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方法文章

一种针对人乳样本的16S测序方法

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DOI：

10.3791/56974

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2018年3月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

本文内容

摘要

本文介绍了一种针对人乳及其他低生物量样本类型中16S rRNA的靶向测序半自动化工作流程。

摘要

随着相对低成本、快速且高通量测序技术的发展，微生物群落的研究已广泛开展。然而，与所有此类技术一样，可重复的结果依赖于包含适当预防措施和对照的实验室工作流程。这一点在低生物量样本中尤为重要，因为污染性细菌DNA可能导致误导性的结果。本文详细介绍了一种半自动化的工作流程，用于在低至中等通量规模上，通过对16S核糖体RNA（rRNA）V4区进行靶向测序，从人乳样本中鉴定微生物。该方案描述了从全乳样本开始的样本制备过程，包括：样本裂解、核酸提取、16S rRNA基因V4区的扩增，以及包含质量控制措施的文库构建。尤为重要的是，本方案及讨论部分涵盖了与低生物量样本制备和分析密切相关的问题，包括适当的阳性和阴性对照、PCR抑制物的去除、来自环境、试剂或实验操作的样本污染，以及旨在确保可重复性的实验最佳实践。尽管所述方案专门针对人乳样本，但它可适用于多种低生物量和高生物量样本类型，包括采集于拭子上的样本、冷冻纯样本或保存于稳定缓冲液中的样本。

引言

定植于人体的微生物群落被认为对人体健康和疾病具有至关重要的影响，可调节代谢、免疫系统发育、疾病易感性以及对疫苗接种和药物治疗的反应。1,2. 研究微生物群对人类健康影响的努力目前主要集中于鉴定与特定解剖区域相关的微生物（即皮肤、肠道、口腔 等。)，以及这些区室内的局部位点3,4支撑这些研究工作的，是新一代测序（NGS）技术的迅速兴起和可及性不断提高，该技术为样本中微生物遗传成分（微生物组）的分析提供了高度并行的平台。对于许多生理样本而言，其相关的微生物组既复杂又丰富即，粪便），但对于某些样本，微生物组的微生物生物量较低（即，人乳，下呼吸道）中，敏感性、实验假象和可能的污染成为主要问题。微生物组研究的常见挑战及适当的实验设计已有多篇综述文章进行探讨5,6,7,8.

本文介绍了一种基于16S rRNA V4区靶向测序的稳健高通量测序（NGS）实验流程9，用于表征人乳中的微生物组。人乳微生物组分析不仅因其本身微生物生物量较低而复杂10，还受到高水平的人源DNA背景11,12,13,14以及提取的核酸中可能残留PCR抑制物的影响15,16。本方案采用市售的核酸提取试剂盒和半自动化平台，有助于最小化不同样本制备批次间的变异。方案中包含一个定义明确的模拟细菌群落，该群落与实际样本并行处理，作为质量控制手段，用于验证实验流程的每一步，并提供评估流程稳健性的独立指标。尽管本方案所描述的内容针对人乳样本，但其可轻松适用于其他类型的样本，包括粪便、直肠、阴道、皮肤、乳晕及口腔拭子样本10,17，可为希望开展微生物组分析的研究人员提供一个良好的起点。

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方案

所有实验步骤均需佩戴适当的个人防护装备（PPE），并采取严格的污染防控措施。应遵循从扩增前工作区到扩增后工作区的工作流程，以最大限度减少样本污染。所有使用的耗材均须无菌，且无RNase、DNase、DNA和热原。所有移液器吸头均须带滤芯。本方案的步骤流程图见（图1）。

