结合X射线晶体学与小角X射线散射技术对酿酒酵母（S. Cerevisiae）Nsa1蛋白非结构化区域进行建模

摘要

本方法描述了重组Nsa1的克隆、表达和纯化，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行结构测定，适用于其他含有有序和无序结构域的蛋白质的混合结构分析。

摘要

由于核糖体组装因子 Nsa1 的 C 末端无序且易受蛋白酶降解，因此解析来自 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 的全长 Nsa1 结构具有挑战性。本文描述了从 S. cerevisiae 中纯化重组 Nsa1 蛋白以进行 X 射线晶体学和小角 X 射线散射（SAXS）结构分析的方法。利用 X 射线晶体学解析了 Nsa1 蛋白中结构有序的 N 末端 WD40 结构域的结构，随后通过 SAXS 在溶液中解析了 Nsa1 C 末端的结构。从小溶液状态下的全长 Nsa1 蛋白收集了溶液散射数据。根据高分辨率的 WD40 结构域晶体结构计算理论散射强度，再结合刚体建模和从头计算（ab initio）建模方法，揭示了 Nsa1 的 C 末端结构。通过这种混合方法，重建了该蛋白的四级结构。本文所述方法可广泛适用于其他由有序与无序结构域共同组成的蛋白质的混合式结构解析。

引言

核糖体是大型的核糖核蛋白机器，在所有活细胞中负责将mRNA翻译成蛋白质这一基本过程。核糖体由两个亚基组成，这些亚基通过一个称为核糖体生物合成的复杂过程产生^1,2,3,4。真核生物核糖体的组装依赖于数百种必需的核糖体组装因子的协助^2,3,5。Nsa1（Nop7相关蛋白1）是一种真核生物核糖体组装因子，特异性参与大核糖体亚基的生成⁶，在高等生物中被称为含WD重复序列蛋白74（WDR74）⁷。研究表明，WDR74对小鼠囊胚的形成至关重要⁸，且WDR74启动子在癌细胞中常发生突变⁹。然而，Nsa1/WDR74在核糖体组装中的功能及其精确作用机制仍 largely 未知。为了初步揭示Nsa1/WDR74在真核生物核糖体成熟过程中的作用，研究人员开展了多项结构分析，包括X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）¹⁰。

X射线晶体学、核磁共振（NMR）波谱法、电子显微镜和小角X射线散射（SAXS）均为研究大分子结构的重要技术。大分子的大小、形状、可获得性和稳定性会影响其最适合的结构生物学方法，然而，通过所谓的"混合"方法结合多种技术正日益成为一种有益的工具¹¹。特别是X射线晶体学和SAXS，是大分子结构解析中强大且互补的两种方法¹²。

晶体学可提供从小分子到核糖体等大型细胞机器的高分辨率原子结构，已在理解蛋白质及其他大分子的生物学功能方面促成 numerous 突破¹³。此外，基于结构的药物设计利用晶体结构通过计算方法进行分子对接，为药物发现与开发增添了关键维度¹⁴。尽管晶体学具有广泛适用性，但柔性与无序体系难以通过晶体学进行评估，因为晶体堆积可能受阻，或电子密度图可能不完整或质量较差。相比之下，SAXS 是一种基于溶液的低分辨率结构研究方法，能够描述从无序环区和末端到内在无序蛋白等柔性体系^12,15,16。鉴于其适用于广泛的颗粒尺寸¹²，SAXS 可与晶体学协同作用，拓展结构研究能够回答的生物学问题范围。

Nsa1 适用于混合结构研究方法，因为它包含一个结构明确的 WD40 结构域，其后是一个功能性的但具有柔性的C末端，该C末端不适合采用X射线晶体学方法进行研究。以下是针对S. cerevisiae Nsa1 的克隆、表达和纯化实验方案，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行混合结构测定。该方案可经调整后用于研究其他由有序区域和无序区域组合构成的蛋白质结构。

