Cryptococcal 物种多糖荚膜和细胞体的自动测量

摘要

该技术描述了一种用于测量多糖荚膜和菌体半径的自动化批量图像处理程序。尽管该程序最初是为Cryptococcus neoformans的荚膜测量而设计，但其自动化图像处理功能也可应用于其他基于对比度的圆形物体检测。

摘要

该技术的目的是为大量多糖荚膜的测量提供一种一致、准确且可操作的流程。

首先，基于为每幅图像唯一计算的强度值生成阈值图像。然后，利用成熟的圆霍夫变换（Circle Hough Transformation, CHT）算法，根据物体与背景之间的对比度检测圆形。最后，根据中心坐标和半径大小将检测到的细胞荚膜与细胞体进行匹配，并将数据以易于管理的电子表格形式导出给用户。

该技术的优势虽然简单但意义重大。首先，由于这些计算由算法而非人工完成，准确性和可靠性均得到提高。无论分析多少样本，准确性和可靠性均不会下降。其次，该方法为隐球菌（Cryptococcus）研究领域建立了潜在的标准操作流程，取代了目前各实验室间荚膜测量方法不一的现状。第三，鉴于人工荚膜测量过程缓慢且单调，自动化技术可实现对大量酵母细胞的快速测量，从而促进高通量数据分析并获得更强大的统计学结果。

该技术的主要局限性源于算法的工作原理。首先，该算法仅能生成圆形。尽管隐球菌（Cryptococcus）细胞及其荚膜呈圆形形态，但此技术难以应用于非圆形物体的检测。其次，由于圆形的检测方式，霍夫圆变换（CHT）算法可能基于多个聚集圆形的外缘检测出巨大的伪圆形。然而，任何被包含在伪圆形内的错误识别的细胞结构均可被轻易识别并从最终数据集中剔除。

本技术旨在通过印度墨水明场显微镜法测量Cryptococcus物种的环状多糖荚膜；尽管该方法也可应用于其他基于对比度的环状物体测量。

引言

Cryptococcus neoformans 是一种在全球范围内普遍存在的致病性酵母菌，主要在免疫功能低下的人群中引发人类疾病。C. neoformans 尤其是撒哈拉以南非洲地区因感染性疾病导致年度死亡的重要病因之一¹。隐球菌感染的主要临床表现为脑膜脑炎，其发生机制为受感染的巨噬细胞以“特洛伊木马”方式携带病原体侵入中枢神经系统，或病原体直接穿越血脑屏障。C. neoformans 表达多种毒力因子，包括在人体体温下复制的能力、脲酶活性、黑色素形成以及多糖荚膜的生成²。该多糖荚膜由重复的葡醛甘露聚糖（glucuronoxylomannan）和葡醛甘露聚半乳糖（glucoronoxylomannangalactan）聚合物组成，可作为保护性屏障，抵御环境应激和宿主免疫应答等因素的攻击²。

尽管隐球菌多糖荚膜的大小与毒力之间的关联并不一致，但已有证据表明荚膜大小是致病过程中的一个影响因素^2,3,4,5,6,7。荚膜大小与脑膜炎病理相关⁶，可影响巨噬细胞控制隐球菌（Cryptococcus）感染的能力⁵，若缺失则可能导致毒力丧失⁸。因此，在隐球菌研究中，荚膜大小的测量十分常见，但目前该领域尚无统一的荚膜测量方法标准。

目前，C. neoformans 多糖荚膜的测量依赖于对显微镜图像进行人工测量，而不同实验室在图像获取和测量方法上存在差异^9,10,11。该方法的一个直接问题是，某些研究需要获取数千个单独的测量数据，这使得保持准确性和可靠性变得困难。此外，即使结果已发表，测量方法的描述也常常不够充分。许多出版物并未说明其测量是如何获得的、使用了哪个焦平面、如何确定荚膜识别的阈值、采用的是半径还是直径、是单次测量还是多次测量取平均值，或其他细节。一些出版物仅说明所使用的程序，例如"使用 Adobe Photoshop CS3 测量细胞"¹¹。这种缺乏标准化和详细报告的情况可能导致实验难以甚至无法重复。人眼视力、计算机亮度、显微镜设置、载玻片照明以及其他因素不仅在不同个体之间存在差异，也在不同样本之间变化，而基于像素强度值比率的计算则可在样本间保持恒定和适用。本技术的开发旨在为此前尚无标准方法的领域提供一种标准化、准确、快速且简便的荚膜尺寸测量方法。

如前所述，CHT 算法已有较长历史，此前已有用于自动检测圆形的脚本。本方法在两个方面优于其他脚本。首先，仅检测圆形并不足够，因为隐球菌细胞需要检测两个相互关联的同心圆结构。本方法可特异性识别荚膜内的细胞本体，区分两者，并仅对相关的细胞本体-荚膜配对进行计算。其次，即使遵循相同实验方案，不同研究人员获得的图像仍可能存在差异。通过允许研究人员控制算法的每一个参数，该工具可针对多种图像采集方法进行调整，无需统一使用标准化的显微镜、物镜、滤光片等设备。