1. 样品裂解

注意：样本裂解和核酸提取使用DNA/RNA提取试剂盒在洁净室环境中进行，该环境采用工程控制和程序控制措施，以最大限度减少环境细菌对样本的污染。

  1. 工作区域准备
    1. 使用适当的表面清洁剂清洁生物安全柜（BSC）工作区域，以消除任何核酸污染。
    2. 打开温控涡旋振荡器，并将其设定为 37 °C。
  2. 制备硫氰酸胍裂解缓冲液（参见材料表）
    1. 检查裂解缓冲液中是否有沉淀物。如有沉淀，于 37 °C 加热使其重新溶解。
    2. 为每个样品准备含 6 µL β-巯基乙醇（β-ME）的 600 µL 裂解缓冲液。建议每份样品额外多准备 20% 的体积。
  3. 样品准备
    1. 若全脂牛奶为冷冻状态，需在冰上解冻。在生物安全柜中将 5 mL 全脂牛奶分装至 15 mL 或 5 mL 无菌离心管中，并保持在冰上。
    2. 将 5 mL 牛奶样品在 4 °C 条件下以 5,000 x g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。
    3. 使用塑料刮刀或大孔径移液器吸头去除管中顶部的脂肪层。
    4. 在不扰动沉淀的前提下，弃去上清液，仅保留 100 µL。
    5. 用 1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀进行洗涤。
    6. 准备一个阴性对照：向一个 5 mL 离心管中加入 1 mL 无菌 PBS。
    7. 将悬液转移至洁净的 1.5 mL 离心管中，在微量离心机中以 5,000 x g 室温（RT）离心 1 分钟。
    8. 使用 1,000 µL 无菌滤芯吸头完全弃去上清液/脂肪层。
    9. 若非当天提取，应将细胞沉淀置于乙醇/干冰混合物中快速冷冻，随后立即转移至 -80 °C 冰箱保存。
  4. 样品破碎与均质化（珠击破碎）
    1. 向沉淀中加入含 β-ME 的 600 µL 裂解缓冲液，混匀后转移至珠击管中。
    2. 每批 12 个提取样品包括 10 个待测样品、1 个阴性对照（见步骤 3.7 制备）和 1 个阳性对照（见下一步制备）。
      1. 使用裂解缓冲液和 20 µL 细菌模拟样品制备 1 个阳性对照（所用模拟菌群在提取后 DNA 浓度约为 0.2 ng/µL）。
    3. 剧烈涡旋所有珠击管 15 秒。
    4. 将样品置于温控涡旋振荡器上，在 37 °C 下以 700 - 800 rpm 振荡 10 分钟。
    5. 将珠击管装入自动样品破碎仪的适配器组中。
    6. 在 30 Hz 条件下进行珠击破碎 1 分钟。
    7. 拆卸适配器组，并手动将适配器组连同样品板从仪器的左机械臂转移至右机械臂。
    8. 再次在 30 Hz 条件下珠击破碎 1 分钟。
    9. 在 25 °C 条件下以 17,200 x g 离心 3 分钟。
    10. 使用 200 µL 移液器小心吸取全部上清液，避免接触样品顶部的脂肪层或底部的珠粒残留，并将上清液转移至均质化柱中。
    11. 将均质化柱在最大转速（17,200 x g）、25 °C 条件下离心 3 分钟。
    12. 将 350 µL 流出液转移至制造商提供的 2 mL 微量离心管中，用于后续自动化仪器进行 DNA 和 RNA 的纯化（请勿使用其他类型的离心管）。注意避免转移任何残留的脂肪层。
    13. 若流出液体积少于 350 µL，需加入含 β-ME 的裂解缓冲液补足至终体积 350 µL。
    14. 在进行自动化 DNA 纯化前，样品可在室温下放置最多 2 小时，或直接于 -80 °C 冻存。
  5. 清洁工作区域
    1. 使用非酶类去污溶液清洁所有使用过的表面，静置 10 分钟后，喷洒 70% 乙醇并擦拭表面。