方案

1. Nsa1 重组蛋白的表达与纯化

1. Nsa1 表达质粒的设计与克隆
   1. 获取或购买 S. cerevisiae 基因组 DNA。
   2. 以从 S. cerevisiae 分离的基因组 DNA 为模板，使用适当的引物通过 PCR 扩增 Nsa1 的目标序列（Nsa1_FL，残基 1-463）和 C 末端截短的 Nsa1（Nsa1_ΔC，残基 1-434），退火温度约为 60 °C，延伸时间为 1-2 分钟。扩增 Nsa1 所用引物如下：
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1_ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1_ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
   3. 使用标准克隆技术将 Nsa1 亚克隆至含有 N 端 6×His 标签、随后为麦芽糖结合蛋白（MBP）及烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点的大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）表达载体 pHMBP 中¹⁷。
   4. 通过 DNA 测序验证 Nsa1 已正确插入，且与 N 端 His-MBP 标签保持阅读框一致。
2. Nsa1 蛋白表达
   1. 将表达质粒转化至适合的 E. coli 表达菌株中（该菌株含有基于 T7 启动子的表达系统）。将转化子涂布于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上，37 °C 倒置培养过夜。
   2. 从转化平板中挑取单菌落接种至含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 50 mL LB 培养基中，37 °C、200 rpm 振荡培养过夜。
   3. 取 15 mL 过夜培养物接种至 3 个含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 1000 mL LB 培养基的三角烧瓶中，37 °C、200 rpm 振荡培养。
      注：为进行蛋白质结构解析，可在诱导前使用补充了硒代甲硫氨酸（SeMet）及氨基酸混合物的 M9 最小培养基培养细胞，以抑制甲硫氨酸合成，从而实现硒代甲硫氨酸的掺入，而非使用 LB 培养基¹⁸。
   4. 当 OD₆₀₀ 达到约 0.8 时，加入终浓度为 1 mM 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导 Nsa1 表达，随后在 25 °C、200 rpm 条件下继续振荡培养过夜。
   5. 在 4 °C 条件下以 5,050 × g 离心 15 分钟收集细胞。
      注：细胞可长期保存于 -80 °C，或立即用于蛋白纯化。
3. Nsa1 蛋白纯化
   1. 将细胞沉淀重悬于 25 mL 预冷至 4 °C 的裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，10% 甘油，10 mM MgCl₂）中，缓冲液中含一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂。
   2. 在 4 °C 条件下进行超声破碎（总时间 7 分钟，开 2 秒，关 2 秒，振幅 70%）。
   3. 在 4 °C 条件下以 26,900 × g 离心 45 分钟，澄清裂解液。
   4. 将澄清后的裂解液上样至装有 10 mL 固定化钴亲和树脂的重力柱中，树脂预先用裂解缓冲液平衡。
   5. 在 4 °C 条件下让上清液依靠重力流过树脂，并用 100 mL 裂解缓冲液洗涤树脂两次。
   6. 用 20 mL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl，5 mM MgCl₂，5% 甘油，200 mM 咪唑）洗脱 Nsa1。
   7. 取 15 μL 洗脱液，在 4-15% SDS-PAGE 凝胶上电泳，以确认蛋白已从亲和树脂中洗脱（图 1A）。
   8. 通过 TEV 蛋白酶消化去除 MBP 标签。向 Nsa1 亲和层析洗脱液中加入 1 mL TEV 蛋白酶¹⁹（1 mg/mL 储液），4 °C 孵育过夜。
   9. 使用截留分子量为 10 kDa 的离心浓缩管将去除 MBP 后的 Nsa1 浓缩至约 5 mL。
   10. 将去除 MBP 的 Nsa1 上样至预先用缓冲液 A（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM MgCl₂，5% 甘油，1 mM β-巯基乙醇）平衡的凝胶过滤柱中（图 1B）。
   11. 收集凝胶过滤柱的各组分，取 15 μL 样品在 4-15% SDS-PAGE 凝胶上电泳分析，以确认 MBP 已被切割并从 Nsa1 中分离（图 1B）。
   12. 合并含 Nsa1 的组分，并使用截留分子量为 10 kDa 的离心浓缩管浓缩至 8 mg/mL。
   13. 使用分光光度计在 280 nm 处测定吸光度，根据消光系数 42530 M^-1cm^-1 确定蛋白浓度。纯化后的蛋白应立即用于蛋白酶解筛选和结晶试验。

