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高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

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DOI：

10.3791/56969

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2018年8月28日

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1Department of Biochemistry, Purdue University

本文内容

摘要

在模式生物Danio rerio（斑马鱼）中，基于CRISPR的技术的出现极大地促进了靶向基因组编辑。本文介绍了一种简化且稳健的实验方案，用于生成和鉴定CRISPR诱导的无义等位基因，该方案结合了异源双链迁移率分析法以及利用高通量测序进行突变鉴定。

摘要

对Streptococcus pyogenes的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统进行表征，使得开发一种可定制的平台成为可能，该平台能够快速在多种生物体（包括斑马鱼）中实现基因修饰。基于CRISPR的基因组编辑利用单链引导RNA（sgRNA）将CRISPR相关（Cas）核酸酶靶向至特定的基因组DNA（gDNA）位点，在该位点Cas核酸酶产生双链断裂（DSB）。通过易错机制修复DSB会导致插入和/或缺失（indels）。这可能引起移码突变，通常在编码序列中引入提前终止密码子，从而产生无功能蛋白的等位基因。基于CRISPR的基因组工程仅需少数几种分子组分，并可通过显微注射轻松导入斑马鱼胚胎中。本实验方案描述了用于制备斑马鱼显微注射用CRISPR试剂以及鉴定具有CRISPR修饰基因生殖系传递的鱼类的方法。这些方法包括sgRNA的体外转录、CRISPR试剂的显微注射、利用基于PCR的异源双链迁移率分析法（HMA）检测靶位点处诱导产生的indel，以及采用低通量和高效的下一代测序（NGS）方法对indel进行表征，后者可分析从杂合子鱼中收集的多个PCR产物。本方案经过优化，旨在最小化所需鱼类数量及分析过程中所需的设备种类。此外，该方案设计为适用于各种经验水平的实验人员，包括本科生，从而使任何希望在斑马鱼中开展基于CRISPR的基因组修饰研究的科研团队均可经济高效地使用这一强大工具。

引言

真核生物之间分子机制的保守性奠定了利用模式生物进行研究的强大基础。许多此类模式系统便于采用反向遗传学方法，例如靶向基因敲除，以鉴定某个基因产物在特定生物学过程或疾病过程中的作用。历史上，斑马鱼等生物体的基因破坏技术主要依赖于靶向引入移码突变，这些突变源于双链断裂（DSB）的不精确修复1,2。当基因组中引入DSB时，DNA损伤可通过两种普遍存在于几乎所有细胞类型和生物体中的修复途径之一进行修复：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）3,4。NHEJ机制的不精确性常常导致产生不同长度的插入或缺失（indels）5,6,7,8,9。在基因编码序列中引入移码突变可导致提前出现终止密码子，通常使该基因丧失功能。

早期在斑马鱼中用于诱导插入缺失（indels）的基因组编辑策略包括巨核酸酶、锌指核酸酶以及转录激活样效应子核酸酶，这些技术均利用DNA-蛋白质相互作用将核酸酶靶向特定基因组位点，从而引入双链断裂（DSB）10,11,12,13,14,15。然而，由于需要繁琐且复杂的工程化过程来构建靶向特定DNA序列的核酸酶，这些技术通常难以应用。与先前的策略不同，基于CRISPR的基因编辑不依赖于蛋白质-DNA相互作用进行靶向。相反，CRISPR相关（Cas）内切酶通过一条RNA引导链进行导向，该引导RNA利用核苷酸碱基配对作用靶向特定的基因组位点16,17,18,19,20,21。由于设计具有理想碱基配对特性的RNA引导链非常简便，因此可相对容易地将Cas内切酶靶向至目标基因座。其中，II型CRISPR系统因其多项优势特征而在基因组编辑应用中得到了广泛开发，包括使用单一的多结构域Cas核酸酶（Cas9），该酶需与DNA结合以激活其内切酶活性，以及使用单一引导RNA（sgRNA）将其靶向至对应的DNA序列18。目前对sgRNA靶向所需的序列条件已有充分了解19，且目标sgRNA可通过体外转录（in vitro transcription）轻松制备。CRISPR/Cas9方法的简便性与高效性极大地促进了斑马鱼及多种其他生物中的靶向遗传修饰。

由于开发了基于CRISPR的试剂，斑马鱼靶向基因组编辑能力显著增强，这大大增加了研究脊椎动物典型生物学过程（如中枢神经系统发育）的机会。斑马鱼基因组包含人类基因组中70%的蛋白编码基因的同源基因，以及84%与人类疾病相关的基因22。斑马鱼的发育具有多个关键特性，使其在反向遗传学研究中更具优势：其胚胎以大量产卵方式产出，体外发育，便于通过显微注射进行遗传操作；且斑马鱼在3个月龄时即可达到性成熟，有利于快速扩增目标品系23。