2. 分离 DNA/RNA

  1. 工作区域准备
    1. 打开加热块并将温度设置为 70 °C。
    2. 打开温控涡旋振荡器，并将温度设置为 37 °C。
    3. 将含有 10 mM Tris-Cl（pH 8.5）的洗脱缓冲液（EB）在 50-mL 离心管中预热至 70 °C。
    4. 将 2 mL 离心管中的 350 µL 冻存样本裂解液在 37 °C 下预热，直至完全解冻且无任何沉淀（约 10 分钟）。
  2. DNA 纯化
    1. 短暂涡旋并离心装有样本的 2 mL 离心管（3000 × g，10 秒）。
    2. 根据制造商说明，按照自动化 DNA/RNA 纯化仪器的上样图，将 2 mL 离心管插入振荡器中。
    3. 取出转子适配器，并根据样本数量将其安装在托盘上。
    4. 根据样本的编号（ID）标记每个转子适配器。
    5. 剪掉 DNA 和 RNA 各自离心柱的盖子，并修整边缘使其平滑。
    6. 将 DNA 离心柱（不带收集管）插入转子适配器中，丢弃原收集管。
    7. 标记 1.5 mL 收集管，并将其插入转子适配器中。
    8. 根据自动化 DNA/RNA 纯化仪器的上样图，将转子适配器放入离心机中。
    9. 将制造商提供的 1,000 µL 滤芯吸头插入吸头架中。
    10. 根据样本数量，向 2 mL 制造商微离心管中加入无 RNase 水（具体操作遵循相应仪器的操作规程）。
    11. 将该离心管插入微离心管槽位 "A" 中。
    12. 丢弃试剂瓶中残留的试剂，并确保每瓶中至少加入 10 mL 的最小体积。
    13. 将试剂瓶插入试剂瓶架中（EB 瓶除外）。
    14. 从 50-mL 管中将预热的 EB 加入试剂瓶第 6 号位置。
    15. 检查 1.5 mL 离心管是否牢固地放置在转子适配器中。
    16. 关闭仪器盖，选择："RNA"→ "extraction kit" → "Animal, tissues and cells" → "kit's name 350 µL Part A Custom DNA" → 编辑洗脱体积为 100 µL（默认）或低生物量样本为 50 µL → "Start."
    17. 程序完成后，将转子适配器从离心机中取出并放回托盘。
    18. 丢弃位于转子适配器第 3 号位置的 DNA 离心柱。
    19. 切勿丢弃转子适配器，RNA 位于第 2 号位置。
    20. 取出第 3 号位置含有洗脱 DNA 的 1.5 mL 收集管，并于 −20 °C 保存。
    21. 从振荡器中取出含有样本的离心管，如有剩余样本则于 −20 °C 保存，否则丢弃。
    22. 继续使用 "kit's name 350 µL part B RNA" 协议进行 RNA 的进一步纯化。
    23. RNA 的纯化将从转子适配器中间位置的约 350 µL 穿流液中进行。
  3. RNA 纯化
    1. 将 RNA 离心柱（不带收集管和盖子）插入转子适配器中。
    2. 标记新的 1.5 mL 收集管，并根据说明书指示将其插入转子适配器中。
    3. 根据自动化 DNA/RNA 纯化仪器的上样图，将转子适配器放入离心机中。
    4. 关闭仪器盖，选择："RNA" → "Manufacturer's Kit" → "Animal, tissues and cells" → "Standard Part B RNA" → "Start."
    5. 程序完成后，将转子适配器从离心机中取出并放回托盘。
    6. 丢弃位于第 3 号位置的 RNA 离心柱。
    7. 取出第 3 号位置含有 30 µL 洗脱 RNA 的 1.5 mL 收集管，并于 −80 °C 保存。
    8. 移除试剂瓶。
    9. 通过适当的危险废物处理渠道处置转子适配器中的内容物。
  4. 清洁工作站
    1. 使用非酶类去污溶液喷洒自动化 DNA/RNA 纯化仪器的所有配件，如试剂架、托盘以及所有使用过的表面，静置 10 分钟后用去离子水（DI 水）冲洗，然后晾干。
    2. 仅使用制造商批准的非酶类去污溶液喷洒自动化仪器，擦拭离心机内部及所有使用过的表面，静置 10 分钟后用 70% 乙醇擦拭。请勿使用其他类型的去污溶液，以免损坏仪器。

