个月。因此，保持样本湿润、避免干燥至关重要。
我们评估了本方法的实用性，并将其与采用FFPE方法获得的样本进行了比较。从14个肿瘤样本中分别制备了TIC和FFPE样本，我们证实可通过TIC样本评估肿瘤含量和纯度。经吉姆萨染色后，可通过显微镜观察肿瘤细胞数量和肿瘤形态。因此，我们能够常规评估肿瘤细胞，并随后进行DNA质量检测。
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讨论
本研究中，我们提出了一种利用TIC从临床病理标本中获取肿瘤DNA的替代方法。与FFPE方法相比，TIC制备过程极为简便，所需时间更短，且无需特殊仪器10。从TIC制备到DNA提取的全部操作可在两天内完成（图1）。该方法因此显著缩短了进行基因检测的周转时间。值得注意的是，这在缩短分子分析所需天数方面具有显著优势。较短的周转时间使我们能够立即为需要分子靶向药物的进展期癌症患者提供合适的治疗方案。因此，该方法在肿瘤遗传学改变分析及癌症治疗中分子靶向药物的应用方面均具有重要优势。
使用TIC DNA进行遗传分析时，有几个关键点需要注意。肿瘤组织可能因化疗或其他治疗而发生坏死，因此在制备TIC样本时需格外谨慎，应尽可能避免从肿瘤的坏死区域取样。此外，初始的显微镜评估对于后续操作至关重要。同时，为成功制备TIC样本，必须防止肿瘤组织干燥。若肿瘤组织发生干燥，会导致玻片上附着的细胞数量减少，并且由于干燥会引起肿瘤组织退变，从而难以观察肿瘤细胞的细胞含量和形态特征。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢医院的所有医务人员和辅助人员，以及同意参与本研究的患者。我们感谢Edanz集团（www.edanzediting.com/ac）的Gabrielle White Wolf博士对本报告初稿进行编辑。本研究得到了山梨县基因组研究项目资助（Y.H. 和 M.O.）以及安田医学基金会资助（Y.H.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FINE FROST 白色20 微型载玻片 | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN 膜载玻片 | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A 溶液 | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B 溶液 | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald 溶液 | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| 吉姆萨溶液 | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒 | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P 检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| FFPE DNA 质控检测 v2 TaqMan 探针 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板 | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp 光学粘性封膜 | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统 | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion 文库 TaqMan 定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq 癌症热点区域 Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq 文库试剂盒 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress 条形码接头 1-16 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View 测序试剂盒（200 碱基） | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef 系统 | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96 孔梯度 PCR 仪 | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 芯片试剂盒 v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM 系统 | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM 清洗液 2 号瓶装试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP 试剂盒 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16 孔磁力架 | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| 无粘性、无 RNase 微型离心管，1.5 mL（低吸附管） | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| 无核酸酶水 | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ 光学 96 孔反应板 | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ 透明粘性封膜 | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP 试剂盒 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 乙醇（99.5） | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| 氢氧化钠（10 M） | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS 移液器 L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS 移液器 L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS 移液器 L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | 迷你离心机 |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | 空气培养箱 |
| SensiCare 无粉丁腈检查手套 | MEDLINE | SEM486802 | |
| 无菌纱布 | Osaki | 11138 | |
| MediCool 冷藏箱 | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER 修整刀片 | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER 修整刀片 | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | 涡旋混合器 |
| 镊子 | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | BIOBIK | RC-0150 |
参考文献
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al.
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重印与许可
