线粒体含有多种依赖黄素的酶，这些酶能够产生活性氧（ROS）。由于存在不必要的副反应，监测线粒体内特定位点的活性氧释放具有挑战性。本文介绍一种简便且低成本的方法，利用纯化的黄素酶和微孔板荧光测定法直接评估活性氧释放的天然速率。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
据报道，线粒体中可能含有多达12种产生活性氧（ROS）的酶来源。其中大多数位点包括依赖黄素的呼吸复合物和脱氢酶，它们可产生超氧阴离子（O2●-）和过氧化氢（H2O2）的混合物。由于抗氧化防御系统 以及同样可生成O2●-/H2O2的副反应的存在，准确量化分离线粒体中各个位点的ROS生成潜力具有挑战性。使用可能破坏线粒体生物能量学的非特异性抑制剂也可能通过改变其他产生位点的ROS释放而影响测量结果 。本文介绍了一种简便的方法，可用于同时测定经纯化的黄素连接脱氢酶释放H2O2和生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的能力。在本研究中，我们以猪心来源的纯化丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合物（KGDHC）为例进行说明。该方法可通过消除其他潜在的ROS来源及抗氧化系统，准确测定各个产生位点固有的H2O2释放速率。此外，该方法还可直接比较H2O2释放与酶活性之间的关系，并可用于筛选抑制剂在抑制ROS生成方面的有效性与选择性。总体而言，该方法可在开展更复杂的分离线粒体或透化肌纤维实验之前，对单个酶固有的ROS释放速率进行深入评估。
引言
营养代谢的最终目标是生成三磷酸腺苷（ATP）。在哺乳动物细胞中，这一过程发生于线粒体——一种具有双层膜结构的细胞器，可将碳中储存的能量转化为ATP。ATP的生成始于线粒体对碳的氧化，产生两种电子载体：NADH和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH₂）。2)1NADH 和 FADH2 随后分别被多亚基呼吸复合物I和II氧化，释放出的电子被传递至最终电子受体分子氧（O₂）。2复合体 IV1热力学上有利的 "下坡" 电子向O的转移2 在电子传递链末端，复合物I、III和IV将质子泵入膜间隙，从而建立跨膜的质子电化学梯度（质子驱动力），这是一种暂时储存的吉布斯自由能，可被复合物V利用以合成ATP。2线粒体中的电子传递反应与ATP生成并非完全偶联。在三羧酸循环和呼吸链的多个位点，电子可能提前与O₂发生相互作用2 形成活性氧（ROS）3. 线粒体产生的最具生物学意义的活性氧是O2●- 和 H2O2尽管 O2●- 通常被认为是由线粒体产生的初级活性氧（ROS），目前的研究表明其生成位点会产生混合的O₂·⁻
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 化学品与纯化酶
- 准备以下材料：猪心脏来源的丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）和α-酮戊二酸脱氢酶复合物（KGDHC）（或其他纯化的线粒体黄素酶）；H2O2（30% 溶液）、丙酮酸、α-酮戊二酸、NAD+、NADH、CoASH、硫胺素焦磷酸（TPP）、甘露醇、HEPES、蔗糖、EGTA、3-甲基-2-氧代戊酸（KMV）、超氧化物歧化酶（SOD）、辣根过氧化物酶（HRP）、10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪试剂（AUR）以及 CPI-613。
2. 实验设计与试剂准备
- 按照表1在96孔板中建立检测体系。
注意：每个反应的总体积为200 µL。调整储备液浓度，使每孔加入20 µL试剂。这可确保在启动检测前快速向每个反应孔中加入辅因子和底物。 - 配制含有220 mM甘露醇、70 mM蔗糖、1 mM EGTA和20 mM HEPES（用HCl调节pH至7.4）的反应缓冲液。
注意：根据不同的纯化酶的物理性质，此缓冲液成分可能需要调整。 - 通过酶活性检测14,16,17，或通过免....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图3A 展示了通过纯化的KGDHC同时检测H2O2和NADH生成时所获得的RFU代表性曲线。图3B 显示了每个时间间隔的原始RFU数据。随后将原始RFU数据导出用于分析。通过外推图2中所示的标准曲线，可确定在5分钟期间内每个测量时间点生成的NADH和H2O2的绝对量。表3 提供了该计算方法的一个示例。一旦确定了KGDHC或PDHC在不同时间点生成的NADH和H2O2的量，即可将这些数值复制并输入图形/统计分析软件进行进一步分析。采用XY图类型分析，可将KGDHC或PDHC生成的NADH（µmol）和H2O2（pmol）随时间的变化绘制成图（图4A<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该方案具有以下优势：1）消除了可能干扰H的任何竞争性反应2O2 检测例如，抗氧化系统或其他活性氧来源），2）可直接评估含黄素的线粒体脱氢酶在天然状态下的活性氧释放速率，3）允许比较两种或多种纯化的基于黄素的脱氢酶在天然状态下的活性氧释放速率，4）可实现活性氧释放速率与酶活性的直接比较，5）可用于筛选对活性氧释放具有选择性竞争性抑制作用的抑制剂。本课题组及其他研究团队已在先前发表的研究中使用该方法，在开展线粒体或透化肌肉实验之前，探究别构调节和氧化还原信号通路对活性氧生成的调控作用14,16,17,19,20.
修改与故障排除：
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助。视频制作由纽芬兰纪念大学教学创新中心（CITL）协作完成。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮酸脱氢酶复合体 | SIGMA | P7032-10UN | 纯化的黄素酶 |
| α-酮戊二酸脱氢酶复合体 | SIGMA | K1502-20UN | 纯化的黄素酶 |
| 30% 过氧化氢溶液 | SIGMA | HX0640-5 | 试剂，用于标准曲线 |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | 试剂，用于活性/ROS释放检测 |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | 试剂，用于标准曲线 |
| 丙酮酸 | SIGMA | P2256-5G | 试剂，用于活性/ROS释放检测 |
| α-酮戊二酸 | SIGMA | 75892-25G | 试剂，用于活性/ROS释放检测 |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | 试剂，用于活性/ROS释放检测 |
| 硫胺素焦磷酸 | SIGMA | C8754-1G | 试剂，用于活性/ROS释放检测 |
| 甘露醇 | SIGMA | M4125-100G | 缓冲液组分 |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | 缓冲液组分 |
| 蔗糖 | SIGMA | S7903-250G | 缓冲液组分 |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | 缓冲液组分 |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | 试剂，ROS释放抑制剂 |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | 试剂，ROS释放抑制剂 |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | 试剂，ROS释放检测 |
| 辣根过氧化物酶 | SIGMA | P8375-1KU | 试剂，ROS释放检测 |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | 试剂，ROS释放检测 |
| Biotech Synergy 2 微孔板读板仪 | BioTek Instruments | 用于检测的微孔板读板仪 | |
| Gen5 软件 | BioTek Instruments | 软件，用于原始RFU数据采集 | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | 软件，数据分析 | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | 软件，数据分析 |
参考文献
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
