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人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

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DOI：

10.3791/56960

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2017年12月18日

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1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

本文内容

摘要

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。

摘要

通过活检获取的肠道组织或由多能干细胞经定向分化生成的肠道组织，其三维培养技术的进展已带来复杂的 体外 肠道黏膜模型。利用这些新兴的模型系统需要对原本为二维培养系统和动物模型开发的工具与技术进行适应性调整。本文介绍了一种实时测量人肠道类器官上皮屏障通透性的技术。该技术通过显微注射荧光标记的葡聚糖，并在配备落射荧光滤光片的倒置显微镜下进行成像来实现。对肠道类器官屏障通透性进行实时测量，有助于在人肠道上皮组织中获得高分辨率的时间序列数据，尽管该技术也可应用于固定时间点的成像分析。本方案可轻松适用于检测药物制剂、细菌产物或毒素，以及活体微生物处理后上皮屏障通透性的变化。经过少量修改后，本方案也可作为肠道类器官显微注射的基本操作指南，使用者可根据需要在显微注射后结合其他或替代性的下游应用。

引言

肠上皮形成一种选择性屏障，介导营养物质、H2O₂、离子和代谢废物，同时尽量减少管腔与间质组织或血液供应之间通过非特异性扩散介导的其他颗粒的交换1,2肠道上皮屏障的非特异性通透性长期以来一直被视为健康和疾病状态下的一项关键功能参数。3,4,5,6，反映了小分子通过上皮细胞旁路间隙的扩散速率。上皮屏障通透性的测定可在动物模型中进行7 以及在人类患者中8 通过摄入乳果糖（乳果糖在胃肠道中无特异性转运体），随后采集并测定外周血中乳果糖的浓度。其他可用于评估屏障功能的摄入型标志物，如荧光标记的碳水化合物，也可使用。9,10该方法已针对在Transwell支持物上培养的肠上皮细胞模型进行了优化11，一种简化的研究方法，虽能提高实验控制性，但因其对……的预测能力较差而受到批评 体内 由于缺乏分化的上皮亚型和组织结构而导致通透性12使用腔室代表了另一种方法，可实现对完整肠黏膜上皮屏障功能的测定 离体13该技术的应用常因组织的可获得性及状态而受限13,14因此，有必要开发新的方法，以在可重复性、通量与生理相关性之间取得平衡。

近期进展 体外 器官发生研究已促使三维组织培养模型系统被采纳为一种复杂组织动态重建的先进平台15,16,17,18,19,20,21,22,23特别是由人多能干细胞（hPSC）衍生的人肠类器官（HIOs）19,24 已成为研究宿主-微生物相互作用和上皮屏障动态的可重复且实验上易于操作的模型系统25,26,27,28类似地，来源于人体组织的类器官（也称为肠类器官）可通过简单的活检手术获取，并可作为研究人体生理学和疾病的可操作体系。15,29,30人类肠道类器官的显微注射可实现实验化合物的递送25 或活的微生物25,31,32,33 类器官腔内顶端上皮表面。Leslie 和 Huang 等25 最近采用该技术，在暴露于细菌毒素后，通过向人肠道类器官（HIOs）显微注射荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖来测量屏障通透性。

本方案旨在为利用荧光显微镜检测人多能干细胞（hPSC）来源的类肠器官（HIOs）及组织来源的类肠器官（HIOs）上皮屏障通透性提供操作指南。经过少量修改后，本方案也可作为向HIOs显微注射实验化合物的基本操作参考。用户可在显微注射后，结合本方案补充其他或替代性的下游应用。

方案

正常、去标识化的人类成人肠道组织通过密歇根州“生命馈赠”（Gift of Life）机构从已故器官捐献者获取。人类胚胎干细胞系H9（NIH注册号 #0062）购自WiCell研究所。本研究中使用的所有人类组织均来自非存活捐献者，已去标识化，并经密歇根大学机构审查委员会（IRB）批准（方案编号 #HUM00093465 和 HUM00105750）。