已有多种实验方案描述了在斑马鱼中生成和鉴定CRISPR来源的插入缺失（indel）的不同方法24,25,26,27,28,29,30,31。然而，其中许多方法耗时较长，需要使用昂贵的设备，对于经验有限的实验室而言操作难度较大。本文所述步骤提供了一种简单、可靠且经济的CRISPR/Cas9策略，用于构建斑马鱼基因敲除品系。本方案描述了利用高效试剂盒通过DNA寡核苷酸（oligos）合成单导向RNA（sgRNA）的方法，类似于此前已报道的其他方法32。该方案特别包含两个显著简化CRISPR突变品系分析的步骤：基于PCR的杂合双链分析法（HMA）33的逐步操作，以简便地检测基因组修饰的存在；以及对杂合子斑马鱼进行测序分析，从而以经济、快速且简便的方式确定多种indel的具体性质。此外，本方案还提供了关于向导RNA的可靠筛选、稳定制备和显微注射的详细分步说明。本文所提供的操作流程展示了一种稳健且相对低成本的实验方案，使具备不同技术水平的实验室人员均能有效参与斑马鱼基因敲除的鉴定工作。

方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获普渡大学动物护理与使用委员会批准（PACUC 编号 08-031-11）。

1. 用于向导RNA合成的模板特异性寡核苷酸设计

  1. 选择基因编码区中需要修饰的目标区域。该区域应靠近基因的5'端，以产生截短的蛋白质，但不能过于靠近，以免后续存在同框的起始密码子，导致生成仅发生轻度N端截短的蛋白质。
    注意：排除这种可能性的一种方法是扫描该基因下游编码区是否存在同框起始密码子。此外，使用靶向大外显子中部的向导RNA，有助于为后续插入缺失（indel）的PCR鉴定设计引物。
  2. 使用向导RNA筛选程序在目标基因组区域中识别潜在的向导位点（参见 材料表)34,35,36. 将浏览器数据设置为 Danio rerio 以及原间隔序列邻近基序（PAM）序列至 5'- NGG -3'。
    注意：理想的gRNA序列在gRNA的第1个位置含有5′-G，以实现高效的T7转录 体外 转录。如果在5′位置没有找到合适的带有G的向导序列，则可以将另一个向导序列的5′端碱基修改为G，或者在向导RNA的5′端添加一个G，但这种方法可能会降低切割效率37为了最大化切割效率，最佳的引导序列应具有40%-80%的GC含量（越高越好），并在第20位包含一个Gth 位置，紧邻PAM，但非必需38一个理想的靶向序列示例：5′- G (N)18 G-3′-NGG（NGG为PAM序列）。除了利用上述向导RNA筛选程序分析结果以确定最优向导RNA外，还应谨慎避免选择预测具有较强脱靶效应的向导RNA，因其会显著增加下游分析的复杂性。尤其应排除预测脱靶位点位于编码区内的向导RNA，并尽可能减少预测的总脱靶位点数量。
  3. 从向导RNA设计工具的输出结果中，排除PAM序列（5′- NGG -3′）；该序列不用于靶向，而是Cas9切割的识别序列。
  4. 向剩余的20个核苷酸（nts）添加T7启动子序列和重叠序列（该区域与用于合成全长sgRNA的支架寡核苷酸互补，全长sgRNA由推荐试剂盒提供） 体外 转录试剂盒）按以下顺序操作，以获得一条54 nt的寡核苷酸：T7启动子序列：5′- TTCTAATACGACTCACTATA -3′；向导RNA序列：5′- G (N)18 G -3′；重叠序列：5′- GTTTTAGAGCTAGA -3′
  5. 确定位于预测切割位点两侧的PCR引物（Cas9在PAM序列上游3个核苷酸处切割），使每个引物与切割位点的距离为50–150个碱基对（bp），可使用基于网页的软件进行设计（参见 材料表).
    注意：这些将用于后续步骤中的切割效率检测。若根据这些限制条件未能找到合适的引物，可能需要考虑另一个向导RNA位点。
  6. 订购54 nt寡核苷酸以制备引导RNA及用于目标位点分析的PCR引物（参见 材料表).
    注意：作为可选的阳性对照，可设计一条靶向色素生成必需基因的sgRNA，以通过易于观察的视觉表型来验证本实验方案的效果（参见 图1 用于代表性结果）。一个常见的靶基因为 酪氨酸酶，使用寡核苷酸（引导RNA序列以下划线标出）39：5′- TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA -3′