该技术可广泛应用于研究者需要在图像中检测与背景形成对比的圆形物体的任何情况。无论是比背景亮还是比背景暗的圆形，均可通过此技术进行检测、计数和测量。

方案

1. 墨汁涂片的制备

1. 用移液器吸取10 µL隐球菌样品滴加到载玻片上。任何圆形酵母菌株均可使用，但本实验仅使用了H99菌株。
   注意：如果样品直接来自培养基，用PBS或水按1:2比例稀释有助于防止印度墨水发生凝集。
2. 将2 µL印度墨水染液滴加到样品上，通过用移液器枪头轻压样品并以圆形方式移动，直至印度墨水均匀分布。
3. 将盖玻片覆盖在样品上：用手按住盖玻片左侧边缘紧贴载玻片表面，然后缓慢而均匀地放下另一侧，使盖玻片覆盖样品。
4. 让载玻片在空气中干燥5分钟。
5. 轻轻在盖玻片边缘涂一层薄薄的指甲油，以形成密封，保存印度墨水染色效果。

2. 成像载玻片

1. 将载玻片置于配备摄像头和已知像素-微米转换率的明场显微镜下。调整滤光片、物镜和对比度，使细胞荚膜清晰可见，细胞体呈现为聚焦良好的暗带。
   注意：多种滤光片、物镜和对比度设置均可使用，但推荐采用20倍物镜、Ph1滤光片和2×2像素合并（binning）。
2. 确保视野中隐球菌细胞密度适中，不过于密集，细胞荚膜与背景之间对比清晰，细胞体聚焦良好并呈现为明显的暗带。
   注意：最佳图像所需的细胞数量因样本和所用物镜而异。关键要点是确保细胞不聚集或重叠，细胞的焦平面无明显差异，且背景中印度墨汁染色清晰可见（至少占视野的25%）。
3. 将图像保存至一个单独的文件夹，并使用清晰的文件名命名，因为测量算法将在该文件夹内的所有图像上运行，输出数据将根据图像文件名进行组织。

3. 算法设置

1. 从
2. 通过运行命令 "pip install pillow" 和 "pip install openpyxl" 安装额外的 Python 库。
3. 按照
4. 根据 https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html 提供的说明构建 MATLAB Python 库。
5. 下载本文稿件补充材料中包含的三个必需文件（"QCA.py"、"Analysis2.m" 和 "TestRun.m"）。
   注意：这些文件可以解压到任意位置，但三个文件必须位于同一目录中。

4. 算法的使用

1. 双击 QCA.py 运行应用程序。
   ​注意：应用程序启动可能需要几分钟时间。 "QCA.py" 文件包含调用程序结构的 "." 用于运行实际算法的文件。
2. 按照程序中概述的步骤进行操作。
   1. 输入图像文件的扩展名，每个扩展名前加一个句点，并用分号隔开（例如。 ".TIF；.jpeg"然后点击 输入 按钮
   2. 单击以选择图像文件所在的目录 选择目录 按钮并选择包含图像的文件夹。
   3. 单击目录以生成图像文件列表 生成图像列表 按钮。图像将列在右侧的文本框中。请检查并确保列表准确且完整。
   4. 从列表中随机选择一张图像，通过点击将其用作预览 选择随机图像 按钮。
      注意：如果图像因某种原因无法打开， "图像模式错误" 尽管不显示图像，算法仍会正常运行。在步骤 4.2.7 之后，测试图像仍会显示。
   5. 输入显微镜物镜和 binning 设置。如果默认设置与所用显微镜不符，请选择 "自定义像素转换" 并输入图像文件的像素到微米（pixel-to-μm）转换系数。选择后，点击 计算转化率 按钮，并根据右侧文本框中的内容确保转换正确。
      ​注意：图中所示为代表性图像 图1 使用40倍放大倍数和2×2像素合并模式进行计算。
   6. 输入用于圆检测的算法参数。
      1. 输入外囊检测可识别的最小和最大半径，分别作为“最小囊半径”和“最大囊半径”。较小的范围可获得更准确的结果。
      2. 在“最小细胞体半径”和“最大细胞体半径”输入框中，分别输入细胞体检测可识别的最小和最大半径值。
         注意：这四个条目均应为数字，表示其在源图像中的对应像素值。
      3. 移动“胶囊”和“细胞体敏感度”滑块以调整算法的敏感度阈值。较低的敏感度设置较为严格，可减少假阳性圆圈的检测，但也可能导致真实圆圈的检出数量减少。相反，较高的敏感度会提高检测率，但可能增加假阳性圆圈的出现。
         ​注：代表性结果采用的参数为胶囊最小半径7、最大半径45，物体最小半径4、最大半径30，胶囊敏感度87，物体敏感度87。
   7. 通过点击随机选择的图像来测试参数 运行测试 按钮。结果将显示在程序的上方中央位置，取代原始图像。如果结果显示准确，建议再选择另一张随机图像进行尝试，以确保所选参数适用于所有选定的图像。
      1. 最大化检测到的细胞核和囊状结构数量，并目视检查圆形标记是否拟合正确。检测到的囊内细胞核数量将显示在右侧的文本框中。若不符合，调整算法参数直至结果准确。
         注意：彩色粗线圆圈仅用于辅助可视化。实际用于测量的圆圈是由HCT算法计算得出的数学曲线。
   8. 单击以在整个图像文件目录上运行检测算法 开始分析 按钮。每张图像都将被分析，程序将显示 "完成" 在所有图像分析完成后，于右侧文本框中进行填写。
   9. 点击 匹配与清理 按钮。此操作将把检测到的细胞体与它们所在的检测胶囊进行匹配，并通过从胶囊中减去细胞体来计算真实的胶囊半径。
      注意：如果该算法用于检测荧光或其他仅检测到一个圆的情况，则此步骤无需执行。相反，请单击 仅拉动躯干部分 或 仅拉取胶囊 分别点击按钮以仅收集蓝色或绿色圆圈的数据。需要注意的是，如果仅获取胶囊数据，则半径将指细胞的总半径，因为无法扣除细胞体本身的半径。
   10. 在以下位置找到已完成的数据 "CleanedOuput.csv" 图像目录中的文件。如果仅选择了一组数据，文件将被标记为 "CleanedBodies.csv" 或 "CleanedCapsules.csv".

