同时测定含黄素线粒体脱氢酶产生的超氧阴离子/过氧化氢及NADH

摘要

线粒体含有多种依赖黄素的酶，这些酶能够产生活性氧（ROS）。由于存在不必要的副反应，监测线粒体内特定位点的活性氧释放具有挑战性。本文介绍一种简便且低成本的方法，利用纯化的黄素酶和微孔板荧光测定法直接评估活性氧释放的天然速率。

摘要

据报道，线粒体中可能含有多达12种产生活性氧（ROS）的酶来源。其中大多数位点包括依赖黄素的呼吸复合物和脱氢酶，它们可产生超氧阴离子（O₂^●-）和过氧化氢（H₂O₂）的混合物。由于抗氧化防御系统 以及同样可生成O₂^●-/H₂O₂的副反应的存在，准确量化分离线粒体中各个位点的ROS生成潜力具有挑战性。使用可能破坏线粒体生物能量学的非特异性抑制剂也可能通过改变其他产生位点的ROS释放而影响测量结果  。本文介绍了一种简便的方法，可用于同时测定经纯化的黄素连接脱氢酶释放H₂O₂和生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的能力。在本研究中，我们以猪心来源的纯化丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合物（KGDHC）为例进行说明。该方法可通过消除其他潜在的ROS来源及抗氧化系统，准确测定各个产生位点固有的H₂O₂释放速率。此外，该方法还可直接比较H₂O₂释放与酶活性之间的关系，并可用于筛选抑制剂在抑制ROS生成方面的有效性与选择性。总体而言，该方法可在开展更复杂的分离线粒体或透化肌纤维实验之前，对单个酶固有的ROS释放速率进行深入评估。

引言

营养代谢的最终目标是生成三磷酸腺苷（ATP）。在哺乳动物细胞中，这一过程发生于线粒体——一种具有双层膜结构的细胞器，可将碳中储存的能量转化为ATP。ATP的生成始于线粒体对碳的氧化，产生两种电子载体：NADH和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH₂）。₂)¹NADH 和 FADH₂ 随后分别被多亚基呼吸复合物I和II氧化，释放出的电子被传递至最终电子受体分子氧（O₂）。₂复合体 IV¹热力学上有利的 "下坡" 电子向O的转移₂ 在电子传递链末端，复合物I、III和IV将质子泵入膜间隙，从而建立跨膜的质子电化学梯度（质子驱动力），这是一种暂时储存的吉布斯自由能，可被复合物V利用以合成ATP。²线粒体中的电子传递反应与ATP生成并非完全偶联。在三羧酸循环和呼吸链的多个位点，电子可能提前与O₂发生相互作用₂ 形成活性氧（ROS）³. 线粒体产生的最具生物学意义的活性氧是O₂^●- 和 H₂O₂尽管 O₂^●- 通常被认为是由线粒体产生的初级活性氧（ROS），目前的研究表明其生成位点会产生混合的O₂·⁻₂^●- 和 H₂O₂，这与黄素辅基的自由基化学相关^4,5高水平时，活性氧可能具有危险性，会损伤细胞功能所必需的生物组分，导致氧化应激⁶然而，在低浓度时，线粒体活性氧具有重要的信号传导功能。例如，H₂O₂ 线粒体释放已被认为在调控T细胞活化和应激信号传导中起重要作用（例如，Nrf2 信号通路的激活、细胞增殖与分化的诱导、胰岛素信号传导与释放，以及摄食行为⁷在理解活性氧（ROS）的信号功能方面已取得显著进展。然而，关于线粒体中哪些酶是最重要来源以及其产生如何被调控等问题，仍尚待明确。