3. 靶向16S PCR 设置

注意：16S PCR 的体系构建在洁净室内的指定扩增前工作区进行。试剂和样本制备完成后，将其加载至液体处理设备，对每个样本进行三复孔 PCR 扩增（共 30 个样本，包括真实样本、提取阳性对照和阴性对照，以及 2 个 PCR 水对照，每种均设三复孔，总计 96 个样本与对照）。PCR 反应体系组装并密封后，将样本板转移至扩增后区域的热循环仪中进行扩增程序。

  1. 工作区域准备
    1. 清洁PCR工作站。使用RNase、DNase和DNA去污染剂喷洒所有使用表面，随后用去离子水擦拭两次，最后用70%乙醇处理。
    2. 根据准确的样本列表准备16S PCR工作表（参见靶向16S PCR工作表），并为每个样本分配不同的条形码引物9。打印工作表和板图（参见板1）。
  2. PCR主混合液的配制
    注意：16S引物的选择取决于特定研究中感兴趣的目标区域，可能因研究或样本类型而异。因此，在订购引物前，必须确认16S rRNA的哪个区域最适于扩增该研究中关注的微生物。本方案所述内容适用于16S V4区的扩增。若选择不同的引物或区域，则热循环中的退火温度可能需要调整。
    1. 在PCR工作站内完成所有准备工作。
    2. 从-20 °C取出50 - 100 µL DNA样本及所需全部试剂，置于冰上融化。涡旋混匀后短暂离心。
    3. 引物已预先稀释至工作浓度5 µM，最小体积为20 µL。
    4. 根据工作表上的计算结果，在专用的5 mL离心管中仅加入正向引物，配制PCR主混合液。
  3. 为自动化PCR设置准备 robotic 液体处理系统
    1. 对于样本，取出32孔仪器样本适配器，按照96孔板图和制造商说明，加载50 - 100 µL DNA样本。
      1. 每块PCR板设置2个阴性对照，将30 µL PCR用水加入洁净的样本管中。
      2. 将所有样本放置于32孔仪器样本适配器上，管盖锁定在开启位置。
    2. 对于反向引物9
      1. 依次逐个打开带有特定条形码编号的反向引物管盖（每次更换手套以避免交叉污染）。
      2. 最多将32个引物放置于仪器的试剂适配器上。
    3. 取出一块96孔PCR板，标注研究名称、样本编号、日期及技术人员姓名首字母。
    4. 装载 robotic 液体处理系统
      1. 将试剂适配器置于B1位置。为避免边缘效应，先小心将适配器一端紧贴夹持侧，再缓慢放下另一端。确保对适配器的各个角落均施加压力。
      2. 将样本适配器置于C1位置。确保对适配器的各个角落均施加压力。
      3. 涡旋混匀5 mL主混合液，打开管盖，将其置于仪器主混合液与试剂块的A位置。
      4. 将PCR板放置于专用于半裙边PCR板的96孔仪器适配器上。
      5. 启动运行，并另存为新文件。
      6. 按照提示逐项确认：一，移液头已备妥；二，废液盒已备妥；三，开始运行。
    5. 运行完成后，检查仪器是否有错误提示，确认无误。
    6. 使用12孔或8孔条形盖密封PCR板，剧烈涡旋混匀，然后使用96孔板离心机离心1分钟，随后置于冰上或冰箱中保存。
    7. 移除含有反向引物和样本的离心管。
    8. 将96孔PCR板转移至扩增后操作区，装载到热循环仪中，并按照热循环条件表进行扩增（参见表1）。