2. Nsa1 的结晶与蛋白酶解筛选

1. 稀疏矩阵晶体筛选 Nsa1
   1. 将 500 μL 浓度为 8 mg/mL 的 Nsa1 储液在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟。
   2. 使用结晶机器人和稀疏矩阵结晶筛选试剂盒进行结晶实验。向 96 孔板的储液池中加入 30 μL 来自稀疏矩阵结晶筛选试剂盒的各单一结晶试剂。通过机器人设置悬滴法，将 250 nL 储液与 250 nL 蛋白溶液混合。
   3. 用封膜密封结晶板，并在 25 °C 下孵育。
   4. 在前 2–3 周内每隔两天使用体视显微镜检查一次板内情况。
   5. 使用紫外显微镜确认潜在的晶体是否含有蛋白质。
      注：对于 Nsa1，两种不同的晶体形式（立方体和正交晶系，图 2A）在以下筛选条件下一周内获得：JCSG+ 条件 B11（1.6 M 柠檬酸三钠二水合物，pH 6.5）以及 Wizard Precipitant Synergy Screen Block 2 条件 C11（20.1%(v/v) PEG 1500，13.4%(v/v) PEG 400，0.1 M Tris HEPES/氢氧化钠，pH 7.5）。
2. 蛋白酶解筛选
   注：在结晶优化过程中发现，Nsa1 的正交晶系晶体是由于蛋白酶解切割所致，且无法使用全长蛋白重复生成该晶体。结合有限蛋白酶解与质谱分析，确定 Nsa1 的 C 末端对蛋白酶敏感，去除 C 末端尾部是后续重现正交晶系晶体形式（Nsa1_ΔC）所必需的。
   1. 配制以下蛋白酶的 1 mg/mL 储液：α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和谷氨酸特异性蛋白酶 Glu-C。
   2. 用稀释缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5，500 mM 氯化钠）将每种 1 mg/mL 的蛋白酶储液分别稀释为 1:10、1:100 和 1:1000。
   3. 将每种蛋白酶的 1 μL 储液（1:10、1:100 和 1:1000）加入 9 μL 蛋白溶液（1 mg/mL）中，用于筛选。
   4. 在 37 °C 下孵育 1 小时。
   5. 加入 10 μL 2× SDS-PAGE 上样缓冲液终止反应，并在 95 °C 加热 5 分钟。
   6. 通过 4–15% SDS-PAGE 凝胶电泳分析酶解产物（图 2B）。
   7. 通过凝胶内质谱分析鉴定目标蛋白中抗蛋白酶降解的结构域。
   8. 通过构建截短表达载体并按照上述克隆、表达和纯化流程，从目标蛋白中去除易受蛋白酶降解的区域。
3. 结晶优化
   1. 配制或获取以下初始结晶试剂的储液：1.6 M 柠檬酸三钠二水合物（pH 6.5）、100%(v/v) PEG 400、50%(v/v) PEG 1500、1 M HEPES/氢氧化钠（pH 7.5）。
   2. 按照上述方法配制 Nsa1_FL 和 Nsa1_ΔC 的 8 mg/mL 储液。
   3. 优化 Nsa1 立方晶体（Nsa1_FL）。
      1. 制备一个 24 孔网格筛选板，每孔含 500 µL，使用 1.6 M 柠檬酸三钠（pH 6.5）储液配制 1–1.6 M 的浓度梯度，pH 保持为 6.5。
      2. 将 1 µL 蛋白溶液与 1 µL 储液混合，滴加到硅化盖玻片上。小心地将盖玻片倒置于预先涂油的孔上，确保密封良好，同时避免扰动液滴或损坏盖玻片。重复此操作直至填满整块板，随后在 25 °C 下保存。
         注：小立方晶体应在 2–7 天内出现。
      3. 制备立方晶体的微晶种子储备液。使用装有尼龙环的工具将约 10 个小型立方晶体转移至含有小钢珠和 50 µL 1.6 M 柠檬酸三钠（pH 6.5）的 1.5 mL 微离心管中。
      4. 将 1.5 mL 微离心管在高速（约 3000 rpm）下涡旋震荡 1 分钟。
      5. 用 1.6 M 柠檬酸三钠对种子储备液进行 10 倍系列稀释，并充分涡旋混合 5 秒。
      6. 向 24 孔网格筛选板的每个孔中加入 500 µL 1.6 M 柠檬酸三钠（pH 6.5）。
      7. 通过设置不同蛋白与种子储备液比例的液滴来优化微种子条件（图 3A）。高质量衍射能力的大立方晶体应在 2–5 天内出现（图 3C）。
   4. 优化正交晶系晶体（Nsa1_ΔC）
      1. 使用 50%(v/v) PEG 1500 和 100%(v/v) PEG 400 储液，在每个孔中加入 500 µL，制备包含 24 种不同条件的网格筛选板（图 3B）。除 PEG 1500 和 PEG 400 的浓度梯度外，每孔还需含有 0.1 M HEPES/氢氧化钠（pH 7.5）。
      2. 在硅化盖玻片上将 1 µL 蛋白溶液与 1 µL 储液混合。小心地将盖玻片倒置于预先涂油的孔上，确保密封良好。重复此操作直至填满整块板。将板在 25 °C 下保存。
         注：Nsa1 正交晶系晶体应在 2–7 天内出现。
      3. 进一步通过微种子法优化正交晶系晶体，方法同立方晶体（步骤 2.3.3.3 至 2.3.3.7），使用 500 µL 含 20.1%(v/v) PEG 1500、13.4%(v/v) PEG 400 和 0.1 M HEPES/氢氧化钠（pH 7.5）的溶液作为储液。
         注：Nsa1 SeMet 晶体的优化应参照天然晶体进行。

