本方法描述了重组Nsa1的克隆、表达和纯化，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行结构测定，适用于其他含有有序和无序结构域的蛋白质的混合结构分析。
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本文内容
摘要
摘要
由于核糖体组装因子 Nsa1 的 C 末端无序且易受蛋白酶降解，因此解析来自 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 的全长 Nsa1 结构具有挑战性。本文描述了从 S. cerevisiae 中纯化重组 Nsa1 蛋白以进行 X 射线晶体学和小角 X 射线散射（SAXS）结构分析的方法。利用 X 射线晶体学解析了 Nsa1 蛋白中结构有序的 N 末端 WD40 结构域的结构，随后通过 SAXS 在溶液中解析了 Nsa1 C 末端的结构。从小溶液状态下的全长 Nsa1 蛋白收集了溶液散射数据。根据高分辨率的 WD40 结构域晶体结构计算理论散射强度，再结合刚体建模和从头计算（ab initio）建模方法，揭示了 Nsa1 的 C 末端结构。通过这种混合方法，重建了该蛋白的四级结构。本文所述方法可广泛适用于其他由有序与无序结构域共同组成的蛋白质的混合式结构解析。
引言
核糖体是大型的核糖核蛋白机器，在所有活细胞中负责将mRNA翻译成蛋白质这一基本过程。核糖体由两个亚基组成，这些亚基通过一个称为核糖体生物合成的复杂过程产生1,2,3,4。真核生物核糖体的组装依赖于数百种必需的核糖体组装因子的协助2,3,5。Nsa1（Nop7相关蛋白1）是一种真核生物核糖体组装因子，特异性参与大核糖体亚基的生成6，在高等生物中被称为含WD重复序列蛋白74（WDR74）7。研究表明，WDR74对小鼠囊胚的形成至关重要8，且WDR74启动子在癌细胞中常发生突变9。然而，Nsa1/WDR74在核糖体组装中的功能及其精确作用机制仍 largely 未知。为了初步揭示Nsa1/WDR74在真核生物核糖体成熟过程中的作用，研究人员开展了多项结构分析，包括X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）
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方案
1. Nsa1 重组蛋白的表达与纯化
- Nsa1 表达质粒的设计与克隆
- 获取或购买 S. cerevisiae 基因组 DNA。
- 以从 S. cerevisiae 分离的基因组 DNA 为模板，使用适当的引物通过 PCR 扩增 Nsa1 的目标序列（Nsa1FL，残基 1-463）和 C 末端截短的 Nsa1（Nsa1ΔC，残基 1-434），退火温度约为 60 °C，延伸时间为 1-2 分钟。扩增 Nsa1 所用引物如下：
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC - 使用标准克隆技术将 Nsa1 亚克隆至含有 N 端 6×His 标签、随后为麦芽糖结合蛋白（MBP）及烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点的大肠杆菌（Escherichia coli....
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结果
将Nsa1从S. cerevisiae基因组DNA中通过PCR扩增，并亚克隆至含有N端6×His亲和标签、随后连接MBP及TEV蛋白酶切割位点的载体中。将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)细胞，在IPTG诱导下于25 °C过夜培养，获得高水平的蛋白表达（图1A）。Nsa1通过固定化钴亲和树脂进行亲和纯化，随后用TEV蛋白酶切除MBP标签，最后经凝胶过滤层析进一步分离纯化（图1B）。收集凝胶过滤层析中含Nsa1的组分，合并后浓缩至8 mg/mL，用于结晶筛选实验，实验由结晶机器人完成。初步的稀疏矩阵结晶筛选获得了两种不同的Nsa1晶体形态，分别为立方晶系和正交晶系（图2A）。
在优化立方晶系和正交晶系晶体的过程中，发现正交晶系晶.......
