通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

摘要

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。

摘要

急性髓系白血病（AML）是一种具有异质性且未经治疗可致死的疾病，是成人白血病相关死亡的最常见原因。AML最初起源于造血干细胞（HSC），其特征是分化受阻、白血病原始细胞随之积聚，以及功能性造血成分生成减少。这种异质性还体现在白血病干细胞（LSC）的存在上，这一动态细胞群体在白血病进展和治疗过程中不断演化，以应对各种选择压力。为进一步界定LSC群体，联合使用CD90和CD45RA标志物可实现对CD34+CD38-细胞区室中正常HSC和多能祖细胞的区分。本文介绍了一种通过多参数流式细胞术检测人AML原代原始细胞上多个潜在LSC标志物（CD34、CD38、CD45RA、CD90）同时表达的实验方案。此外，我们展示了如何定量三种祖细胞群体及一种具有不同程度成熟特征的潜在LSC群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中验证了这些细胞群体的存在。该对潜在LSC进行检测与定量的方法可用于化疗反应的临床随访（即，微小残留病），因为残留的LSC可能导致AML复发。

引言

急性髓系白血病（AML）是导致白血病相关死亡的最常见原因。最初，AML 是一种造血干细胞（HSC）的克隆性疾病，其特征是分化受阻、原始细胞继而积聚，以及功能性造血成分的生成减少。近年来，主要通过采用下一代测序（NGS）策略，证实了原始细胞群体存在克隆异质性，并揭示了肿瘤细胞存在亚克隆演化的现象¹。

异质性体现在白血病干细胞（LSC）的存在上。人们推测，这一动态的细胞区室在白血病进展和治疗过程中会不断演化，以应对各种施加的选择压力。因此，LSC被认为对当前的化疗方案具有耐药性，并介导疾病的复发，具有重要的临床意义²。已有多种标志物被用于表征LSC，例如CD123³、CLL-1⁴、CD97⁵和TIM-3⁶。原始细胞中的CD34+CD38-细胞区室被认为富含LSC⁷，但也包含正常的造血干细胞（HSC）。将CD90和CD45RA的表达情况应用于CD34+CD38-（P6）区室（图1），可进一步区分出多个阶段的正常与恶性造血前体细胞⁸。具体而言，在大多数急性髓系白血病（AML....

方案

我们遵循欧洲关于将动物用于科学目的的标准。本研究已获得当地伦理委员会的批准（#3097-2015120414583482v3）。

1. 样品制备

1. 从骨髓中采集（2 mL） 从头合成 含抗凝剂乙二胺四乙酸的试管中的急性髓系白血病样本 （EDTA）浓度为每毫升骨髓1.8 mg。
2. 进行Ficoll分离，即密度梯度分离，以从红细胞和粒细胞中分离单个核细胞，步骤如下：将骨髓用3体积的 磷酸盐缓冲液（PBS：NaCl 137 mM，KCl 2.7 mM，Na₂HPO₄ 10 mM，KH₂PO₄ 1.8 mM)。将1体积的Ficoll与1体积稀释后的骨髓液小心叠加。在300 × g下离心30分钟，不启用刹车。将单个核细胞的白色中间层（buffy coat）转移至新的无菌离心管中。
3. 用10 mL PBS洗涤细胞两次，300 × g离心5分钟，以去除污染的血清成分。

2. 红细胞（RBC）裂解

1. 向细胞沉淀中加入 2 mL 裂解缓冲液（0.8% 氯化铵），轻轻涡旋混匀，室温孵育 5 分钟。在 300 × g 离心 5 分钟。
   注意：如有必要，可重复此步骤。
2. 按照前述方法（1.3 节）....