3. X射线衍射数据收集与Nsa1结构解析

1. 晶体的低温保护与X射线衍射数据收集
   1. 对于正交晶系晶体（Nsa1_ΔC），准备1 mL冷冻保护剂溶液，其中含22.5%（v/v）PEG 1500、15%（v/v）PEG 400和0.1 M HEPES/氢氧化钠，pH 7.5。
   2. 用液氮填充泡沫杜瓦瓶，并预冷晶体载具。操作液氮时需小心，佩戴防护手套和护目镜。
   3. 小心地将含有晶体的结晶板盖玻片倒置在体视显微镜的载物台上。
   4. 移液器 2 µ将L的冷冻保护溶液加入新的盖玻片上。
   5. 将适当尺寸的尼龙环安装在磁性冷冻镊子上。
   6. 在体视显微镜辅助下，迅速用装有冷冻环的装置将晶体转移至冷冻保护剂溶液中。
   7. 让晶体在冷冻保护剂溶液中平衡5分钟。
   8. 在体视显微镜辅助下，迅速用环状工具捞取晶体并从冷冻保护液中转移，随即浸入液氮中进行快速冷冻。
   9. 等待液氮在环周围停止沸腾后，将环从镊子上释放到晶体载具内的特定位置。
   10. 立方体 Nsa1_全长 晶体无需进行冷冻保护，可直接进行快速冷冻（参照上述步骤 3.1.8-3.1.9）。
   11. 使用冷冻工具密封晶体载物盘，并转移至预冷杜瓦罐中的运输杆内。将晶体存放在载物盘/杜瓦罐中，直至进行数据收集。
   12. 若在同步辐射光源处收集数据，使用干式运输罐将晶体运送至同步辐射设施。
   13. 采用标准技术收集X射线衍射数据²⁰.
       注意：Nsa1 的天然态及 SAD（单波长反常衍射）数据集在阿贡国家实验室（美国伊利诺伊州芝加哥市）先进光子源的 SER-CAT 22-ID 和 22-BM 光束线上于 100 K 条件下收集。SAD 的 Nsa1 数据集在 λ= 0.97911 Å̊数据采用1秒曝光时间和0.5° 振荡。这些晶体的镶嵌度通常约为 0.3°.
   14. 处理并标定X射线衍射图像，为每个数据集在相应的空间群中生成衍射点文件。
       注意：Nsa1 的衍射数据集使用 HKL2000 进行处理²¹Nsa1 的立方晶体在空间群 P2 中进行处理₁3，正交晶体在空间群 P2 中进行处理₁2₁2₁.
2. Nsa1 结构解析
   注意：有多种可用于求解和优化晶体结构的晶体学软件包，包括 Phenix 和 CCP4^22,23以下是使用 Phenix 软件套件解析 Nsa1 结构的实验方案²².
   1. 使用 phenix.xtriage 分析天然态和SAD缩放后的数据集²².
   2. 使用 Phenix.autosol 结合 SAD 峰值反射文件求解 Nsa1 的结构^22,24. 运行 AutoSol 程序时，输入硒代甲硫氨酸位点的数量（sites= 9）以及 Nsa1 的 fasta 序列文件_ΔC, 以及用于SAD数据收集的波长（λ= 0.97911 Å̊).
      注意：从 Nsa1 的 SAD 数据集出发，phenix.autosol 应能够确定实验相位并构建大部分模型。
   3. 使用 Coot 对模型进行手动调整²⁵，随后在 phenix.refine 中进行精修^22,26.
   4. 使用 Phaser 通过分子置换法求解高分辨率天然正交晶系晶体和立方晶系晶体的结构^27,28.
   5. 结构解析成功后，在 Coot 中检查模型和电子密度图²⁵.
   6. 通过在 phenix.refine 中进行多轮迭代优化来构建和精修结构^22,26 并在 Coot 中进行模型构建²⁵.