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讨论
通过本方案，成功制备了来自S. cerevisiae的重组Nsa1蛋白，并用于X射线晶体学和SAXS结构研究。Nsa1在溶液中性质稳定，并形成了多种晶体形式。在优化晶体过程中发现，Nsa1的C末端对蛋白酶降解敏感。高分辨率的正交晶系晶体仅能在Nsa1的C末端截短突变体中重复获得，这很可能是因为Nsa1的C末端具有柔性，阻碍了晶体堆积。尽管通过X射线晶体学以高分辨率解析了Nsa1的结构，但在两种晶体形式中均无法构建出C末端，因其无有序结构。对于Nsa1大小的生物大分子而言，晶体学是确定原子分辨率结构的首选技术；然而，与其他方法一样，晶体学也存在一定的局限性。其中主要局限之一是无法解析蛋白质中无序区域的结构40,41。
Nsa1 的 C 末端对其蛋白在核仁中的正确定位至关重要，这凸显了研究其结构的必要性10。Nsa1 的 C 末端结构通过小角 X 射线散射（SAXS）得以解析，该技术是 X 射线晶体学的一.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
衍射数据是在阿贡国家实验室先进光子源（APS）的东南区域协作接入团队（SER-CAT）22-ID 和 22-BM 光束线上收集的。SAXS 数据是在劳伦斯伯克利国家实验室先进光源（ALS）的 SIBYLS 光束线上收集的。我们感谢 SIBYLS 光束线的工作人员在远程数据采集和处理方面提供的帮助。我们感谢美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）质谱研究与支持小组在确定蛋白质结构域边界方面提供的协助。本工作由美国国立卫生研究院院内研究计划、美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）（R. E. S. 项目编号 ZIA ES103247）以及加拿大卫生研究院（CIHR，项目编号 146626 至 M.C.P）资助。先进光子源（APS）的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室合同编号 W-31-109-Eng-38 的支持。先进光源（ALS）的使用得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室合同编号 DE-AC02-05CH11231 的支持。SIBYLS SAXS 光束线的额外支持来自美国国立卫生研究院项目 MINOS（R01GM105404）和高规格仪器资助项目 S10OD018483。我们还要感谢 Andrea Moon 和 Sara Andres 博士对本文稿的审阅意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nsa1的分子克隆 | |||
| pMBP2 平行载体 | Sheffield 等，Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | 我们使用了经过改造的pMBP2质粒，其中包含一个N端His标签（pHMBP） | |
| S. cerevisiae 基因组 DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| 克隆Nsa1所用引物 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG | |
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC | |
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG | |
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC | |
| 重组蛋白Nsa1的表达与纯化 | |||
| 大肠杆菌 BL21 (DE3) Star 感受态细胞 | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP-NSA1 及各种截短突变体 | Lo 等，2017 | ||
| 硒代甲硫氨酸 | 分子构型 | MD12-503B | |
| IPTG，无二噁烷 | 普洛麦格 | V3953 | |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| 氯化钠 | Caledon 实验室化学品 | 7560-1-80 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| 1 M Tris缓冲液，pH 7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| 甘油 | Invitrogen | 15514-029 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M6250 | |
| 1 M 咪唑，pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon 亲和树脂 | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL 离心滤器（截留分子量 10K） | 默克密理博 | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade 凝胶过滤柱 | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV 蛋白酶 | 由NIEHS蛋白质表达核心实验室制备 | 由美国国家癌症研究所（NCI）提供的表达质粒（Tropea 等，Methods Mol Biology，2009） | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶 | BioRad | 456-8056 | |
| 结晶，蛋白酶解筛选 | |||
| 晶体筛选 | Hampton Research | HR2-110 | |
| 晶体筛选试剂盒2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| 盐反应 | Hampton Research | HR2-136 | |
| 初筛实验 | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/离子筛选 | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | 分子尺度 | MD1-37 | |
| Wizard 沉淀剂协同剂 | 分子构型 | MD15-PS-T | |
| Swissci 96孔3滴UVP坐滴板 | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3英寸宽透明封箱胶带 | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | 分子维度 | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | 分子构型 | MD2-100-3 | |
| HEPES/氢氧化钠 pH 7.5 | 分子构型 | MD2-011- | |
| 柠檬酸钠三碱 | 分子构型 | MD2-100-127 | |
| 22 mm × 0.22 mm 硅化盖玻片 | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24孔板带密封垫（VDX板带密封垫） | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM 尼龙挂环（0.05 mm 至 0.5 mM） | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| 磁性晶体帽 | Hampton Research | HR4-779 | |
| 磁力冷冻取样棒 | Hampton Research | HR4-729 | |
| 低温泡沫杜瓦瓶 | Hampton Research | HR4-673 | |
| 晶体样品托系统 | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| 全裙边 96 孔透明板 | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat 密封垫 | VWR | 10011-130 | |
| 设备 | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 蚊子机器人 | TTP Labtech | ||
| 软件/网站 | |||
| HKL2000 | Otwinoski 和 Minor，1997 | ||
| Phenix | Adams 等，2010 | ||
| Coot | Emsley 等，2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov 等，2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| 散射 | Rambo 和 Tainer，2013 | ||
| PyMOL | PyMOL 分子图形系统，版本 1.8 Schrödinger, LLC | ||
| BUNCH | 佩托霍夫和施韦尔根，2005 | ||
| CRYSOL | Svergun 等，1995 | ||
| PRIMUS | Konarev 等，2003 | ||
| EOM | Tria 等，2015 |
参考文献
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bas....
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重印与许可