活性氧（ROS）在产生位点的释放取决于多个因素：1）电子供体位点的浓度，2）电子供体位点的氧化还原状态，3）对氧气的可及性，以及4）氧化底物的浓度和类型^3,8,9。在线粒体中，其他因素如NADH浓度和膜电位强度也会影响ROS的生成^8,10。例如，纯化的丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）或α-酮戊二酸脱氢酶复合体（KGDHC）产生O₂^●-/H₂O₂的速率随着NADH可用性的增加而升高^5,11。在此情况下，电子从NADH逆向流向PDHC或KGDHC的E₃亚基中的FAD中心，该位点即为O₂^●-/H₂O₂的产生位点¹²。类似地，提供NAD⁺则具有相反效果，可降低KGDHC释放ROS¹²。因此，调控电子进入或离开ROS产生位点的过程，能够改变所形成的O₂^●-/H₂O₂的量。例如，使用脂酸类似物CPI-613阻断PDHC或KGDHC的E₂亚基，可使O₂^●-/H₂O₂的生成减少近90%¹³。使用化学性S-谷胱甘肽化催化剂——二酰胺（diamide）和二硫仑（disulfiram），通过将谷胱甘肽共价连接至E₂亚基，几乎完全抑制PDHC或KGDHC的O₂^●-/H₂O₂生成，也可获得类似结果¹⁴。阻断PDHC和KGDHC中E₂亚基的电子传递的代价是NADH生成减少，从而削弱电子传递链（例如，复合体III）介导的ROS形成。这还可能导致电子传递链的ATP输出下降。总体而言，阻断电子进入ROS产生位点是控制O₂^●-/H₂O₂生成的一种极为有效的方法。

线粒体可能含有最多12个潜在的O₂^●-/H₂O₂来源⁶。其中大多数位点是含黄素的酶，可产生O₂^●-和H₂O₂的混合物。通过使用不同的底物和抑制剂组合，已能够鉴定出在不同组织中哪些呼吸复合物和线粒体脱氢酶是高产能的O₂^●-/H₂O₂生成位点³。已有研究表明，丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合体（KGDHC）在肌肉和肝脏线粒体中是高产能的O₂^●-/H₂O₂释放位点^13,15。然而，在研究线粒体内各个位点产生O₂^●-/H₂O₂的潜力，以及不同底物和抑制剂组合对酶活性影响方面，仍存在一些困难。这主要是由于存在非特异性副反应（例如，除目标酶以外的其他位点产生O₂^●-/H₂O₂）、内源性营养物质（例如，脂肪酸）或细胞器（例如，过氧化物酶体，其也能生成O₂^●-/H₂O₂）的污染，以及所用抑制剂缺乏选择性，和/或所用化合物无法完全抑制活性氧（ROS）的生成。某些抑制剂还可能改变线粒体的生物能量状态和电子传递方向，从而改变其他产生活性氧位点的释放水平，干扰实验结果。此外，由于线粒体基质和膜间隙中含有高浓度的O₂^●-和H₂O₂清除酶，因此难以准确定量各个位点释放O₂^●-/H₂O₂的绝对速率。因此，在鉴定高产能O₂^●-/H₂O₂生成位点时，消除可能干扰O₂^●-/H₂O₂释放测定的任何竞争性反应将具有重要意义。

本文介绍一种简单的方法，可用于同时检测经纯化的黄素依赖性脱氢酶产生的 O₂^●-/H₂O₂ 以及 NADH 的生成情况。通过使用纯化的酶，可消除非特异性活性氧（ROS）生成的副反应及降解 ROS 的酶类干扰，从而更准确地测定单个黄素酶固有的 O₂^●-/H₂O₂ 生成速率。该方法可用于直接比较不同纯化脱氢酶在生成 O₂^●-/H₂O₂ 方面的能力，或用于筛选针对 O₂^●-/H₂O₂ 释放的潜在特异性抑制剂。最后，通过同时测定 O₂^●-/H₂O₂ 和 NADH 的生成，可实时评估酶活性与活性氧释放能力之间的关系。

方案

1. 化学品与纯化酶

1. 准备以下材料：猪心脏来源的丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合物（KGDHC）（或其他纯化的线粒体黄素酶）；H₂O₂（30% 溶液）、丙酮酸、α-酮戊二酸、NAD⁺、NADH、CoASH、硫胺素焦磷酸（TPP）、甘露醇、HEPES、蔗糖、EGTA、3-甲基-2-氧代戊酸（KMV）、超氧化物歧化酶（SOD）、辣根过氧化物酶（HRP）、10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪试剂（AUR）以及 CPI-613。

2. 实验设计与试剂准备

1. 按照表1在96孔板中建立检测体系。
   注意：每个反应的总体积为200 µL。调整储备液浓度，使每孔加入20 µL试剂。这可确保在启动检测前快速向每个反应孔中加入辅因子和底物。
2. 配制含有220 mM甘露醇、70 mM蔗糖、1 mM EGTA和20 mM HEPES（用HCl调节pH至7.4）的反应缓冲液。
   注意：根据不同的纯化酶的物理性质，此缓冲液成分可能需要调整。
3. 通过酶活性检测^14,16,17，或通过免疫印迹或考马斯亮蓝染色⁵，检查纯化的KGDHC或PDHC是否存在污染。
4. 根据表1中的工作液浓度，用反应缓冲液配制所有试剂。
5. 将所有试剂以1 mL分装于-20 °C保存。将丙酮酸和α-酮戊二酸以100 µL分装于-80 °C保存，以防止因自氧化和反复冻融导致的自发降解。
6. 将AUR试剂母液溶于1 mL DMSO中，然后用反应缓冲液稀释至100 µM。避光保存。
   注意：此处的100 µM工作液每2至3周新鲜配制一次，并始终避光保存。