2. 胚胎显微注射用CRISPR试剂的制备

  1. 订购市售的 Cas9 蛋白（参见材料表）。
    注意：Cas9 mRNA 的注射也可用于在斑马鱼中产生插入缺失突变（indels）40,41然而，已有研究表明，使用 Cas9 蛋白对斑马鱼胚胎进行显微注射的效率更高32,42.
    1. 将Cas9蛋白悬浮于提供的缓冲液中，配制浓度为1 mg/mL的溶液。将溶液分装成适合注射的体积，置于PCR管中，在-80 °C保存，以尽量减少冻融循环次数。配制5 µL注射溶液需使用2 µL的1 mg/mL Cas9溶液，因此可使用PCR条状管将Cas9蛋白按2 µL每份进行分装。
  2. 使用sgRNA合成sgRNA 体外 转录试剂盒（参见 材料表）。执行 体外 按照制造商说明书进行转录。
    注意：在所有合成、纯化及注射溶液制备步骤中，均需保持无RNase操作技术。例如，使用一次性手套并频繁更换，使用经认证为无RNase的离心管和移液器吸头，并使用市售的去污溶液清洁实验台面和移液器（参见 材料表).
  3. 使用无RNase技术，通过醋酸铵沉淀法纯化合成的sgRNA。
    注意：或者，sgRNA 可使用多种市售的基于离心柱的 RNA 纯化试剂盒进行纯化，成本相对较低。
    1. 加入25 µL 5 M乙酸铵，涡旋振荡以充分混匀。
      注意：乙酸铵溶液可 commercially 购得（参见 材料表)，或者可通过将385.4 mg分子级乙酸铵加入1 mL无RNase水中，配制成5 M溶液，并于-20 °C保存。
    2. 向每个样本中加入150 µL 200-proof无核酸酶乙醇。将反应物置于-80 °C冰箱中冷冻至少20分钟。
      注意：样品可在 -80 °C 条件下保存过夜，但不会显著提高总 RNA 产量。
    3. 以最大速度离心样品（>16,000 × g，4 °C 下离心 20 分钟
    4. 小心地用移液器缓慢吸去上清液，确保不扰动RNA沉淀。
    5. 加入1 mL 70%乙醇（由无核酸酶乙醇用无RNase水稀释制备），轻轻翻转离心管数次以混匀，洗涤管壁残留的盐分。
    6. 重复离心步骤，持续7分钟。
    7. 使用P1000移液器吸出大部分上清液，然后用P200移液器尽可能吸尽剩余液体，注意不要扰动沉淀。将RNA沉淀置于洁净环境（如层流罩或实验台面）中干燥15分钟，或直至离心管内无可见液滴，注意避免RNase污染。
    8. 将沉淀重悬于30 µL无RNase的水中，定量产物（例如使用分光光度计），并将溶液分装后于-80 °C冰箱中长期保存。
      注：典型浓度范围为 800–2,500 ng/µL。
  4. （可选）使用尿素/PAGE 验证全长 RNA 是否已生成。或者，使用琼脂糖凝胶验证 RNA 是否完整。
    注意：然而，若使用琼脂糖凝胶，则需上样较大量的gRNA才能观察到RNA条带，且无法准确测定其长度。在分析试剂注射入鱼体后靶点切割效率时，若未出现或仅有少量切割，则应检查sgRNA是否发生降解。
    1. 使用无RNA酶的技术，采用TBE缓冲液配制含40%丙烯酰胺（19:1）和8 M尿素的8%聚丙烯酰胺凝胶43.
      注意：可使用市售材料清洁设备（参见 材料表).
    2. 待凝胶完全凝固后（约30分钟），将凝胶置于TBE电泳缓冲液中，以5 V/cm的电压进行30分钟电泳以平衡凝胶。
    3. 将 300–500 ng 的 sgRNA 与等体积的 2x RNA 上样缓冲液混合（参见 材料表). 使用 P1000 移液器，用运行缓冲液反复吹打每个孔数次，以清除孔中的任何碎片。加入溶液并以 10 V/cm 的电压运行凝胶 2.5 小时。
      注意：此处设置标记物泳道有助于观察RNA的长度，但并非必需；通常情况下，是否合成了全长RNA是显而易见的图2).
    4. 使用核酸染料观察条带（参见 材料表).
      注意：sgRNA 条带应呈现为单一条带，而条带拖尾则表明 RNA 降解图2).