1. 显微注射仪设置

  1. 获取材料表中列出的材料。
  2. 将显微操作仪、解剖显微镜和光源放置于生物安全柜内。实验使用前，用70%乙醇或其他消毒剂清洁显微注射装置。避免长时间接触含次氯酸盐的消毒剂，以免腐蚀显微注射设备。
    注：完整的显微注射装置示例见图1。
  3. 调整解剖显微镜位置，使目镜可通过生物安全柜屏蔽装置上的操作口进行观察。
    1. 也可使用带有正压气流系统的洁净工作台替代具有显微镜操作口的生物安全柜。
  4. 根据制造商说明书将显微操作仪安装在显微镜右侧，并调整至操作者可方便触及和调节控制部件。显微操作仪应固定在铁板上或采取其他方式稳定。
    注：左利手使用者可将显微操作仪置于解剖显微镜左侧。
  5. 将微吸管夹持器安装至显微操作仪机械臂上，并通过将其插入微吸管夹持器来连接模拟输液管。
  6. 用无菌矿物油填充10 mL玻璃注射器，体积约为5–7 mL。
  7. 使用鲁尔锁紧接头（Luer lock）将装有矿物油的10 mL玻璃注射器连接至模拟输液管的开放端。将玻璃注射器置于解剖显微镜左侧，与显微操作仪相对。
  8. 轻柔推动注射器，使矿物油流经输液管。从微吸管夹持器尖端排出约10滴矿物油，用培养皿或其他容器收集后弃去。
    注：此步骤旨在排除输液管中所有空气，每次显微注射前均应执行。

2. 显微注射的准备工作

  1. 显微注射前24小时：
    1. 通过将FITC葡聚糖以2 mg/mL的浓度溶于无菌PBS或生理盐水中，制备FITC葡聚糖溶液。总体积需准备>250 µL。
      注意：可使用更高或更低浓度的FITC-葡聚糖，范围约为0.1 - 10 mg/mL。根据后续成像应用的需求调整FITC-葡聚糖的浓度。
    2. 将类器官培养于4孔或8孔玻璃底共聚焦培养皿或其他适用于活细胞显微成像的培养容器中，每孔放置4-6个HIO，嵌入50 µL细胞基质溶液中，并在含EGF、Noggin和R-Spondin（ENR）生长因子的培养基中培养19,24。注意将类器官均匀分布（间距约5 mm），以避免在实时成像分析时单个显微视野中包含多个HIO。有关HIO培养与维持的完整指南，请参见McCraken et al.24。
      注意：本方案使用干细胞来源的HIO开发，代表性结果（见下文）展示了该组织培养模型的应用。然而，该方案也可轻松适用于组织来源的肠上皮类器官15,29。组织来源的HIO通常比PSC来源的HIO更小，且缺乏支持性的间充质基底外侧细胞结构15,29,30。对组织来源HIO进行显微注射可能需要更高的技术水平和经验。目前尚不清楚使用组织来源HIO获得的上皮屏障通透性数据与hPSC来源HIO之间的相关性程度。
    3. 显微注射前，将HIO置于标准细胞培养箱中，在42 °C、5% CO2 条件下孵育。
  2. 显微注射前30分钟，开启生物安全柜并将玻璃挡板升至最佳操作高度。
  3. 从生物安全柜中移除所有不必要的物品。杂乱会增加在狭小空间内操作时发生洒漏或其他事故的风险。
  4. 使用70%乙醇或其他消毒剂喷洒并彻底清洁工作台面，再用纸巾擦拭干净。
  5. 检查连接至显微注射仪的玻璃注射器中矿物油的液位。若剩余矿物油少于3 mL，应拧下注射器，并在生物安全柜内重新填充，注意避免引入气泡。填充量不得超过7 mL。