4. SAXS 数据采集、处理与建模

1. SAXS 数据采集
   注意：SAXS 数据是针对全长蛋白记录的 S. cerevisiae 中国台湾加利福尼亚州伯克利市劳伦斯伯克利国家实验室先进光源 SIBYLS 高通量光束线 12.3.1²⁹.
   1. 纯化 Nsa1_全长 按照上述方案操作。在 Nsa1 运输前 24 小时_全长 将蛋白上样至预先用缓冲液A平衡的凝胶过滤柱，并进样到光束线上。
   2. 合并含有 Nsa1 的洗脱组分，并按照前述方法测定蛋白浓度。
   3. 准备30 μ使用缓冲液A配制浓度系列为1至6.2 mg/mL的Nsa1等份样品。
   4. 转移 20 μ将每个浓度系列的 Nsa1 各 l 加入透明全裙边 96 孔微孔板中，同时设置仅含缓冲液 A 的对照。
      注意：SAXS 数据在稀溶液中采集，需使用多种浓度的纯化样品，以避免聚集、粒子间排斥及辐射损伤效应。
   5. 用硅胶密封垫密封微孔板，并在4℃下 overnight 运输 °C 到光束线。
   6. 将微孔板在 4 ℃ 保存 °直至数据收集前均保持在 C 状态。
   7. 在数据采集前立即于4℃下以3200 × g离心10分钟 °C 以去除潜在的聚集体和气泡。
   8. 记录SAXS数据。
      注意：对于 Nsa1，SAXS 数据在每组蛋白浓度前后均记录了缓冲液的信号。Nsa1 采集了 33 次连续扫描，每次 0.3 秒_全长 在10个浓度梯度（1至6.2 mg/mL）下 °C.
   9. 对SAXS数据进行缓冲液扣除。
      注意：对于 Nsa1，缓冲液扣除在光束线上自动完成，但也可使用数据约简软件（如 Scatter）进行缓冲液扣除³⁰ 以及 ATSAS 软件包³¹缓冲液扣除是SAXS数据分析的关键步骤，必须确保用于扣除的缓冲液与蛋白质样品缓冲液完全相同。
   10. 将连续的33次扫描结果取平均值，为每个浓度生成一个 *ave.dat 文件。
       注意：叠加33个连续帧以比较曲线。散射曲线随时间的变化通常表明存在辐射损伤。应将这些帧排除在平均处理之外。Nsa1连续扫描的平均处理在SIBYLS光束线上自动完成。
2. SAXS 数据处理与浓度梯度系列的比较
   注意：有多种软件包可用于分析SAXS数据。对于Nsa1，使用PRIMUS确定了回转半径和对距离分布函数。³² 和 Gnom³³ 来自 ATSAS 2.7.2 软件包³¹ 并在所有蛋白质浓度下进行比较，以确保不存在辐射损伤或浓度依赖性的粒子间相互作用¹⁰.
   1. 打开终端 shell，进入包含 SAXS 数据的目录。
   2. 启动 PRIMUS³² 终端 shell 中的图形用户界面。
   3. 在 PRIMUS 图形用户界面中，加载散射曲线（*ave.dat）。
   4. 使用 AutoR_g 确定回转半径（R_g）以及每条散射曲线的正向散射强度 I(0)（*ave.dat）。
   5. 为每条散射曲线（*ave.dat）生成Kratky图，以评估其致密程度。
   6. 使用 AutoGNOM³³ 用于计算每条散射曲线（*ave.dat）的对距离分布函数（也称为 P(r)）。输入起始 D_最大 ≈ 3*R_g 并优化 D_最大 值以获得平滑的P(r)曲线。在优化D的过程中_最大，通过检查报告的实验散射曲线，确保计算得到的P(r)函数与其一致 χ² 值，并通过视觉评估其对散射曲线的整体拟合情况。
   7. 利用相关体积从散射曲线计算 Nsa1 的分子量³⁴.
   8. 比较各浓度下的结构参数，以确保不存在辐射损伤或浓度依赖性效应。
      注意：浓度效应可能表现为R值随浓度增加而上升_g 和 D_最大 随着蛋白质浓度的增加。在蛋白质浓度系列中，样品的前向散射强度 I(0) 除以样品浓度也应保持恒定。