3. 建立检测模板

1. 在具有双波长测量功能的单色微孔板读数仪上建立检测程序。
2. 通过选择定义读取程序 "实验方案"然后点击 "实验步骤".
3. 设置 "温度" 至 25 °C（图1A).
4. 点击 "起始动力学" 设置读取条件（图1A设置读取时间间隔/实验的次数和时间。
5. 点击 "阅读" (图1B).
   注意：样品从顶部位置读取，增益为50。时间：5分钟，每30秒读取一次。通道1：Resorufin荧光——激发/发射波长 = 565 nm:600 nm，波长带宽为13.5 nm。通道2：NADH自发荧光——激发/发射波长 = 376 nm:450 nm，波长带宽为20 nm。
6. 下 "阅读"，选择需要监测的孔例如，A1-A4 和 B1-B4）。
7. 选择 "终末动力学".

4. 标准曲线

1. 将试剂解冻并置于冰上保存，直至使用。
2. NADH 标准曲线（图 2A）
   1. 用反应缓冲液配制浓度范围为 0.5–10 mM 的 NADH 工作液。
   2. 从每种 NADH 工作液中取 20 µL 加入含 180 µL 反应缓冲液的孔中。每孔中 NADH 的终浓度为 0.05–1 mM。
   3. 点击 "READ"，设置激发/发射波长 = 376 nm:450 nm，带宽为 20 nm。
      注意：仅进行终点读数，无需动力学参数。
3. AUR 标准曲线（图 2B）
   1. 用反应缓冲液配制过氧化氢工作液，其浓度范围为 200–4,000 nM。
   2. 向每个孔中加入 120 µL 反应缓冲液。
   3. 向每个含反应缓冲液的孔中加入 20 µL HRP（工作液浓度 = 30 U/mL，孔中终浓度 = 3 U/mL）、20 µL SOD（工作液浓度 = 250 U/mL，孔中终浓度 = 25 U/mL）和 20 µL AUR（工作液浓度 = 100 µM，孔中终浓度 = 10 µM）。
   4. 向每个含有缓冲液和检测试剂的孔中加入 20 µL 不同浓度的 H₂O₂ 工作液。最终反应体积为 200 µL，每孔中 H₂O₂ 的终浓度为 20–400 nM。
   5. 将酶标板在酶标仪中 25 °C 下孵育 1 分钟。
   6. 点击 "READ"，设置激发/发射波长 = 565 nm/600 nm，带宽为 13.5 nm。注意：仅进行终点读数，无需动力学参数。

5. 测定KGDHC和PDHC释放的O₂ ^●-/H₂O₂及NADH的生成

1. 不同试剂的添加顺序、各工作液的浓度以及每孔添加的体积详见表1。
2. 向每孔中加入40 µL反应缓冲液。对于使用KMV或CPI-613的实验，每孔加入20 µL缓冲液。
3. 向每孔中加入20 µL PDHC或KGDHC（工作储备液浓度为1 U/mL，每孔终浓度 = 0.1 U/mL）。
4. 在25 °C下孵育PDHC和KGDHC 2分钟。
5. 向每孔加入20 µL KMV（工作储备液浓度 = 100 mM，终浓度 = 10 mM）或20 µL CPI-613（工作储备液浓度 = 1.5 mM，终浓度 = 150 µM）（表2）。
   注意：若实验中不使用抑制剂，可省略此步骤。
6. 在25 °C下孵育1分钟。
   注意：若实验中不使用抑制剂，可省略此步骤。
7. 向每孔中加入20 µL HRP（工作储备液浓度 = 30 单位/mL，孔内终浓度 = 3 单位/mL）和20 µL SOD（工作储备液浓度 = 250 单位/mL，孔内终浓度 = 25 单位/mL）。
8. 向每孔中加入20 µL辅酶A（工作储备液浓度 = 1 mM，终浓度 = 0.1 mM）、20 µL TPP（工作储备液浓度 = 3 mM，终浓度 = 0.3 mM）和20 µL NAD⁺（工作储备液浓度 = 10 mM，终浓度 = 1 mM）。
9. 将AUR试剂从避光铝箔中取出，向每孔加入20 µL。
10. 向含有PDHC的孔中加入20 µL丙酮酸（工作储备液浓度范围为1–100 mM，实验终浓度 = 0.1–10 mM），向含有KGDHC的孔中加入20 µL α-酮戊二酸（工作储备液浓度范围为1–100 mM，实验终浓度 = 0.1–10 mM）。
11. 点击 "READ" 开始动力学测定。