3. 将CRISPR组分显微注射至斑马鱼胚胎中

  1. 在注射前一晚设置繁殖用鱼缸，将所需数量的雄鱼和雌鱼（通常为2条雌鱼和1至2条雄鱼）放入带有隔离板的繁殖缸中44。
  2. 制备显微注射用培养皿：将35 mL熔化的含1.5%琼脂糖的1×E3培养基（见材料表）倒入直径10 cm的培养皿中，加入0.01%亚甲蓝（一种杀菌剂），然后轻轻放入塑料模具以在溶液中形成楔形凹槽，并轻敲模具以去除气泡。
  3. 让琼脂糖凝固后，加入少量培养基并将培养皿用石蜡膜包裹，于4 °C保存，防止干燥。
    注意：注射用培养皿可重复使用数周，直至孔洞变形、干燥或开始长霉为止。
  4. 在注射当天早晨，将纯化的sgRNA和Cas9蛋白置于冰上解冻。操作时请始终佩戴手套，防止RNase污染，并使用无RNase的枪头和离心管。
  5. 通过将Cas9蛋白与sgRNA按Cas9:sgRNA为2:1的比例混合，配制5 µL注射液，使终浓度为400 pg/nL Cas9蛋白和200 pg/nL sgRNA。室温孵育Cas9/sgRNA混合液5分钟，使Cas9与sgRNA形成核糖核蛋白复合物。随后加入0.5 µL 2.5%（w/v）酚红溶液（见材料表），并用无RNase水补足至终体积5 µL。
    注意：溶液的离子强度已被证明会影响Cas9/sgRNA复合物的溶解度，因此添加KCl可能提高那些插入缺失（indel）形成率较低的sgRNA的切割效率28。
  6. 使用显微拉针仪拉制1.0 mm玻璃毛细管以制作注射针。使用新的剃刀刀片或镊子剪断新制针尖，以获得具有一定倾斜角度的开口，便于穿透卵膜和卵黄囊。
  7. 将注射针安装至连接显微注射仪的显微操作器上，并打开气源。在体视显微镜下，根据特定设备校准所确定的合适放大倍数，调节注射压力，直至针头能持续地向盛有矿物油的培养皿中喷出1 nL的液滴。
    注意：注射针的质量至关重要。在开展正式实验前，应反复练习制作注射针并进行胚胎卵黄囊注射，直至熟练掌握该技术45。
  8. 移除隔离板，让鱼类交配约15分钟。
    注意：延长交配时间可获得更多胚胎，但注射应尽量在胚胎处于单细胞阶段时完成，以确保Cas9切割尽早发生，从而降低基因嵌合性。虽然也可在后续阶段（2–4细胞期）进行注射，但这可能会降低突变等位基因的种系传递率。
  9. 使用滤网收集卵子，并用含0.0001%亚甲蓝的1×E3培养基冲洗至直径10 cm的培养皿中。在光学显微镜下检查卵子健康状况，剔除未受精卵和杂质。
  10. 另取一个标记好的培养皿，保留10–15个胚胎作为未注射对照组。
  11. 使用移液器将卵子轻轻排列在已预温至室温的注射培养皿上。
  12. 在2.5倍放大倍数的解剖显微镜下，向每个胚胎的卵黄囊中注射1 nL溶液，使每个胚胎接受400 pg Cas9蛋白和200 pg sgRNA。
    注意：如需或有必要提高切割效率，可将注射液中Cas9蛋白的终浓度提高至800 pg/nL，sgRNA提高至400 pg/nL；但此举可能增加脱靶切割和/或降低胚胎存活率。也可通过直接向细胞内注射来提高切割效率46。然而，向卵黄囊注射技术难度较低，且足以产生具有高种系传递率的突变鱼（>70%后代携带突变等位基因）。
  13. 将注射后的胚胎转移至标记正确的培养皿中，加入含亚甲蓝的1×E3培养基覆盖，并置于设定为28 °C的胚胎培养箱中。
  14. 受精后24小时（hpf），检查注射胚胎的健康状况，移除死亡或发育异常的个体，并更换培养基（见图3）。将存活率与未注射对照组进行比较。
    注意：当靶向非必需基因时，相对于未注射对照组，预期致死率应低于10%。若发现注射sgRNA的群体中致死率显著高于对照组，可能表明该靶基因对发育至关重要，或存在脱靶效应导致发育失败。此时可能需要减少CRISPR试剂的注射量，或设计新的具有较低脱靶效应的sgRNA。
  15. 将胚胎放回培养箱，继续培养至72 hpf，每日更换培养基以维持胚胎健康。

4. 使用HMA分析插入缺失突变形成的效率

  1. 从注射后培养至72小时的培养板中，收集两组各五个胚胎至微量离心管中，并从未注射的对照组中收集一组五个胚胎。
  2. 加入0.004% MS-222（三卡因）麻醉胚胎，静置2分钟。
  3. 为提取基因组DNA（gDNA），轻轻吸去每组胚胎的培养液，加入45 µL 50 mM NaOH。将胚胎在95 °C孵育10分钟。
  4. 将胚胎从热源取出，冷却至室温。加入5 µL 1 M Tris-HCl（pH = 8），剧烈涡旋振荡样品（5–10秒）。在室温下以最大速度（>16,000 × g）离心3分钟。将上清液转移至洁净并标记的离心管中，将gDNA储存在-20 °C，可保存长达6个月。
    注意：本方案将产生约900 bp及更小的DNA片段。
  5. 根据聚合酶说明书，使用每份样品（包括未注射对照组）制备的gDNA各2 µL，设置50 µL的PCR反应体系，并使用先前设计的、位于预测切割位点两侧的引物。
  6. 使用PCR纯化试剂盒（见材料表）纯化PCR产物，用30 µL水或洗脱缓冲液洗脱样品，并使用分光光度计定量DNA。
  7. 将每份纯化的PCR产物全部30 µL进行重退火：将离心管置于可漂浮的支架中，放入沸水浴（约150 mL水置于500 mL烧杯中）。3分钟后关闭热源，使溶液自然冷却至室温，约需1小时。
    注意：此步骤首先使DNA变性，随后允许DNA链随机重退火，从而形成可能的异源双链带（heteroduplex bands），即含有CRISPR诱变产生的多态性错配双链DNA，其电泳迁移率与同源双链（homoduplexes）不同。也可使用PCR仪的最后一个循环或降温程序进行产物重退火47,48，但沸水浴法可能获得更佳的异源双链产物分辨效果。
  8. 向重退火后的PCR溶液中加入5 µL 6×上样染料（见材料表）。
  9. 使用30%丙烯酰胺（29:1）配制15%聚丙烯酰胺/TBE凝胶。待凝胶凝固后，将其放入含有TBE电泳缓冲液的电泳装置中。使用P1000移液器，通过反复吹吸缓冲液数次，轻轻清除加样孔中的残留盐分或凝胶碎片等杂质，以免堵塞加样孔。
  10. 每条泳道上样500 ng重退火后的PCR产物，并在每组sgRNA样品旁加载一个对照（来自未注射鱼的样品）。以150 V电压电泳2.5小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。
  11. 使用核酸染料（例如，溴化乙锭或SYBR Green（见材料表））观察条带。
  12. 分析每个对照组和CRISPR注射胚胎池的条带模式。
    注意：与未注射组相比，注射组中出现迁移较慢的多条额外条带，表明形成了新的异源双链产物（图4）。新异源双链DNA的存在说明CRISPR注射已成功诱导插入/缺失（indels）。注射样品中同源双链条带强度降低约50%或以上，通常足以实现有效的种系传递。此外，有时在未注射鱼中也可观察到额外条带，若在注射鱼中出现此类条带，不应视为异源双链条带。
  13. 针对每个靶点，选择相对于未注射对照切割效率最高的注射样本；可利用这些注射样本的胚胎培育成鱼，以检测是否产生导致提前终止密码子的indel。
    注意：对于高效切割（同源双链条带强度降低约>50%）的情况，筛选20–30条成年鱼通常足以获得种系传递。
    对于切割效率较低的sgRNA，可能需要筛选更多成年鱼，以提高发现携带提前终止密码子突变等位基因并实现种系传递个体的概率。若未观察到indel形成，可能需要重新设计sgRNA至基因的其他区域。若未观察到异源双链条带形成，sgRNA可能已降解，应通过尿素/PAGE凝胶验证sgRNA质量。