3. SAXS 建模
   注意：为确定 Nsa1 C-末端的位置_全长Nsa1 晶体结构¹⁰ （PDB 5SUM）和SAXS散射曲线用于进行刚体组合与从头建模 从头计算 使用 BUNCH 程序进行建模³⁵ 和集成优化方法（EOM）³⁶ 来自 ATSAS 软件套件³¹将Nsa1的WD40结构域视为刚体，而Nsa1的C末端以及来自WD40结构域的若干无序环则通过建模以拟合实验测得的SAXS数据。
   1. 生成输入的PDB文件。每当主链缺失残基时，必须将PDB文件进行分割，且PDB文件中不能包含多种构象、配体或水分子。
   2. 运行程序 Pre_BUNCH³⁵ 准备用于 BUNCH 的输入 PDB 文件（pre_bunch.pdb）。输入目标蛋白的序列（*.seq）、在 4.3.1 步骤中生成的结构域/PDB 数量，以及上述生成的各个单独的 PDB 文件。
   3. 使用 CRYSOL 程序计算每个单独 PDB 文件的散射振幅³⁷. 运行 CRYSOL 时输入单个 PDB 文件和实验 SAXS 散射曲线（*.dat）。这将生成一个振幅文件（*.alm）。
   4. 运行程序 BUNCH³⁵ 使用结合的刚体和从头建模方法，将 Nsa1 的 WD40 结构域与 SAXS 数据进行拟合 从头计算 方法。输入来自 Pre_BUNCH 的 PDB 文件（pre_bunch.pdb）、实验 SAXS 散射曲线（*.dat）以及由 CRYSOL 生成的每个部分 PDB 文件对应的单个振幅文件（*.alm）。
   5. 比较 χ² 从起始PDB（5SUM）获得的值与 从头计算 使用实验SAXS数据通过BUNCH生成的模型。
      注意：一个成功的 BUNCH 模型应具有显著更低的 χ² 低于起始模型的值。通过目视检查BUNCH模型的理论散射曲线与SAXS实验数据的叠加情况及其 χ² 值（图4，中心管道）
   6. 在 PyMOL 中手动检查 BUNCH 的输出文件³⁸ 将晶体结构与 BUNCH 生成的模型以及 SAXS 包络进行叠加图4，中心管道）
   7. 重复运行 BUNCH 10 至 20 次，以生成独立模型，确认这些模型具有相似性。
      注意：对于 Nsa1，存在一个范围 χ² 来自20次独立运行的值约为1到3。
   8. 集成建模
      注意：作为 BUNCH 运行的可选方法，可选择运行 EOM³⁶ 或最小集合搜索³⁹ (MES)。EOM 和 MES 采用系综方法，适用于具有多个构象的柔性结构域/区域的蛋白质。
      1. 运行程序 EOM³⁶ 使用 ATSAS 在线服务器。运行 EOM 时，输入来自 4.3.1 的 PDB 文件、目标蛋白的序列（*.seq）以及实验 SAXS 数据（*.dat）。
      2. 比较 χ² 将起始PDB（5SUM）的值与EOM利用实验SAXS数据生成的系综的值进行比较。
         注意：一个成功的EOM集合应具有显著更低的 χ² 优于起始模型。通过目视检查集合的理论散射曲线与SAXS实验数据的叠加情况及其 χ² 值（图4，右侧流程）。还应比较 χ² 使用 BUNCH 和 EOM 的值来确定哪个模型最能描述实验 SAXS 数据。
      3. 在 PyMOL 中手动检查 EOM 构象体³⁸ 将晶体结构与EOM生成的构象体进行叠加图4）。注意对散射曲线有贡献的构象体总数以及每个构象体所占的占有率比例。对于较为刚性的分子（如 Nsa1），构象体的数量应较少（1–5 个）（图4，右侧流程）³⁶.
      4. 多次重复运行 EOM 以确保结果的一致性。
         注意：对于 Nsa1，构象体的数量通常为 3 到 4 个， χ² 数值范围为 0.1 至 0.3。