  6. 打开光源以照亮解剖显微镜。根据个人舒适度调节目镜。
  7. 将显微操作仪置于解剖显微镜右侧。使用磁性支架将显微操作仪固定在铁板上。先将磁性支架设为“关闭”状态以调整显微操作仪位置，然后将其设为“开启”状态，使支架牢固吸附于铁板。
  8. 微毛细管安装
    1. 从制造商提供的储存容器中取出一根1 mm玻璃丝。
    2. 将玻璃丝穿过微移液管拉制仪的铜制加热线圈中心。
      注意：参见图2了解微移液管拉制仪的准备方法。
    3. 调整玻璃丝位置，使铜制加热线圈大致位于玻璃丝中央。这将确保拉制仪每次可从一根玻璃丝拉制出两根可用的显微注射针。
    4. 使用夹具固定玻璃丝，先拧紧顶部夹具，确保玻璃丝卡入凹槽内，以防断裂。
    5. 在拧紧底部夹具前，先将拉制臂伸展至最大垂直位置。
      注意：此步骤至关重要。若未完全伸展拉制臂，将导致玻璃丝两段分离不规则。
    6. 检查加热和拉制装置的设置。使用拨动开关选择Heat #1（990），并将PULL设为059（图2）。
    7. 使用电源开关启动仪器。
    8. 关闭防护有机玻璃罩，按下拉制仪右下角的PULL按钮。铜线圈开始加热并发出明亮的橙色光。随着温度升高，玻璃丝开始拉伸并最终分离。当玻璃丝两端完全分离后，仪器将自动关闭。
      注意：铜线圈在数分钟内仍会保持极高温度。此后拉制完成的玻璃毛细管在本方案中统称为“微毛细管”。
    9. 小心避免触碰铜线圈，取下其中一根玻璃微毛细管。微毛细管应具有极细的尖端。使用乳胶或丁腈手套小心操作，并立即转移至装有显微注射系统的生物安全柜内。
      注意：玻璃微毛细管极为尖锐且易碎，需谨慎操作。
    10. 松开显微操作臂的端盖。将拉制后的微毛细管钝端插入微移液管夹持器的开口端，并向内推入直至无法再推进。
    11. 重新拧紧端盖，将微毛细管的钝端固定在显微操作臂上。
      注意：安装微毛细管时，务必避免触碰其 sharpened 端。这有助于减少污染风险，并保持尖端精细，以利于显微注射。若未正确固定微毛细管，可能导致注射过程中玻璃丝不稳定或断裂。
    12. 打开玻璃微毛细管的尖端。在拉制过程中，微毛细管尖端可能因熔融而封闭。为清除堵塞：
      1. 调整显微操作仪，使微毛细管垂直向下指向解剖显微镜的玻璃载物台，但不接触该表面。
      2. 寻找一个无菌塑料表面（培养皿盖的底面非常合适），将其放置在解剖显微镜载物台上，正对微毛细管针尖下方。
      3. 将微毛细管尖端置于观察区域中央，并确保在1.5倍放大倍率下通过目镜可清晰看到。
      4. 使用显微操作仪控制装置，缓慢推进操作臂及微毛细管，使其尖端轻轻接触无菌塑料表面，直至尖端断裂脱落。
        注意：应力求产生最小的断裂口，仅足以允许液体流动，以最大程度减少显微注射过程中对HIO的损伤。
      5. 将微毛细管从无菌表面后撤，以降低在下一步操作前意外断裂的风险。
      6. 通过按压玻璃注射器推动矿物油流经管路，检查微毛细管是否通畅。若尖端已打开，数秒后可在微毛细管尖端观察到微小的矿物油滴。若未出现油滴，需重复上一步骤并重新测试。

