一种针对人乳样本的16S测序方法

摘要

本文介绍了一种针对人乳及其他低生物量样本类型中16S rRNA的靶向测序半自动化工作流程。

摘要

随着相对低成本、快速且高通量测序技术的发展，微生物群落的研究已广泛开展。然而，与所有此类技术一样，可重复的结果依赖于包含适当预防措施和对照的实验室工作流程。这一点在低生物量样本中尤为重要，因为污染性细菌DNA可能导致误导性的结果。本文详细介绍了一种半自动化的工作流程，用于在低至中等通量规模上，通过对16S核糖体RNA（rRNA）V4区进行靶向测序，从人乳样本中鉴定微生物。该方案描述了从全乳样本开始的样本制备过程，包括：样本裂解、核酸提取、16S rRNA基因V4区的扩增，以及包含质量控制措施的文库构建。尤为重要的是，本方案及讨论部分涵盖了与低生物量样本制备和分析密切相关的问题，包括适当的阳性和阴性对照、PCR抑制物的去除、来自环境、试剂或实验操作的样本污染，以及旨在确保可重复性的实验最佳实践。尽管所述方案专门针对人乳样本，但它可适用于多种低生物量和高生物量样本类型，包括采集于拭子上的样本、冷冻纯样本或保存于稳定缓冲液中的样本。

引言

定植于人体的微生物群落被认为对人体健康和疾病具有至关重要的影响，可调节代谢、免疫系统发育、疾病易感性以及对疫苗接种和药物治疗的反应。^1,2. 研究微生物群对人类健康影响的努力目前主要集中于鉴定与特定解剖区域相关的微生物（即皮肤、肠道、口腔 等。)，以及这些区室内的局部位点^3,4支撑这些研究工作的，是新一代测序（NGS）技术的迅速兴起和可及性不断提高，该技术为样本中微生物遗传成分（微生物组）的分析提供了高度并行的平台。对于许多生理样本而言，其相关的微生物组既复杂又丰富即，粪便），但对于某些样本，微生物组的微生物生物量较低（即，人乳，下呼吸道）中，敏感性、实验假象和可能的污染成为主要问题。微生物组研究的常见挑战及适当的实验设计已有多篇综述文章进行探讨^5,6,7,8.

本文介绍了一种基于16S rRNA V4区靶向测序的稳健高....

方案

所有实验步骤均需佩戴适当的个人防护装备（PPE），并采取严格的污染防控措施。应遵循从扩增前工作区到扩增后工作区的工作流程，以最大限度减少样本污染。所有使用的耗材均须无菌，且无RNase、DNase、DNA和热原。所有移液器吸头均须带滤芯。本方案的步骤流程图见（图1）。

1. 样品裂解

注意：样本裂解和核酸提取使用DNA/RNA提取试剂盒在洁净室环境中进行，该环境采用工程控制和程序控制措施，以最大限度减少环境细菌对样本的污染。

1. 工作区域准备
   1. 使用适当的表面清洁剂清洁生物安全柜（BSC）工作区域，以消除任何核酸污染。
   2. 打开温控涡旋振荡器，并将其设定为 37 °C。
2. 制备硫氰酸胍裂解缓冲液（参见材料表）
   1. 检查裂解缓冲液中是否有沉淀物。如有沉淀，于 37 °C 加热使其重新溶解。
   2. 为每个样品准备含 6 µL β-巯基乙醇（β-ME）的 600 µL 裂解缓冲液。建议每份样品额外多准备 20% 的体积。
3. 样品准备
   1. 若全脂牛奶为冷冻状态，需在....

结果

本文所述方案包含重要的质量控制（QC）步骤，以确保所获得的数据符合该方案在灵敏度、特异性和污染控制方面的基准要求。方案中的第一个质量控制步骤是在扩增16S V4区之后进行PCR产物检测（图2）。通过电泳分析每个样本1 µL的PCR产物，以确认其片段大小在预期的315 - 450 bp范围内（图2，红色箭头）。部分人乳样本产生的特异性产物量较低（图2A，比较第3泳道与第9–11泳道同第4–8泳道），提示这些样本中提取的微生物DNA含量可能较低，或在提取过程中残留了PCR抑制物。对于在315 - 450 bp范围内产生的产物浓度低于2.0 nM的样本（图2A，第7泳道），需使用单步纯化试剂盒去除PCR抑制物，并对样本重新进行扩增。经纯化后样本扩增恢复的成功率约为40%。对每个样本的特异性产物进行定量（

讨论

靶向16S rRNA的高通量测序是一种广泛使用的快速微生物组表征技术¹⁸。然而，许多因素，包括批次效应、环境污染物、样本交叉污染、灵敏度和可重复性，可能对实验结果产生不利影响，并干扰结果的解读^7,19,20。为了更好地实现可靠的16S分析，微生物组实验流程必须包含良好的实验设计、适当的对照使用、操作步骤的空间隔离以及最佳实践的应用。本文所述方案整合了上述各项参数，并提供了重要的实验工具，以应对上述挑战，实现在多种样本中开展16S实验流程。

良好的实验设计对于16S微生物组分析至关重要。这包括样本的正确采集与保存，以及针对目标区域选择合适的16S引物。例如，V4区（515F/806R）被选用于人乳样本，因其对该区域具有良好的扩增效果 双歧杆菌， 在新生儿肠道微生物组的发育过程中起着重要作用²¹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AllPrep RNA/DNA Mini Kit	Qiagen	80204	DNA/RNA 提取试剂盒
Eliminase	Fisher Scientific	435532	RNase、DNase 和 DNA 去污染剂
Thermo Mixer	Fisher Scientific		温控振荡仪
Buffer RLT plus	Qiagen	1053393	硫氰酸胍裂解缓冲液，Allprep 试剂盒组分之一
ß-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689-25ML-F	ß-ME 是一种还原剂，可通过还原二硫键不可逆地使 RNase 变性
LME Beads	MP Biomedicals	116914050	珠管
QIAgen TissueLyzer	Qiagen	85300	自动化样品破碎仪适配器组
QIAshredder 柱	Qiagen	79654
QIAgen RB 管			厂商提供的试剂盒用微量离心管
QIAcube 及相关塑料耗材	Qiagen	9001292	自动化 DNA/RNA 纯化仪器
DNA exitus plus	Applichem	A7089	非酶法去污染溶液
EB 缓冲液	Qiagen	19086	洗脱缓冲液
QIAgility 及相关塑料耗材	Qiagen	9001532	自动化液体处理机器人
PCR 用水	MO BIO	17000-
5PRIME HotMasterMix	Quantabio	2200400
带条形码的反向引物	Eurofin	无目录编号	自行设计并订购
96 孔 PCR 板	USA scientific	1402-9708
Tapestation 2200 及相关塑料耗材	Agilent	G2964AA	自动化 DNA/RNA 片段分析仪
Tapestation 用 D1000 试剂	Agilent	5067-5585	该试剂盒包含样品缓冲液和分子量标记
OneStep PCR 抑制物去除试剂盒	Zymo Research	50444470	按照厂商说明书进行 PCR 抑制物去除
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	DNA 纯化试剂盒：基于硅胶膜纯化 PCR 产物
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher	Q32854	该试剂盒包含基于二甲基亚砜的稀释缓冲液和染料
Qubit 荧光计	Thermo Fisher	Q33216
NanoDrop	Thermo Fisher		微量分光光度计
MiSeq 300 V2 试剂盒	Illumina	15033624/15033626
MiSeq	Illumina	无目录编号	下一代测序仪