结果

从 S. cerevisiae 基因组 DNA 中通过 PCR 扩增得到 Nsa1，并将其亚克隆至一个带有 N 端 6x-His 亲和标签、随后连接 MBP 及 TEV 蛋白酶切割位点的载体中。将 Nsa1 转化至 E. coli BL21(DE3) 细胞中，经 IPTG 诱导并在 25 °C 下过夜培养后，获得了高水平的蛋白表达（图 1A）。Nsa1 通过固定化钴亲和树脂进行亲和纯化，随后用 TEV 蛋白酶切除 MBP 标签，最后通过尺寸排阻色谱进一步分离纯化（图 1B）。收集尺寸排阻色谱中含 Nsa1 的组分，合并后浓缩至 8 mg/mL，随后使用结晶机器人进行结晶试验。初步的稀疏矩阵结晶筛选获得了两种不同的 Nsa1 晶体形态，分别为立方晶系和正交晶系（图 2A）。

讨论

通过本方案，成功制备了来自S. cerevisiae的重组Nsa1蛋白，并用于X射线晶体学和SAXS结构研究。Nsa1在溶液中性质稳定，并形成了多种晶体形式。在优化晶体过程中发现，Nsa1的C末端对蛋白酶降解敏感。高分辨率的正交晶系晶体仅能在Nsa1的C末端截短突变体中重复获得，这很可能是因为Nsa1的C末端具有柔性，阻碍了晶体堆积。尽管通过X射线晶体学以高分辨率解析了Nsa1的结构，但在两种晶体形式中均无法构建出C末端，因其无有序结构。对于Nsa1大小的生物大分子而言，晶体学是确定原子分辨率结构的首选技术；然而，与其他方法一样，晶体学也存在一定的局限性。其中主要局限之一是无法解析蛋白质中无序区域的结构^40,41。