6. 数据分析

1. 按住键盘上的“CTRL”键，然后点击孔位，生成包含通道1所有动力学测量数据的图表（图3A）。
2. 在右上角视图图标中点击"数据"，以查看在不同时间点测得的相对荧光单位（RFU）原始值（图3B）。
3. 导出数据用于分析（表3）。
4. 点击右上角的"图表"下拉菜单（图3B），查看与荧光通道2相关的RFU值。
5. 对通道2重复步骤6.1至6.3。

结果

图3A 展示了纯化的α-酮戊二酸脱氢酶复合体（KGDHC）同时测定NADH和H₂O₂生成时所采集的相对荧光单位（RFU）的代表性曲线。图3B 显示了每个时间间隔的原始RFU数据。随后将原始RFU数据导出用于分析。通过外推图2中所示的标准曲线，可确定在5分钟内各测量时间点生成的NADH和H₂O₂的绝对量。表3 提供了该计算方法的一个示例。在确定KGDHC或丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）在不同时间间隔生成的NADH和H₂O₂量后，将数值复制并输入图形/统计分析软件进行进一步分析。采用XY图类型分析，可将KGDHC或PDHC生成的NADH（µmol）和H₂O₂（pmol）随时间的变化绘制成图（<...

讨论

该方案具有以下优势：1）消除了可能干扰H的任何竞争性反应₂O₂ 检测例如，抗氧化系统或其他活性氧来源），2）可直接评估含黄素的线粒体脱氢酶在天然状态下的活性氧释放速率，3）允许比较两种或多种纯化的基于黄素的脱氢酶在天然状态下的活性氧释放速率，4）可实现活性氧释放速率与酶活性的直接比较，5）可用于筛选对活性氧释放具有选择性竞争性抑制作用的抑制剂。本课题组及其他研究团队已在先前发表的研究中使用该方法，在开展线粒体或透化肌肉实验之前，探究别构调节和氧化还原信号通路对活性氧生成的调控作用^{14,16,17,19,20}.

修改与故障排除：

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮酸脱氢酶复合体	SIGMA	P7032-10UN	纯化的黄素酶
α-酮戊二酸脱氢酶复合体	SIGMA	K1502-20UN	纯化的黄素酶
30% 过氧化氢溶液	SIGMA	HX0640-5	试剂，用于标准曲线
NAD+	SIGMA	N0632-1G	试剂，用于活性/ROS释放检测
NADH	SIGMA	N4505-100MG	试剂，用于标准曲线
丙酮酸	SIGMA	P2256-5G	试剂，用于活性/ROS释放检测
α-酮戊二酸	SIGMA	75892-25G	试剂，用于活性/ROS释放检测
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	试剂，用于活性/ROS释放检测
硫胺素焦磷酸	SIGMA	C8754-1G	试剂，用于活性/ROS释放检测
甘露醇	SIGMA	M4125-100G	缓冲液组分
Hepes	SIGMA	H3375-25G	缓冲液组分
蔗糖	SIGMA	S7903-250G	缓冲液组分
EGTA	SIGMA	E3889-10G	缓冲液组分
KMV	SIGMA	198978-5G	试剂，ROS释放抑制剂
CPI-613	Santa Cruz	sc-482709	试剂，ROS释放抑制剂
SOD	SIGMA	S9697-15KU	试剂，ROS释放检测
辣根过氧化物酶	SIGMA	P8375-1KU	试剂，ROS释放检测
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	试剂，ROS释放检测
Biotech Synergy 2 微孔板读板仪	BioTek Instruments		用于检测的微孔板读板仪
Gen5 软件	BioTek Instruments		软件，用于原始RFU数据采集
Graphpad Prism	Graphpad software		软件，数据分析
Microsoft EXCEL	Microsoft		软件，数据分析