结果

首先使用明场显微镜结合相机对印度墨水染色的玻片进行显微成像，以获取图像（图1A）。为获得理想图像，应确保细胞分散且密度足够低，避免视野过于密集，同时使用足量染料以在细胞与背景之间形成良好对比。如实验方案所述，最佳图像所需的细胞数量会因样本、显微镜型号及所用物镜的不同而有所变化。关键要点包括：确保细胞不发生聚集或重叠，细胞的焦平面之间无明显差异，并且背景中可见明显的印度墨水染色（至少占视野的25%）。这些条件使算法能够通过计算平均像素强度值并加上标准差，为每幅图像确定一个独特的阈值。像素强度高于该阈值的被视为白色，低于该阈值的被视为黑色。由此生成的图像可清晰锐利地显示荚膜的边界（图1B）。算法据此获得一个具有强对比度的黑底白边圆形区域用于识别荚膜，而原始图像则提供一个白底黑边的圆形区域用于识别细胞本体。程序会生成一个代表性的检测圆可视化图（图1

讨论

该技术的关键步骤是制备印度墨水玻片和获取显微镜图像。尽管该算法已成功应用于多种玻片和成像技术，本文所述为推荐的实验方案。多糖荚膜的检测基于印度墨水颗粒无法进入荚膜区域的原理，因为这些颗粒过大，无法穿透多糖纤维网络。印度墨水被排除后，在深色背景上形成明亮的环状区域。算法通过检测环状结构与其背景之间的对比度来识别圆形。因此，较浓的印度墨水染色可提高多糖荚膜与背景之间的对比度，从而提升信噪比，改善结果质量。相反，细胞本体则表现为明亮背景上的暗色圆形。细胞本体的形态会因显微镜焦平面的设置不同而变化，在细胞顶部或底部时呈现为弥散的灰色圆形，而在中心位置时则表现为致密的暗带。基于上述相同原因，图像采集时应选择细胞本体呈现为致密暗带的焦平面，以获得最准确的圆形检测结果。

本文所报道的方法经过了多次修改和故障排查。该算法最初编写时，基于所使用的显微镜，预期细胞大小不会小于4像素或大于60像素。为了将该算法的应用扩展到不同的放大倍数和细胞尺寸，这些固定限制已被本方案中描述的用户输入字段所取代。用户现在可以针对每个实验输入特定参数，以实现最高准确性。如果将该算法应用于Cryptococcus<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
印度墨水	Becton, Dickinson and Co.	261194
Fisherbrand Superfrost 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-143	25x75x1
Fisherfinest 高级盖玻片	Fisher Scientific	12-548-B	22x22-1
Sally Hansen Hard as Nails Xtreme Wear 指甲油	Sally Hansen	N/A	109 不可见
SAB培养基	Sigma	S3306
新型隐球菌	ATCC	208821	H99 菌株
奥林巴斯 AX70 显微镜	Olympus	AX70TRF	已停用；明场显微镜
Qimaging Retiga 1300	Qimaging	N/A	已停用；显微镜相机附件
MATLAB	MathWorks	N/A	推荐使用最新版本
Python 编程语言	Python	N/A	版本2必要；推荐2.7
Microsoft Excel	微软	N/A	推荐使用最新版本
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P3813