Nsa1 的 C 末端对其蛋白在核仁中的正确定位至关重要，这凸显了研究其结构的必要性¹⁰。Nsa1 的 C 末端结构通过小角 X 射线散射（SAXS）得以解析，该技术是 X 射线晶体学的一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nsa1的分子克隆
pMBP2 平行载体	Sheffield 等，Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)		我们使用了经过改造的pMBP2质粒，其中包含一个N端His标签（pHMBP）
S. cerevisiae 基因组 DNA	ATCC	204508D-5
克隆Nsa1所用引物
SC_Nsa1_FLFw	IDT		CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG
SC_Nsa1_FLRv	IDT		AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw	IDT		GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv	IDT		GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC
重组蛋白Nsa1的表达与纯化
大肠杆菌 BL21 (DE3) Star 感受态细胞	Invitrogen	C601003
pMBP-NSA1 及各种截短突变体	Lo 等，2017
硒代甲硫氨酸	分子构型	MD12-503B
IPTG，无二噁烷	普洛麦格	V3953
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	4693159001
氯化钠	Caledon 实验室化学品	7560-1-80
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M2670
1 M Tris缓冲液，pH 7.5	KD Medical	RGF-3340
甘油	Invitrogen	15514-029
β-巯基乙醇	Sigma	M6250
1 M 咪唑，pH 8.0	Teknova	I6980-06
Talon 亲和树脂	Clonetech	635503
Amicon Ultra 15 mL 离心滤器（截留分子量 10K）	默克密理博	UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade 凝胶过滤柱	GE-Healthcare	28989335
TEV 蛋白酶	由NIEHS蛋白质表达核心实验室制备	由美国国家癌症研究所（NCI）提供的表达质粒（Tropea 等，Methods Mol Biology，2009）
4-15% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶	BioRad	456-8056
结晶，蛋白酶解筛选
晶体筛选	Hampton Research	HR2-110
晶体筛选试剂盒2	Hampton Research	HR2-112
盐反应	Hampton Research	HR2-136
初筛实验	Hampton Research	HR2-144
PEG/离子筛选	Hampton Research	HR2-139
JCSG+	分子尺度	MD1-37
Wizard 沉淀剂协同剂	分子构型	MD15-PS-T
Swissci 96孔3滴UVP坐滴板	TTP Labtech	4150-05823
3英寸宽透明封箱胶带	Hampton Research	HR4-506
Proti-Ace Kit	Hampton Research	HR2-429
PEG 1500	分子维度	MD2-100-6
PEG 400	分子构型	MD2-100-3
HEPES/氢氧化钠 pH 7.5	分子构型	MD2-011-
柠檬酸钠三碱	分子构型	MD2-100-127
22 mm × 0.22 mm 硅化盖玻片	Hampton Research	HR3-231
24孔板带密封垫（VDX板带密封垫）	Hampton Research	HR3-172
18 mM 尼龙挂环（0.05 mm 至 0.5 mM）	Hampton Research	HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit	Hampton Research	HR2-320
磁性晶体帽	Hampton Research	HR4-779
磁力冷冻取样棒	Hampton Research	HR4-729
低温泡沫杜瓦瓶	Hampton Research	HR4-673
晶体样品托系统	MiTeGen	M-CP-111-021
全裙边 96 孔透明板	VWR	10011-228
AxyMat 密封垫	VWR	10011-130
设备
UVEX-m	JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite 分光光度计	赛默飞世尔科技
蚊子机器人	TTP Labtech
软件/网站
HKL2000	Otwinoski 和 Minor，1997
Phenix	Adams 等，2010
Coot	Emsley 等，2010
ATSAS	Petoukhov 等，2012		https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
散射	Rambo 和 Tainer，2013
PyMOL	PyMOL 分子图形系统，版本 1.8 Schrödinger, LLC
BUNCH	佩托霍夫和施韦尔根，2005
CRYSOL	Svergun 等，1995
PRIMUS	Konarev 等，2003
EOM	Tria 等，2015