4. 使用基于胶带的凝胶电泳平台进行靶向16S PCR后质量控制

注意：PCR 后的质量控制（QC）及所有后续步骤均在实验室指定的扩增后区域进行。DNA 样品在自动化 DNA/RNA 片段分析仪中进行分析。

  1. 工作区域准备
    1. 使用RNase、DNase和DNA去污染剂喷洒所有使用表面进行清洁，随后用去离子水擦拭两次，最后用70%乙醇处理。
    2. 准备好所需的所有耗材和设备。
  2. 配制试剂
    1. 将样品缓冲液和分子量标记物置于25 °C控温涡旋仪中，预热至少30分钟。
  3. 在试剂预热的同时，将每个样本的3个PCR重复反应产物合并至同一离心管中，完成PCR样本的制备。
  4. 将样本加载至仪器上。
  5. 短暂涡旋并离心合并后的PCR产物管，使液体沉降至管底。
  6. 将仪器用96孔板置于室温下的支架上，并做好标记。
  7. 短暂涡旋并离心样品缓冲液和分子量标记物。
  8. 向96孔板的每个孔中加入3 µL样品缓冲液（每块胶带至少需要53 µL）。
  9. 运行偶数个样本；若样本数量为奇数，则在空孔中加入4 µL样品缓冲液。
  10. 向指定的标记物孔中加入1 µL分子量标记物。
  11. 根据样本排布图，向对应的孔中加入1 µL合并后的PCR产物。
  12. 用铝箔封膜覆盖96孔板。
  13. 使用仪器配套的涡旋仪及适配器，以2,000 rpm速度涡旋混匀96孔板1分钟。
  14. 短暂离心使样本完全沉降至孔底，若存在气泡则再次离心去除。
  15. 启动仪器控制软件。
  16. 将胶带和加样尖端装入仪器中。
  17. 使用96孔板适配器将样本加载至片段分析仪中。
  18. 通过控制器软件设置运行程序。
  19. 确保选择偶数编号的孔位进行运行。
  20. 输入样本编号。
  21. 检查胶带上的所有孔位是否均以灰色高亮显示。
  22. 确认分析仪已识别所有移液尖端。
  23. 选择“开始”运行，并指定文件名以保存结果（建议包含研究名称、样本编号和日期）。
  24. 更多详细信息请参考仪器制造商的操作说明。
  25. 运行结束后，丢弃移液尖端、胶带和反应管。
  26. 分析16S扩增片段的nM浓度（V4区目标片段大小为315–450 bp）。该峰大小会因所选引物不同而有所差异。

5. 文库计算、混合、纯化及质量控制

  1. 确定所有样品的扩增子大小和摩尔浓度后，将文库混合，以达到混合文库最终所需的体积和纳摩尔浓度（参见示例计算）。
  2. 根据制造商的说明书，使用基于硅胶膜的PCR产物纯化试剂盒对混合文库进行纯化和浓缩（参见材料表）。
    1. 用50 µL洗脱液洗脱DNA。
  3. 使用双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒，立即按照制造商的说明书通过荧光计测定纯化后文库的浓度。
    1. 将2 µL混合并纯化后的文库与198 µL稀释缓冲液加染料混合，进行1:100稀释。
    2. 记录荧光计测得的数值，并根据稀释倍数进行换算。
  4. 根据混合文库的浓度读数（ng/µL），计算文库的摩尔浓度（nM）。取1 µL未稀释的文库，在微量分光光度计上测定OD260/280。
    注意：1.8 - 2.0的数值表明文库纯度符合要求。
  5. 将最终文库于-20 °C保存，直至进行下一代测序。

