本论文描述了在活细胞成像中应用基因编码的荧光生成报告系统，用于检测外源性物质诱导的氧化应激。该实验方法具有无与伦比的空间-时间分辨率、灵敏度和特异性，同时避免了传统毒理学氧化应激检测方法的诸多局限性。
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摘要
摘要
尽管氧化应激是一种常见的毒理学机制，但研究该过程的传统方法存在诸多缺陷，包括样品破坏、可能引入人为假象，以及对所涉及活性物质缺乏特异性。因此，毒理学领域迫切需要一种非破坏性、高灵敏度且特异性的方法，用于观察和量化细胞内氧化还原状态的扰动，即通常所说的氧化应激。本文介绍了一种利用两种基因编码的荧光探针 roGFP2 和 HyPer 进行活细胞成像，以观察外源性物质诱导的氧化应激反应的方法。roGFP2 可与谷胱甘肽氧化还原电位（EGSH）达到平衡，而 HyPer 则可直接检测过氧化氢（H2O2）。这两种探针均可通过转染或转导的方式在多种细胞类型中表达，并可靶向至特定的亚细胞区域。最重要的是，利用这些探针进行活细胞显微成像可实现传统方法无法达到的高空间和时间分辨率。在依次使用 404 nm 和 488 nm 激发光激发后，于 510 nm 处监测到的荧光强度变化即为这两种基因编码荧光探针的检测信号。这一特性使两种探针均具有比率型检测能力，可消除常见的显微成像假象，并校正细胞间探针表达水平的差异。该方法适用于所有能够在指定波长下进行激发和发射光采集的荧光检测平台，因此可与共聚焦成像系统、常规宽场显微镜以及微孔板检测仪联合使用。这两种基因编码的荧光探针已在多种细胞类型和毒理学研究中被广泛应用，用于实时监测细胞内 EGSH 和 H2O2 的生成。本文概述了一种标准化的方法，该方法在不同细胞类型和荧光检测平台上均具有广泛的适用性，可用于基于 roGFP2 和 HyPer 的活细胞氧化应激毒理学评估。
引言
“"氧化应激"”这一术语在毒理学中常被引用为一种机制，但该术语的具体定义却很少被明确阐述。氧化应激可指代多种细胞内过程，包括活性氧的生成、自由基造成的损伤、抗氧化分子的氧化，甚至特定信号通路的激活。已有文献记录表明，多种环境污染物1,2和药物制剂3,4均可通过外源性化合物本身的直接作用5,6，或通过细胞反应过程中继发性产生活性氧化物7,8,9,10，从而诱导氧化应激。因此，在毒理学中，准确观察和表征导致不良结局的氧化过程具有重要意义。传统测量氧化应激的方法包括检测被氧化的生物分子11,12,13,
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方案
1. 细胞的制备
注意：本实验步骤描述了使用慢病毒转导永生化细胞系（BEAS-2B；ATCC，Manassas，VA）以表达目标报告蛋白（roGFP2 或 HyPer）的方法。也可使用其他细胞系/类型和/或基因转导方法（包括转染），只要其能够实现足够的报告蛋白表达水平，从而在每个视野中观察到足够数量的传感器表达细胞（通常为 5 - 10 个细胞）。若采用转染方法，应在最终用于分析的培养皿中直接进行操作（例如，在将用于显微镜观察的同一培养皿中转染细胞）。下述步骤详细说明了在 6 孔细胞培养板中进行细胞转导的准备工作。若该培养格式不适用于目标应用，可替换为其他规格的培养容器。
- 将细胞在正常生长培养基中培养至约 40 - 60% 汇合度。
注意：本研究使用人支气管上皮细胞系 BEAS-2B，培养于角质形成细胞生长培养基（KGM）中。 - 转导前，将细胞上的生长培养基更换为 500 µL 含适当病毒量的无血清培养基，病毒量按以下公式计算：
- 对于 BEAS-2B 细....
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结果
使用 roGFP2 和 HyPer 检测 EGSH 和细胞内 H2O2 变化的应用此前已有充分描述25,36,42,43，本文亦对此进行了展示。在基础状态以及添加 H2O2 和 DTT 后表达 roGFP2 的细胞的共聚焦图像如图2所示。实验过程中采集的图像数据随后被导出，并按照方案第4节所述进行分析。如图所示，以外源性 H2O2 作为阳性对照，可产生可重复的响应；当数据归一化至各自的基础值后，通过添加已知的外源性氧化剂/还原剂（即 H2O2 和 DTT）可建立明确.......
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讨论
在先前的生理学和毒理学研究中，已对使用 roGFP2 和 HyPer 分别检测细胞内 EGSH 和 H2O2 变化的应用进行了充分描述25,35,36,39,40,41,42,43。本文所述方案报告了一种有效的方法，可在针对性的毒理学研究中应用这些基因编码的氧化还原传感器，以评估外源性物质诱导的细胞内氧化还原稳态扰动。最重要的是，正确使用这些传感器可将所观察到的任何变化与特定的氧化还原对或活性氧（EGSH 或 H.......
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披露
本文所描述的研究已通过美国环境保护局国家健康与环境效应研究实验室的审查，并已批准发表。本文内容不应被解释为代表机构政策，提及商品名或商业产品也不构成对使用该产品的认可或推荐。
致谢
作者谨此感谢 Katelyn Lavrich 在实验设计和文稿修改方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| roGFP2 质粒 | 俄勒冈大学 | N/A | 由 S.J. Remington 惠赠 |
| HyPer 质粒 | Evrogen | FP941 | |
| 过氧化氢 | Sigma Aldrich | H1009 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-菲醌 | Sigma Aldrich | 156507 | |
| 黑色壁玻璃底培养皿 | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B 细胞系 | 美国模式培养物集存库 | CRL-9609 | |
| 角质形成细胞基础培养基 | Lonza | 192151 | |
| 角质形成细胞生长培养基 BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office 套件 | N/A | |
| NIS-Elements AR 成像软件 | 尼康 | N/A | |
| 尼康 C1si 共聚焦成像系统 | 尼康 | N/A |
参考文献
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L.
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重印与许可