结果

在此，我们介绍一种用于确定正常和恶性人类骨髓样本中前体细胞群体的方法。我们从一个成功的PDX模型中采集了骨髓和脾脏组织，并按照上述方法进行多参数流式细胞术分析。我们比较了诊断时患者样本与其相应PDX模型中多个原始细胞亚群，特别是CD34+CD38-前体细胞区室，该区室被认为富含潜在的白血病干细胞（LSC）。我们发现，PDX模型中的CD34+CD38-原始细胞比例较诊断时患者样本更高（3.48% vs. 0.53%） 图 2C, D）。有趣的是，我们发现PDX中具有CD34+CD38-CD90-CD45RA+表型的疑似LSC比例高于原始患者样本（2.76% vs. 0.48%） 图 2E, F)，提示在此小鼠模型的造血组织中可能存在恶性前体细胞的富集。PDX模型与患者样本中正常前体细胞组分的频率无显著差异。
此外，我们根据CD34、CD38、CD90和CD45A的表达情况（如本方案所述），分析了两个不同患者样本在诊断时及治疗随访期间的原始细胞祖细.......

讨论

准确且可重复地通过流式细胞术评估膜或胞质标志物，需要每天验证仪器设置，以确保光学对准以及流体系统的正常运行，  光学敏感性，以及使用校准微球进行标准化。

利用CD90和CD45RA通过多参数流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）中的原始细胞群体是一种相对简单且可靠的方法。该分析中的关键步骤是准确评估原始细胞上CD38的表达水平，以正确圈定CD34+CD38-细胞群。CD38的表达强度通过正常骨髓中的造血祖细胞和/或浆细胞（CD38+）来确定。其他标记物的强度则通过同型对照来确定。

通过加入CD45RA和CD90可用于区分造血干细胞（HSC）与假定的白血病干细胞（LSC）。后者而非HSC可能是疾病复发的原因，因此该方案对于利用流式细胞术检测面板进行微小残留病监测具有重要意义。在治疗过程中对急性髓系白血病（AML）进行监测，对于改善风险分层和指导AML治疗至关重要。然而，并非所有患者都有合适的分子标志物。因此，通过流式细胞术进行MRD监测可能适用于所有AML病例。尽管该方法可能并不全面，因其主要针对具有CD34+CD38.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
潘科尔	PAN-Biotech	P04-60500
红细胞裂解缓冲液 (10x)	Ozyme	BLE420301	红细胞裂解液 A：8.29 g NH4Cl + 0.037 g Na2EDTA 溶于 100 mL 无菌 H2O；红细胞裂解液 B：1 g KHCO3 溶于 100 mL 无菌 H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  小鼠	JACKSON LABORATORY	货号：005557
PBS	Gibco by life technologies	14190-144
AutoMACS 运行缓冲液 – MACS 分离缓冲液	MACS Buffer Miltenybiotec	130-091-221
抗 CD36-FITC（克隆 FA6-152，Iotest）	Beckman Coulter	PN IM0766U
抗 CD33-PC5.5（克隆 D3HL60.251，Iotest）	Beckman Coulter	B36289
抗 CD90-APC（克隆 5E10）	Biolegend	328114
抗 CD19-ECD（克隆 J3-119，Iotest）	Beckman Coulter	A07770
抗 CD34-AA700（克隆 581，Iotest）	Beckman Coulter	B92417
抗 CD45RA-APC-H7（克隆 HI100）	Beckton Dickinson	560674
抗 CD38-Pacific Blue（克隆 LSI98-4-3，Iotest）	Beckman Coulter	B92396
抗 CD45-KO（克隆 J.33，Iotest）	Beckman Coulter	B36294
抗 CD3-PE	Beckman Coulter	IM1451
抗 CD20-PE	Beckman Coulter	A07747
抗 CD123-PC7	Beckman Coulter	B13647
Flow-Set	Beckman Coulter	A63492
Flow-Check	Beckman Coulter	A63493
Navios	Beckman Coulter	DS-14644A
LSR Fortessa X20	BD Biosciences
CST BD	BD Biosciences	655051
FacsFlow	BD Biosciences	336911
抗 hCD45-FITC	Biolegend	BLE304006
抗 mCD45-APC	Biolegend	BLE103112
EasySep 人 PE 选择试剂盒	Stem Cell Technologies	18000
EasySep  磁力架	Stem Cell Technologies	18551