5. 敲除株系的鉴定与扩繁

  1. 为了鉴定潜在的创始亲本鱼，对成年F0代鱼（生长至约2.5–3个月）进行尾鳍剪取，以检测是否存在插入/缺失突变（indels）。使用0.62 mM三卡因麻醉鱼类（参见材料表），然后用洁净锋利的剃须刀片切除尾鳍的约1/2至3/4部分。
  2. 将尾鳍组织放入45 µL的50 mM NaOH溶液中，并将鱼放回恢复用鱼缸。按照所述方法进行基因组DNA（gDNA）提取（步骤4.2–4.4）。当鱼恢复正常的游泳行为后，将其重新置于流动系统水中，直至确定indel的性质。
    注意：必须确保每条鱼均可被识别，并能准确对应尾鳍剪取的检测结果。
  3. 按照前述方法（步骤4.5–4.9），对尾鳍组织提取的gDNA进行异源双链分析（HMA），以判断该鱼是否经CRISPR注射成功修饰（图5）。为鉴定创始鱼，将尾鳍gDNA中显示异源双链条带的成年鱼与野生型鱼交配。收集胚胎并培养至72小时后受精（hpf）。
  4. 在72 hpf时，收集10个胚胎，将每个胚胎分别放入独立的离心管中。使用11.25 µL的50 mM NaOH和1.25 µL的1 M Tris（pH = 8）进行gDNA提取，方法同上（步骤4.2–4.4）。
  5. 重复进行PCR扩增和电泳分析，以检测是否存在异源双链条带（方法同上，步骤4.7–4.13），从而判断indel等位基因是否已传递至该世代（图6）。
  6. 根据HMA在单个胚胎中观察到的遗传传递率，将每个目标CRISPR品系交配所得的约20–30个胚胎培育至成年。
    注意：此数量可根据生殖系传递频率适当增加或减少。
  7. 对成年F1代鱼进行尾鳍剪取，检测indel的存在（方法见步骤5.1–5.2）。按照前述方法（步骤4.5–4.11），对尾鳍剪取样本的gDNA进行HMA分析，以判断该鱼是否携带indel突变（图7）。
  8. 对于出现异源双链条带的鱼类，准备DNA用于测序分析。
    1. 使用新的引物进行PCR扩增，获得以切割位点为中心、长度为300–600 bp的PCR产物。
    2. 使用PCR纯化试剂盒纯化DNA，并用30 µL洗脱液洗脱。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA，确保仅存在单一目的条带。
      注意：琼脂糖凝胶上可能出现轻微的异源双链条带，表现为在预期大小的PCR产物略上方出现小范围弥散或双条带。
  9. 若仅分析一至三个indel，可采用Sanger测序对PCR产物进行测序，并利用生物信息学工具确定indel序列49；否则，采用高通量测序（NGS）分析多个PCR产物序列更为经济（参见材料表）。
  10. 利用生物信息学工具分析序列，判断是否产生提前终止密码子（参见材料表）。
  11. 将携带目标突变等位基因的鱼转移至新鱼缸，并做好适当标记。
  12. 针对特定indel等位基因设计PCR引物，以满足未来基因型鉴定的需求。这些引物应跨越突变序列区域，且不扩增野生型序列。
  13. 将杂合子斑马鱼进行同系交配，以产生分离群体，其中将包含25%的基因敲除品系。