3. 无菌显微注射

注意：微毛细管制备、安装和测试完成后，开始对人肠道类器官（HIOs）进行显微注射。图3展示了一个成功注射了FITC-葡聚糖的组织来源人肠道类器官（HIO）。

  1. 用注射材料填充微毛细管。将玻璃微毛细管的尖端浸入FITC葡聚糖注射悬浮液中，注意避免微毛细管尖端与管壁或管底碰撞而断裂。一旦微毛细管尖端浸入溶液中，回拉矿物油注射器，吸取约 10 µL FITC葡聚糖悬浮液注入微毛细管中。
    注意：建议使用1.5 mL或0.5 mL离心管盛装注射溶液/培养物，因为这些规格的管子最便于微毛细管接触。 Alternatively，注射溶液也可从无菌培养皿或无菌Parafilm膜上吸取，这样可减少手持离心管靠近微毛细管的操作，从而降低锐器伤的风险。如果悬浮液黏度过高，或微毛细管开口极小，可能需要数秒时间才能完成填充。切勿将显微注射悬浮液吸入塑料显微注射导管中，以免污染整个显微注射系统。
  2. 当显微注射悬浮液填充至玻璃毛细管长度的90%时，停止填充。在将毛细管从显微注射溶液中取出前，轻微按压注射器，以确保毛细管尖端不残留气泡。
    注意：若显微毛细管中发现有气泡，应排空后重新填充。
  3. 将HIO培养板从细胞培养箱中取出，转移至配备显微注射仪的生物安全柜中。
  4. 在生物安全柜内打开HIO培养板的盖子，将第一个孔置于显微镜载物台上居中位置，确保在最低放大倍数下通过目镜可清晰观察到该孔。
  5. 将显微操作臂旋转，使微毛细管以一定角度向下指向HIO培养孔 >45° 相对于显微镜载物台。最简便的方法是在水平微操作臂支撑与垂直支架连接处，手动旋转微操作臂组件的水平轴，因为精细控制旋钮（黑色旋钮）的活动范围有限。将微毛细管尖端置于第一个培养孔上方，距离培养基液面约1 cm处。图3A显示组织来源的肠上皮类器官显微注射的代表性图像如图所示 图3B.
  6. 检查玻璃细丝尖端和HIO(s)是否均能在目镜中看到，必要时重新调整位置。
  7. 缓慢顺时针转动Z轴控制旋钮，推进微毛细管。
    注意：判断微毛细管尖端的位置，尤其是其深度，需要一定的操作经验。当尖端穿过培养基表面时，可观察到微毛细管尖端出现轻微的视觉畸变。此后应谨慎推进，避免微毛细管与培养板底部碰撞而断裂，或损伤类器官（HIOs）。
  8. 用微毛细管尖端刺穿HIO。当微毛细管开始施加压力时，HIO的外表面会轻微下陷，并在尖端进入管腔时迅速恢复原状。微毛细管尖端在HIO管腔内可能难以辨识。若观察微毛细管存在困难，可调整解剖显微镜的照明或放大倍数设置。
  9. 当微毛细管尖端准确地位于HIO中心附近时，将手从显微操作仪控制器上移开。
  10. 轻轻按压矿物油注射器，将显微注射液从显微毛细管推出并注入HIO腔内。HIO可能会轻微膨胀以容纳注射液体的体积。
    注意：注意避免过度填充 HIO，否则会导致类器官破裂。根据经验，只要观察到 HIO 体积出现明显扩张，即应停止填充。成熟 HIO 管腔的平均体积约为 1 µL，但可能有显著差异。可使用自动注射泵代替手动注射器，以精确控制注射体积。
  11. 使用Z轴控制将微毛细管从HIO中撤出，并移至培养基表面的上方。
  12. 将微毛细管移至下一个HIO靶点，移动时保持微毛细管位于培养基上方，以避免操作过程中意外损伤HIO，随后以类似方式注射（参见步骤3.6–3.11）。
    1. 使用上述方法重新填充微毛细管。
      注意：显微注射过程中，若针尖发生断裂，切勿继续注射。请根据下述说明更换针尖。
  13. 在不同处理之间或发生破损时更换微毛细管。松开显微操作臂末端的夹具，将微毛细管从微量移液器 holder 中取出。
    注意：请勿用手触碰微毛细管的尖端附近。微毛细管的尖端极为锋利，可轻易刺穿手套和皮肤。操作时应格外小心，注意所有动作，仅使用操纵器来处理微毛细管，切勿将手置于微毛细管尖端与HIO类器官培养物之间。若被含有传染性病原体或毒素的微毛细管刺伤，应立即寻求医疗救治。
    注意：在某些情况下，可能难以通过视觉确认HIO显微注射是否成功。可通过添加更高浓度的FITC-葡聚糖以增强透明注射悬浮液的可见性。

4. 人源类器官的药物处理

  1. 为了检测递送至顶膜上皮的化合物，将其重悬于含有 2 mg/mL FITC-葡聚糖的无菌 PBS 中，并按照上述方法（第 3 节）微量注射到 HIO 腔内。在代表性实验中，将 Clostridium difficile 毒素 TcdA 以 12.8 ng/µL 的浓度溶于含 FITC-葡聚糖的 PBS 中。
  2. 为了检测递送至基底外侧区室的化合物，在微量注射 FITC-葡聚糖后，将外部培养基更换为含有 2 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）（阳性对照）、仅含 PBS 载体（阴性对照）或其他实验化合物的新培养基。
    注意：药理学化合物、毒素或其他试剂的给药剂量和处理时间可能根据具体实验问题而有所不同。