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结果

本文所述方案包含重要的质量控制（QC）步骤，以确保所获得的数据符合该方案在灵敏度、特异性和污染控制方面的基准要求。方案中的第一个质量控制步骤是在扩增16S V4区之后进行PCR产物检测（图2）。通过电泳分析每个样本1 µL的PCR产物，以确认其片段大小在预期的315 - 450 bp范围内（图2，红色箭头）。部分人乳样本产生的特异性产物量较低（图2A，比较第3泳道与第9–11泳道同第4–8泳道），提示这些样本中提取的微生物DNA含量可能较低，或在提取过程中残留了PCR抑制物。对于在315 - 450 bp范围内产生的产物浓度低于2.0 nM的样本（图2A，第7泳道），需使用单步纯化试剂盒去除PCR抑制物，并对样本重新进行扩增。经纯化后样本扩增恢复的成功率约为40%。对每个样本的特异性产物进行定量（

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讨论

靶向16S rRNA的高通量测序是一种广泛使用的快速微生物组表征技术18。然而，许多因素，包括批次效应、环境污染物、样本交叉污染、灵敏度和可重复性，可能对实验结果产生不利影响，并干扰结果的解读7,19,20。为了更好地实现可靠的16S分析，微生物组实验流程必须包含良好的实验设计、适当的对照使用、操作步骤的空间隔离以及最佳实践的应用。本文所述方案整合了上述各项参数，并提供了重要的实验工具，以应对上述挑战，实现在多种样本中开展16S实验流程。

良好的实验设计对于16S微生物组分析至关重要。这包括样本的正确采集与保存，以及针对目标区域选择合适的16S引物。例如，V4区（515F/806R）被选用于人乳样本，因其对该区域具有良好的扩增效果 双歧杆菌， 在新生儿肠道微生物组的发育过程中起着重要作用21

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Helty Adisetiyo博士和杨尚 Xin 博士对本实验方案的开发所做出的贡献。国际母婴青少年艾滋病临床试验组（IMPAACT）的整体支持由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）根据资助编号UM1AI068632（IMPAACT LOC）、UM1AI068616（IMPAACT SDMC）和UM1AI106716（IMPAACT LC）提供，并由Eunice Kennedy Shriver儿童健康与人类发展国家研究所（NICHD）和国家心理健康研究所（NIMH）联合资助。本内容仅由作者负责，不代表NIH的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204DNA/RNA 提取试剂盒
EliminaseFisher Scientific435532RNase、DNase 和 DNA 去污染剂
Thermo MixerFisher Scientific温控振荡仪
Buffer RLT plusQiagen1053393硫氰酸胍裂解缓冲液，Allprep 试剂盒组分之一
ß-MercaptoethanolSigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME 是一种还原剂，可通过还原二硫键不可逆地使 RNase 变性
LME BeadsMP Biomedicals116914050珠管
QIAgen TissueLyzerQiagen85300自动化样品破碎仪适配器组
QIAshredder 柱Qiagen79654
QIAgen RB 管厂商提供的试剂盒用微量离心管
QIAcube 及相关塑料耗材Qiagen9001292自动化 DNA/RNA 纯化仪器
DNA exitus plusApplichemA7089非酶法去污染溶液
EB 缓冲液Qiagen19086洗脱缓冲液
QIAgility 及相关塑料耗材Qiagen9001532自动化液体处理机器人
PCR 用水MO BIO17000-
5PRIME HotMasterMixQuantabio2200400
带条形码的反向引物Eurofin无目录编号自行设计并订购
96 孔 PCR 板USA scientific1402-9708
Tapestation 2200 及相关塑料耗材AgilentG2964AA自动化 DNA/RNA 片段分析仪
Tapestation 用 D1000 试剂Agilent5067-5585该试剂盒包含样品缓冲液和分子量标记
OneStep PCR 抑制物去除试剂盒Zymo Research50444470按照厂商说明书进行 PCR 抑制物去除
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104DNA 纯化试剂盒：基于硅胶膜纯化 PCR 产物
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo FisherQ32854该试剂盒包含基于二甲基亚砜的稀释缓冲液和染料
Qubit 荧光计Thermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fisher微量分光光度计
MiSeq 300 V2 试剂盒Illumina15033624/15033626
MiSeqIllumina无目录编号下一代测序仪

参考文献

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