结果

本方案中描述的实验方法可利用 CRISPR/Cas9 技术高效、低成本地制备斑马鱼基因敲除品系。本文附有以下图示，以帮助解读和排查使用本方案获得的结果。在成功制备并显微注射 CRISPR 试剂后，可通过表型观察和 HMA 检测对斑马鱼胚胎进行分析，以评估明显表型及插入/缺失（indel）的形成情况。为直观评估 CRISPR 实验是否成功，一个有效的对照方法是使用步骤 1.5 中描述的 sgRNA 靶向色素生成基因 tyrosinase。在 tyrosinase 基因位点由 Cas9 诱导产生的 indel 会导致色素缺失，该表型在 48 hpf 时即可轻松判读（图 1）。另一个有助于确认 CRISPR 注射试剂制备是否成功的对照，是通过变性聚丙烯酰胺凝胶验证全长（120 nt）sgRNA 是否成功合成（图 2，第 1 和第 2 泳道）。若 RNA 发生降解，则会在凝胶上呈现弥散条带；例如，图 2 中的第 3 泳道即显示了已降解的 RNA，此类 RNA 不适用于注射。

为了分析由CRISPR-Cas9靶向但未产生明显表型（如tyrosinase）的基因的插入缺失（indel）形成频率，HMA是一种简单且可靠的方法。通过HMA分析sgRNA/Cas9显微注射后的胚胎，会产生异源双链带，并伴随同源双链带强度的降低（图4）。本方案进一步利用异源双链带的存在，用于鉴定显微注射胚胎及其成鱼中的潜在 Founder 鱼（图4 和 图5），分析 Founder 个体的生殖系传递效率（图6），以及验证杂合F1代鱼中是否存在插入缺失（indel）（图7）。含有插入缺失的杂合子鱼可作为候选样本，进行下一代测序（NGS），以确定插入缺失的具体性质，并判断目标基因的编码区是否含有提前终止密码子。

斑马鱼胚胎发育；显微镜图像；比较分析；生物学研究。
图1：在单细胞阶段注射靶向tyrosinase的sgRNA后，斑马鱼胚胎表现出色素缺陷。（A）48小时未注射的野生型胚胎，以及（B）48小时注射后的胚胎。请点击此处查看该图的放大版本。

凝胶电泳结果，1-3 泳道显示 120 nt DNA 条带，DNA 分离分析。
图2: 体外 使用合成试剂盒进行sgRNA的转录。 寡核苷酸的合成采用 体外 根据sgRNA合成试剂盒说明书进行转录。取500 ng RNA在尿素/PAGE凝胶上电泳分析。第1道和第2道中加载的sgRNA显示出对应于全长完整120 nt RNA的条带。第3道中的sgRNA显示出降解的RNA样本，不适合用于显微注射。

胚胎发育阶段的显微镜图像，比较，比例尺500 µm，实验分析。
图3：注射后24 hpf胚胎健康状况的比较。 一个存活的胚胎（A）发育至24 hpf，可明显区别于发育中止的胚胎（B）。与（A）相比，形态类似（B）或出现显著异常特征（如脊柱弯曲、头部和眼睛发育异常）的胚胎应从培养皿中移除。请点击此处查看该图的放大版本。

显示异源双链和同源双链DNA条带的电泳凝胶；泳道M、1、2、3；100 bp标记物。
图4：sgRNA-Cas9显微注射斑马鱼胚胎的异源双链迁移率分析。 每个样本收集5个胚胎组成的池样，在72 hpf时取样并提取基因组DNA。按照所述方法进行异源双链分析，各样本等量上样，DNA量为500 ng。泳道：M = 100 bp标记物；1 = 未注射对照；2 = 注射样本1；3 = 注射样本2。预期条带大小 = 98 bp。

用于序列分析的DNA电泳凝胶显示异源双链和同源双链条带。
图 5：成年CRISPR注射斑马鱼尾部提取基因组DNA的异源双链迁移率分析。 注射了sgRNA和Cas9蛋白的胚胎培养至成年（3个月）。鱼B和鱼C显示出异源双链条带，随后用于繁殖以鉴定种系传递的插入缺失突变；鱼A因未显示阳性异源双链条带，未用于后续分析。泳道：1 = 野生型对照；2 = 鱼A；3 = 鱼B；4 = 鱼C。预期条带大小 = 98 bp。 请点击此处查看该图的放大版本。

凝胶电泳结果；使用100 bp标记物的异源双链分析；DNA分离过程。
图6：通过将F0代CRISPR显微注射斑马鱼与野生型鱼交配产生的单个胚胎进行异源双链迁移率分析，以鉴定生殖系传递的插入缺失突变（indels）。 斑马鱼交配后，F1代胚胎培养72小时。收集单个胚胎，并按前述方法进行异源双链分析。泳道：1 = 野生型对照；2–10 = 每泳道一个F1代胚胎。该凝胶结果显示，10个胚胎中有7个显示出阳性异源双链条带，表明插入缺失突变的生殖系传递率为70%。预期条带大小为98 bp。 请点击此处查看该图的放大版本。