5. 显微注射类器官的活体成像

  1. 显微注射后立即开始活体成像。将培养板转移至配备恒温保湿培养室的荧光显微镜中，保持温度为 37 °C 和 21% O2 和5% CO2 使用自动活细胞成像系统。关闭环境培养箱并启动成像过程。
  2. 从桌面启动图像分析软件（例如，softWoRx）。点击“File”，选择“Acquire (Resolve 3D)”以初始化成像和显微镜控制软件。
  3. 将激发/发射波长设为 FITC（475 nm 激发/523 nm 发射），透射光功率设为 5%，物镜设为 4X。曝光时间设为 0.025 ms图 4A).
    注意：应根据荧光信号的强弱调整曝光时间。通常情况下，FITC 荧光信号只会减弱。因此，为确保最大灵敏度，初始曝光时间应调整至所记录的荧光信号略低于相机和成像软件的饱和点。
  4. 使用显微镜附带的数字控制器在4倍放大倍数下找到HIO，并将HIO置于视野中央图 4A).
  5. 单击工具栏上的“View”，然后选择“Point list”以打开新窗口。单击“Mark point”将载物台当前位置保存到点列表中图 4A).
  6. 重复步骤 5.4 和 5.5，直至记录所有 HIO 的位置。使用纸质笔记本或电子记录，记录每个预设显微镜位置所分配的唯一 ID 编号以及在该位置拍摄的图像。图像文件将被标记为此 ID 编号，在数据采集完成后，必须将图像 ID 编号与特定的 HIO 及处理条件准确关联。
  7. 要设置自动图像采集，请在工具栏中点击“File”，然后点击“Experiment”。使用日期或其他唯一名称为实验命名。
  8. 通过查看每个选项卡来设置图像采集参数，如图所示 图 4B.
    1. 取消勾选“切片”选项卡下的“Z轴切片”。
    2. 在“通道”选项卡中，输入左上角“Resolve 3D”窗口中的参数。为节省时间，当左侧复选框被勾选时，第一行将自动填充。
    3. 在“延时”选项卡下，勾选标有“延时”的复选框，并在标有“延时”的行中输入图像间的时间间隔，在标有“总时长”的行中输入实验的总持续时间。软件将自动计算时间点的数量。
    4. 在“点”选项卡下，勾选标有“访问点列表”的复选框。您也可以在文本框中手动输入要包含在实验中的具体点编号。
    5. 请勿更改“面板”或“操作”选项卡下的默认设置。
  9. 点击“运行”选项卡。在标有“图像文件名”的框中输入实验日期，并在“设置”下设定数据保存位置。
  10. 单击绿色箭头以运行实验宏。时间推移计数器将跟踪实验进度。
  11. 在预定的时间点结束时，导出并保存所有图像文件为24位RGB TIFF图像（图4C).
    1. 在工具栏中，选择“处理”，然后选择“任务构建器”。
    2. 在任务构建器菜单中，通过导航至 5.9 中指定的数据文件夹来添加文件。在提示框中输入“*.dv”以高亮所有以“.dv”结尾的文件。全选（Ctl+A）后点击“添加”。
    3. 单击“任务”部分下方的“+”号。选择“导出为...”，然后点击“选项”标签页。
    4. 将“导出格式”设置为“TIFF 图像”，并勾选下方复选框以添加“自定义输出文件夹”。该文件夹为 TIFF 图像的导出位置。在“TIFF 输出类型”下选择 24 位 RGB，然后点击“完成”。
    5. 单击“提交到队列”以运行导出宏。
  12. 如果将在另一台计算机上进行成像后分析（第6节），请将5.11节导出的TIFF图像复制到外部驱动器或服务器。
    注意：HIO 组织和培养基可保存用于组织学分析34PCR35），蛋白质印迹36或其他下游分析。

6. 成像后分析

  1. 确保使用 ImageJ37 已安装并正常运行于用于分析的计算机上。
    注意：Fiji37 是 ImageJ 核心程序的一个替代版本，同样适用于本分析。
  2. 在 ImageJ 菜单中依次选择“Process”（处理）、“Batch”（批处理）和“Macro”（宏），以启动批处理分析。
  3. 将输入设置为包含实验时间过程中采集的TIFF图像的目录。打开“thesholdmeasure.ijm”ImageJ宏文件，或直接将宏代码复制粘贴到窗口中。点击“Process”以开始处理文件。
    注意：最小阈值 x （setThreshold(x,255);）可设置为0至255之间的任意数值，应调整该值以消除背景荧光。数值 <建议使用100。为了通过实验确定合适的阈值，可在代表无荧光信号类器官的单张图像上运行成像宏程序。该图像的平均强度可作为设定阈值的参考依据。在下文所示的代表性分析中，阈值设置为“42”。
  4. ImageJ 将生成一个包含阈值强度范围内所有像素面积以及该区域内平均值、中位数、最小值和最大值（极限）强度值的大型表格。请将其保存为 CSV 或 XLS 格式。
  5. 随时间变化的强度变化可在电子表格中进行计算39 通过操作数据表执行以下计算，或使用合适的编程语言实现自动化。以下是一个用 R 编写的分析脚本示例 40 随本手稿一并提供。
    注意：对于每个 HIO，可将相对荧光强度定量为 静态平衡比值公式；FIT Ct=n/FIT Ct=0；用于科研的教育示意图。消除时间 41 (t1/2HIO 腔内 FITC-葡聚糖的浓度按如下公式计算：
    1. 首先，计算“曲线下面积”（AUC) 从描述荧光强度随时间相对变化的曲线中（t）作为：
      AUC 计算公式，积分方程，药代动力学分析，FITC 浓度比
    2. 然后，计算 清除率 (化学势方程，ΔG=μCL-μCR，热力学示意图，自由能过程。) 与分布容积的比值（Vd) 定义为归一化荧光强度的1 t = 0:
      药代动力学方程，CL = Vd/AUC，给药示意图，药物清除率，分布容积分析
    3. 接下来，定义“消除速率常数”（elimination rate constant）库仑常数公式：\(k_e = \frac{1}{4\pi\varepsilon_0}\)；物理公式示意图）作为：
      药代动力学公式，消除速率常数 k_e，公式 k_e=CL/V_d，概念示意图。
    4. 最后，计算“消除时间”（t1/2）作为：
      半衰期方程 t1/2=ln(2)/ke，动力学过程，反应速率的化学动力学公式
      因此，简化后的方程为：
      半衰期方程，ln(2) 除以从 0 到 ∞ 的 FITC 衰减积分，用于荧光衰减分析的公式。

结果

HIOs 由人多能干细胞分化而来，并在细胞外基质溶液中进行培养，方法如前所述19,24培养4周后，HIOs已充分扩张，可进行显微注射。将HIOs显微注射含有4 kDa FITC标记的葡聚糖的PBS溶液，或仅含PBS的溶液 艰难梭菌 毒素 TcdA C. difficile 是一种机会性胃肠道病原体，可在人肠道类器官（HIOs）中表现出毒素介导的上皮细胞毒性25作为阳性对照，在部分注射了PBS和FITC-葡聚糖的HIO类器官中，向培养基中添加EGTA。EGTA是一种钙螯合剂，可引起肌动蛋白细胞骨架迅速去聚合。42在受控环境培养箱内的活细胞成像显微镜下实时监测FITC荧光，并以10分钟为间隔采集图像。

对成像数据的事后分析揭示了FITC荧光保留率存在显著差异（图5）。注射PBS的HIOs在t = 0时几乎保留了全部荧光信号，而同时注射TcdA或经EGTA处理的HIOs在显微注射后8小时荧光强度显著降低（图5A）。对所有HIOs在所有时间点的成像数据进行量化，生成了一个高分辨率数据集，用以表示每种实验条件下荧光强度随时间的相对变化（图5B）。通过计算每组处理的FITC平均消除时间（t1/2 ）并使用Student's t-检验比较各组间t1/2的差异，评估上皮通透性的变化（表1）。对照处理的HIOs在超过16小时内保留了大部分FITC荧光信号（t1/2 = 17 ± 0.3 h）。EGTA处理显著缩短了FITC-葡聚糖的消除时间，相较于对照HIOs（t1/2 = 2.6 ± 0.2 h；P = 1.3 × 10-8）。与先前发表的结果一致25，显微注射TcdA显著增加了上皮屏障通透性，相较于对照处理（t1/2 = 7.6 ± 0.6 h；P = 5.4 × 10-4）。因此，外部施加（EGTA）和显微注射（TcdA）的化合物均能引起HIOs中上皮屏障通透性的显著改变。这些结果表明，多种药物制剂、代谢物、细菌产物、细胞因子、生长因子及其他化合物对上皮屏障功能的影响均可通过该方法进行评估。

处理半衰期 (h)标准误 (h)95% 置信区间下限 (h)95% 置信区间上限 (h)n
对照17.110.316.4517.7811
EGTA2.580.191.783.383
TcdA7.560.635.939.186