凝胶电泳结果，DNA条带，泳道WT 1-3，显示139 bp和120 bp标记物。
图7：成年F1代斑马鱼尾鳍组织的异源双链迁移率分析。 通过异源双链迁移率分析（HMA）对成年F1代鱼进行评分，以鉴定插入/缺失突变（indels）。出现阳性异源双链条带的个体经PCR扩增后进行全序列测序分析，以确定突变性质。（A）泳道：1 = 野生型对照；2 = 鱼A（4 bp缺失，1 bp错配）。（B）这些F1代鱼源自同一创始个体（founder），却表现出不同的异源双链图谱，表明单个创始个体可将多种修饰后的等位基因通过生殖系传递给后代。泳道：1 = 野生型对照；2 = 鱼B（4 bp插入，7 bp错配），3 = 鱼C（4 bp缺失，4 bp错配）。根据高通量测序（NGS）结果，这些插入/缺失突变均在靶基因的编码序列中引入了提前终止密码子。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本方案描述了利用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼这一脊椎动物模型系统中产生基因敲除的方法。此前已有多种方案被用于在斑马鱼中开展CRISPR介导的基因组编辑15,25,26,50,51,52。本方案在以往研究基础上，整合了多种简单且可重复性高的实验技术，特别是对多条杂合子鱼进行HMA和NGS分析，从而建立了一种简便、经济且实验可靠性高的斑马鱼CRISPR介导诱变方案，适用于研究人员培训背景和经验水平各异的实验室，也适用于教学实验室。

本方案中包含了指导RNA设计与合成的相关建议。在指导RNA设计中，一个主要考虑因素是最小化脱靶效应。目前已开发出多种预测算法，使CRISPR使用者能够通过用户友好的图形化计算工具，预测靶向指导RNA的活性以及发生脱靶效应的可能性34,35,36。斑马鱼系统的一个显著优势是脱靶效应的发生率较低，这是因为Cas9被直接注射到胚胎中，其表达具有瞬时性，而在小鼠中的研究已表明这种瞬时表达可降低脱靶效应53。尽管如此，斑马鱼中也已证实存在脱靶效应54。控制脱靶效应的一种方法是利用两个独立的靶向同一基因的指导RNA分别产生的F0代斑马鱼进行表型分析，因为这两个指导RNA极可能影响不同的脱靶位点。另一种未在本方案中描述的减少脱靶效应的方法是使用一种突变型Cas9，该酶可在靶DNA上产生单链断裂，而这类断裂可被高效修复。当两个互补于相反DNA链的切口在空间上彼此靠近时，可有效在目标位点形成插入或缺失突变（indel），同时显著降低脱靶效应55,56。

除了脱靶效应的发生率不同外，不同的sgRNA对目标位点的诱变效率也可能存在差异57,58,59。本实验方案采用异源双链分析法（HMA），通过检测异源双链带的形成来评估特定sgRNA的诱变效率33,40。异源双链带由含有错配的PCR扩增DNA链杂交形成，可通过凝胶电泳轻松分辨。与其他常用于检测插入缺失（indel）形成的方法（如T7核酸内切酶检测法或高分辨率熔解曲线分析25,26）相比，HMA无需使用昂贵的酶来切割错配DNA，也不需要对PCR熔解曲线进行复杂的分析。重要的是，通过HMA验证注射群体中高水平的indel形成，可使研究人员尽量减少后续构建基因敲除品系所需的斑马鱼数量，从而降低筛选具有理想特性的突变体的成本。

利用CRISPR技术产生插入缺失突变（indel）的相对简便性，使得能够同时创建多个基因的多种等位基因。目前已有多款基于网页的软件可用于通过PCR产物的Sanger测序分析杂合子鱼类中的单个突变49。当需要分析三个或更多CRISPR诱导的突变等位基因时，采用下一代测序技术（NGS）来鉴定插入缺失突变的性质可能更具成本效益，因为该方法可一次性表征多达50种不同等位基因的序列（参见材料表）60,61,62。这种规模化的检测优势在本科生实验教学环境中可能尤为适用。

综上所述，本实验方案提供了可重复地制备高质量CRISPR试剂（特别是sgRNA）的逐步操作指南，从而减少为成功鉴定目标突变等位基因所需培育和分析的成年斑马鱼数量，同时降低了构建目标品系所需的时间和成本。重要的是，本方案的设计使得资源有限的实验室也能够以经济可行的方式制备突变型斑马鱼。此外，我们发现该方法适用于本科生教学，因此为希望获得CRISPR基因组编辑实践操作经验的本科生提供了更多教育与培训机会。