表1：经EGTA或TcdA处理的HIO中FITC-葡聚糖的平均消除时间（t1/2）。单位为显微注射后的小时数。

显微操作装置，包括显微镜、显微注射仪和矿物油注射器；细胞注射研究。
图1：用于人肠道类器官（HIO）显微注射的显微注射仪与显微操作器的基本布局。 本图展示了进行HIO显微注射所用的全套设备。关键组件已标注，相关订购信息见材料表。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于精确制造微电极的电极拉制仪装置示意图，包含机械调节部件。
图 2：微电极拉制仪。 铜制加热线圈 hc、上夹具 c1、下夹具（c2）、拉制臂（pa）和加热选择拨动开关（ht）由箭头标示。HEAT 1 和 PULL 的正确设置值以红色文字标出。插图显示了正确安装的玻璃丝，已准备加热。 请点击此处查看该图的放大版本。

类胚体形成、微量移液转移（A）和显微图像（B），比例尺为 100 μm。
图3：注射了FITC-葡聚糖的组织来源人肠道类器官（HIO）的代表性图像。（A）显示玻璃微毛细管在插入HIO并进行显微注射前的定位图像。（B）显微注射FITC-葡聚糖后组织来源人肠道类器官的明场图像。请注意，即使不使用特定滤光片组，荧光信号依然清晰可见。这种显色有助于提高显微注射的精确性。3倍放大倍数 请点击此处查看该图的高清版本。

显微镜设置工作流程图；激发/发射、图像采集、TIFF 导出过程。
图 4：活体成像工作流程。（A）截图展示了设置显微镜参数、在载玻片上定位 HIO 以及保存每个待成像 HIO 对应载物台位置所需的步骤。（B）在 A 中指定的每个位置，以固定时间间隔采集 FITC 通道图像的成像前设置。（C）成像后将 DV 格式数据文件导出为 TIFF 图像，每个 HIO 在每个时间点对应一张 TIFF 图像。请点击此处查看该图的放大版本。

FITC-葡聚糖通透性实验结果；随时间变化的显微镜图像及强度图；EGTA，TcdA。
图5：代表性实验结果。（A）将2 mg/mL FITC-葡聚糖（4 kDa）显微注射入干细胞来源的人肠道类器官（HIO），并进行连续20小时成像。HIO同时接受PBS（对照）、艰难梭菌毒素TcdA（12.8 ng/µL）显微注射，或在外部培养基中添加2 mM EGTA处理。4倍放大。（B）PBS（对照）、TcdA或EGTA处理的HIO中，归一化FITC平均强度随时间变化的曲线图。误差条表示标准误（S.E.M.），n = 11个HIO（对照组），3个HIO（EGTA组），6个HIO（TcdA组）。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本方案建立了一种通用方法，用于对人多能干细胞（hPSC）来源的类肠体（HIOs）以及组织来源的肠道类器官进行显微注射，并实时测量上皮屏障通透性。我们还展示了如何分析和解读采用这些方法所获得的数据。鉴于肠道类器官模型系统日益广泛的应用16,20,21,28，以及长期以来对肠道屏障通透性作为生理相关功能性指标的研究兴趣3,4,5,6，我们预计本领域的其他研究人员将能够应用并在此方法基础上进一步拓展研究。

该技术的应用中有若干关键步骤。在进行大量显微注射实验之前，应确保能够获得高质量的源自人多能干细胞（hPSC）或组织的类器官（HIO）组织。尽管采用既定方法生成的HIO在组织身份和细胞形态上具有高度可重复性，但其宏观结构可能存在异质性，表现为大小和形状的差异24。理想的用于显微注射及实时腔内荧光检测的HIO应呈球形，具有单一半透明腔室，直径约为1 mm。在某些情况下，显微注射可能失败，导致HIO塌陷或注入物质明显泄漏。用户可根据需要使用标准微量移液器将失败的HIO从培养孔中移除。在选择用于显微注射和成像的HIO时，需考虑成像平台所配备的物镜。通常，2–4X物镜最适合完整捕获HIO的荧光信号；但如果低倍物镜不可用，或所用HIO直径<1 mm，则可使用10X物镜。成像软件必须支持在设定的时间点自动采集荧光图像。

为了满足实验需求，本方案有多种可能的修改方式。例如，屏障功能检测的结果可能取决于所用化合物的分子大小43，因此可考虑测试不同分子量的葡聚糖制剂。此外，除荧光成像外，还可进行明场成像，以评估组织的整体结构完整性25。在进行活菌显微注射时25,28,31,32,33,44，可能需要在显微注射前或注射后向HIO培养基中添加青霉素和链霉素或庆大霉素。显微毛细管外壁在填充细菌培养悬液时会被污染，这可能导致污染物转移至HIO培养基中。另一种方法是将HIO悬浮于细胞外基质（例如Matrigel）中且不加培养基的情况下进行显微注射，并在注射完成后添加培养基。此方法可将污染限制于细胞外基质及HIO的外部表面。在设计微生物生长实验时，可能需要在显微注射后1 - 2 h内去除培养基中的抗生素，以避免抑制或阻碍显微注射微生物的生长。

最后，需要认识到并非所有研究人员都能获得适用于体外成像的显微镜设备，因此有必要指出，本实验方案中所述的荧光数据采集步骤也可应用于使用标准落射荧光显微镜在固定时间点拍摄的图像，无需自动图像采集或环境控制装置。此类方法的实例可见于 Leslie 和 Huang 等25 的研究，他们检测了人多能干细胞（hPSC）来源的肠类器官中C. difficile毒素的活性；以及 Karve 和 Pradan 等44 的研究，他们通过显微注射将活的E. coli注入类似的hPSC来源肠类器官，并检测了上皮屏障通透性。手动操作成像设备可能导致荧光信号的变异增大且标准化困难。在对注射了FITC-葡聚糖的HIOs进行手动成像时，必须在整个实验过程中保持固定的放大倍数、荧光激发强度和曝光时间，以避免荧光强度测量值发生失真。

披露

作者声明无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 Stephanie Spohn 博士和 Basel Abuaita 博士在类器官显微注射方面提供的诸多有益讨论。JRS 由肠道干细胞联盟（Intestinal Stem Cell Consortium，U01DK103141）资助，该项目由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）和美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）共同资助。JRS 和 VBY 由美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助的肠道疾病新型替代模型系统联盟（Novel, Alternative Model Systems for Enteric Diseases, NAMSED，U19AI116482）提供支持。DRH 获得美国国家过敏与传染病研究所（NIAID, T32AI007528）资助的微生物致病机制培训项目以及密歇根临床与健康研究所（Michigan Institute for Clinical and Health Research）获得的临床与转化科学奖（UL1TR000433）的支持。

本研究中使用的完整数据文件和数据分析代码可在 https://github.com/hilldr/HIO_microinjection 获取。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EGTA 0.5 M 无菌溶液（pH 8.0）Bioworld405200081
细胞外基质溶液（Matrigel）Corning354230
Deltavision RT 活细胞成像系统GE Life Sciences29065728http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
相机GE Life Sciences29065728包含于 Deltavision 系统中
softWoRx 成像软件GE Life Sciences29065728包含于 Deltavision 系统中
生物安全柜LabconcoCell Logic+http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
1× PBSLife Technologies10010-023
高级 DMEM-F12 培养基Life Technologies12634-010ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 24
B27 补充剂（50×）Life Technologies17504044ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 24
L-谷氨酰胺（100×）Life Technologies25030-081ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 24
HEPES 缓冲液Life Technologies15630080ENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 24
显微操作器NarshgeUM-3C
微操纵器NarshgeUM-1PF
移液管架NarshgeUP-1可替代 Xenoworks 移液管架
磁力支架NarshgeGJ-1
解剖显微镜OlympusSX61推荐型号，其他型号也可能兼容
Olympus IX71 荧光显微镜OlympusIX71包含于 Deltavision 系统中
CoolSNAP HQ2 相机Photometrics29065728包含于 Deltavision 系统中
重组 C. difficile 毒素 A/TcdA 蛋白R&D Systems8619-GT-020
EGFR&D Systems236-EGENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 24
R-spondin 1R&D Systems4645-RSENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 24
NogginR&D Systems6057-NGENR 培养基组分；参见 McCraken 等人 24
矿物油Sigma-AldrichM8410
FITC-葡聚糖（4 kDa）Sigma-Aldrich46944
微电极拉制仪Sutter InstrumentsP-30
Nunc Lab-Tek II 培养皿载玻片ThermoFisher Scientific154526PK
玻璃毛细管丝WPITW100F-4
微移液管架XenoworksBR-MH2首选设备
模拟管路套件XenoworksBR-AT
1/16 英寸透明卡环XenoworksV001104
1-1.2 mm O 型圈XenoworksV300450

参考文献

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FITC

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