披露

本视频文章的出版由 New England Biolabs 赞助。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（R21CA182197，授予 J.O.）、Ralph W. 和 Grace M. Showalter 研究信托基金以及普渡大学农业科学与经济发展推广（AgSEED）项目资助。Sanger 测序数据由普渡大学基因组学核心设施获得，该设施受 P30 CA023168 项目支持。Mary Witucki 受普渡大学癌症研究中心暑期本科生研究项目资助，该项目由卡罗尔县癌症协会支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写。我们感谢 Benjamin Carter、Ellen Denning 和 Taylor Sabato 对稿件提出的宝贵意见。我们感谢生物化学系对本研究的支持，以及普渡大学斑马鱼研究中心在斑马鱼种群护理与福利方面所做出的贡献。最后，我们感谢普渡大学基因组学核心设施，以及 Phillip San Miguel 在下一代测序（NGS）服务方面的支持与贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CRISPORsgRNA 分析软件。http://crispor.tefor.net/
Breaking-CassgRNA 分析软件。https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChopsgRNA 分析软件。https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3PCR 引物设计。http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free 技术http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free 水任意品牌用于合成向导 RNA。Thermo Fisher 和 Qiagen 均提供合适的产品。
Rnase-free 乙醇任意品牌分子生物学级乙醇为 RNase-free。Fischer 和 VWR 均出售合适乙醇。
Cas9 蛋白PNA BioCP01带有核定位信号的 Cas9 蛋白。
靶向特异性寡核苷酸Integrated DNA Technologies (IDT)用于合成向导 RNA。
扩增向导 RNA 切割位点侧翼区域的 PCR 引物Integrated DNA Technologies (IDT)用于异源双链分析，扩增产物长度为 100–300 bp。
扩增向导 RNA 切割位点侧翼区域的 PCR 引物Integrated DNA Technologies (IDT)用于测序 CRISPR 等位基因，推荐扩增产物长度为 300–600 bp。
EnGen sgRNA 合成试剂盒New England BioLabsE3322体外转录合成向导 RNA。
10X TBEThermo FisherB52用于核酸电泳的 RNase-free 缓冲液。
6X 上样染料New England BioLabsB7025S用于 DNA 电泳上样。
5M 醋酸铵Thermo FisherAM9071用于向导 RNA 纯化的清洗试剂。
乙醇（200 证明，无核酸酶）任意品牌用于向导 RNA 纯化的清洗试剂。分子级试剂为 RNase-free。
无核酸酶水任意品牌用于向导 RNA 的合成与纯化。
RNase awayThermo Fisher10328011用于清除表面、设备和玻璃器皿上的 RNase 污染。
DNA Ladder，100 bpNew England BioLabsN0467S用于 DNA 凝胶电泳的分子量标准。
DNA Ladder，1 kbNew England BioLabsN0552S用于 DNA 凝胶电泳的分子量标准。
RNA LadderNew England BioLabsN0364S单链 RNA 标记物，用于验证全长 sgRNA 是否成功合成。
TEMEDThermo Fisher17919用于制备聚丙烯酰胺凝胶。
过硫酸铵（APS）Sigma-AldrichA3678用于制备聚丙烯酰胺凝胶。
40% 聚丙烯酰胺（19:1）BioRad161-0154用于制备变性聚丙烯酰胺凝胶。
尿素Sigma-AldrichU5378-100G用于制备变性聚丙烯酰胺凝胶。
RNA 上样染料（2x）Thermo FisherR0641用于将向导 RNA 上样至变性凝胶进行电泳。
溴化乙锭Sigma-AldrichE1510-10ML用于核酸的可视化检测。
SYBER GreenThermo FisherS7563用于在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中检测双链 DNA 的替代方法，可替代溴化乙锭。
微量离心机Eppendorf5424用于 RNA 清洗和 PCR 产物纯化。
MyTaq 聚合酶BiolineBIO-21105用于 PCR 扩增 DNA。
热循环仪任意品牌用于 PCR 扩增。
分光光度计任意品牌NanoDrop 或类似产品，用于定量 DNA/RNA 含量。
E3 胚胎培养基实验室自制用于胚胎培养和注射板制备。配方：http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
亚甲蓝Sigma-AldrichM9140添加至 1x E3 培养基中以防止胚胎真菌生长。
培养皿Thermo FisherFB0875711Z用于储存胚胎和制备注射板。
琼脂糖DenvilleCA3510-8用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
微注射模具Adaptive Science ToolsTU-1用于在注射过程中固定胚胎的凹槽制备。
酚红Sigma-AldrichP0290 用于注射过程的可视化染料。
矿物油Sigma-AldrichM5904-5ML用于校准注射针的注射体积。
移液管任意品牌用于转移胚胎。
剃须刀片Thermo Fisher11295-10用于切割注射针和成年鱼尾部取样。
培养箱任意品牌用于在 28.5 oC 下培养胚胎。
垂直式移液器拉针仪David Kopf Instruments700C用于制备注射针。更多拉针操作说明：http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
毛细管Sutter InstrumentsBF100-58-10用于制备注射针。
微量加样头Eppendorf930001007用于将溶液装入注射针。
显微注射仪World Precision InstrumentsPV 820用于胚胎注射。
解剖显微镜Leica用于胚胎注射。
30% 聚丙烯酰胺（29:1）BioRad161-0156用于异源双链凝胶制备。
MS-222（Tricaine）Sigma-AldrichA-5040用于斑马鱼麻醉，以便进行尾部取样和胚胎基因组 DNA 提取。配方：https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
微波炉任意品牌用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
天平任意品牌用于制备注射板和琼脂糖凝胶。
手套任意品牌用于实验全过程。
N2任意品牌用于从毛细管中排出液体以进行胚胎注射。
1,000 µL  吸头任意品牌用于实验全过程。
200 µL 吸头任意品牌用于实验全过程。
10 µL 吸头任意品牌用于实验全过程。
PCR 条形管任意品牌用于实验全过程。
微量移液器任意品牌用于实验全过程。
NGS 测序平台：Wideseq若贵机构未提供此项服务，请访问：https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/（外部费用：35 美元）。
序列分析软件用于杂合鱼的 Sanger 测序分析。访问：http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
序列分析软件SnapGene Viewer、Sequence Scanner，用于 NGS 测序数据分析。

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高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除
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