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方法文章

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

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DOI：

10.3791/56976

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2018年3月26日

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1Laboratoire d’hématologie, CHU Lille, 2Univ. Lille, Inserm, CHU Lille, UMR-S 1172 - JPArc - Centre de Recherche Jean-Pierre AUBERT Neurosciences et Cancer, 3Service d’hématologie pédiatrique, hôpital Jeanne de Flandre, CHU Lille, 4Laboratoire d’hématologie CH Lyon Sud, 5Service des Maladies du Sang, hôpital Claude Huriez, CHU Lille

本文内容

摘要

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。

摘要

急性髓系白血病（AML）是一种具有异质性且未经治疗可致死的疾病，是成人白血病相关死亡的最常见原因。AML最初起源于造血干细胞（HSC），其特征是分化受阻、白血病原始细胞随之积聚，以及功能性造血成分生成减少。这种异质性还体现在白血病干细胞（LSC）的存在上，这一动态细胞群体在白血病进展和治疗过程中不断演化，以应对各种选择压力。为进一步界定LSC群体，联合使用CD90和CD45RA标志物可实现对CD34+CD38-细胞区室中正常HSC和多能祖细胞的区分。本文介绍了一种通过多参数流式细胞术检测人AML原代原始细胞上多个潜在LSC标志物（CD34、CD38、CD45RA、CD90）同时表达的实验方案。此外，我们展示了如何定量三种祖细胞群体及一种具有不同程度成熟特征的潜在LSC群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中验证了这些细胞群体的存在。该对潜在LSC进行检测与定量的方法可用于化疗反应的临床随访（即，微小残留病），因为残留的LSC可能导致AML复发。

引言

急性髓系白血病（AML）是导致白血病相关死亡的最常见原因。最初，AML 是一种造血干细胞（HSC）的克隆性疾病，其特征是分化受阻、原始细胞继而积聚，以及功能性造血成分的生成减少。近年来，主要通过采用下一代测序（NGS）策略，证实了原始细胞群体存在克隆异质性，并揭示了肿瘤细胞存在亚克隆演化的现象1。

异质性体现在白血病干细胞（LSC）的存在上。人们推测，这一动态的细胞区室在白血病进展和治疗过程中会不断演化，以应对各种施加的选择压力。因此，LSC被认为对当前的化疗方案具有耐药性，并介导疾病的复发，具有重要的临床意义2。已有多种标志物被用于表征LSC，例如CD1233、CLL-14、CD975和TIM-36。原始细胞中的CD34+CD38-细胞区室被认为富含LSC7，但也包含正常的造血干细胞（HSC）。将CD90和CD45RA的表达情况应用于CD34+CD38-（P6）区室（图1），可进一步区分出多个阶段的正常与恶性造血前体细胞8。具体而言，在大多数急性髓系白血病（AML）病例中，可识别出正常的CD34+CD38-CD90+CD45RA-造血干细胞（HSC）、多能前体细胞（MPP），如CD34+CD38-CD90dimCD45RA-细胞，以及CD34+CD38-CD90-CD45RA+淋巴系倾向的多能前体细胞（LMPP）8,9。在CD34+细胞区室中，CD38的平均荧光强度（MFI）尤其需要关注。因为CD38的表达强度可进一步定义三个新的细胞区室：CD38阴性（P6）、CD38弱表达（P7）和CD38强表达（P8）（图1）。CD38的MFI可通过造血母细胞和/或浆细胞作为内部阳性对照来确定，因为这些细胞强烈表达CD38。

免疫缺陷型 NOD/SCID/IL2Rγcnull（NSG）小鼠模型被广泛用于移植正常及恶性人类造血细胞10,11。连续异种移植实验可用于验证白血病干细胞（LSC）或造血干细胞（HSC）的功能。这些研究已通过大规模测序方法进行了深入分析。然而，与原发性急性髓系白血病（AML）相比，关于移植至NSG小鼠体内的AML原始细胞群体中LSC和HSC免疫表型的研究仍较为有限（图2）。

LSC 的数量本身较少，因此鉴定和定量 LSC 具有挑战性，而本文所述方法可作为在诊断时及临床随访期间评估化疗反应的流式细胞术检测手段（因为残留的 LSC 可能导致 AML 复发）。LSC 的存在可能提示微小残留病（MRD）呈阳性。迄今为止， AML 中的 MRD 监测主要依赖于分子学方法（即，RT-PCR、NGS）10,12。然而，在本方案中，我们通过多参数流式细胞术同时检测人类 AML 原始母细胞上多种 HSC/LSC 标志物（CD34、CD38、CD45RA、CD90）的蛋白表达2,8,9。该抗体组合可应用于任何标准的流式细胞术实验室，且当无法通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）进行 MRD 检测时，这种流式 MRD 检测尤其有价值，例如在初诊 AML 样本中无法检测到白血病特异性分子标志物的情况下 。此外，本方案可作为更敏感的分子 MRD 技术的补充，因其旨在检测和定量异常的造血祖细胞，反映了一种功能性细胞特征（图 3）。

我们展示了如何利用大多数临床实验室常见的抗体，通过流式细胞术对三种造血祖细胞群体以及具有不同成熟程度的潜在白血病干细胞（LSC）区室进行定量分析。此外，我们还证实了这些细胞区室存在于相应患者来源的异种移植模型（PDX）中，并在治疗随访期间持续存在。

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方案

我们遵循欧洲关于将动物用于科学目的的标准。本研究已获得当地伦理委员会的批准（#3097-2015120414583482v3）。

1. 样品制备

  1. 从骨髓中采集（2 mL） 从头合成 含抗凝剂乙二胺四乙酸的试管中的急性髓系白血病样本 （EDTA）浓度为每毫升骨髓1.8 mg。
  2. 进行Ficoll分离，即密度梯度分离，以从红细胞和粒细胞中分离单个核细胞，步骤如下：将骨髓用3体积的 磷酸盐缓冲液（PBS：NaCl 137 mM，KCl 2.7 mM，Na2HPO4 10 mM，KH2PO4 1.8 mM)。将1体积的Ficoll与1体积稀释后的骨髓液小心叠加。在300 × g下离心30分钟，不启用刹车。将单个核细胞的白色中间层（buffy coat）转移至新的无菌离心管中。
  3. 用10 mL PBS洗涤细胞两次，300 × g离心5分钟，以去除污染的血清成分。

2. 红细胞（RBC）裂解

  1. 向细胞沉淀中加入 2 mL 裂解缓冲液（0.8% 氯化铵），轻轻涡旋混匀，室温孵育 5 分钟。在 300 × g 离心 5 分钟。
    注意：如有必要，可重复此步骤。
  2. 按照前述方法（1.3 节）用 PBS 洗涤细胞。

3. 患者来源的异种移植模型。

  1. 通过Ficoll分离后，采用免疫磁珠阴性筛选法（CD3去除T淋巴细胞，CD20去除B淋巴细胞）从骨髓中获取原始细胞。具体操作请遵循试剂盒说明书。
  2. 注射 5 x 106 将AML原始细胞通过尾静脉注射至未经预处理的NSG小鼠体内。使用固定装置以辅助尾静脉注射。小鼠应始终在常规条件下饲养，尤其需维持无特定病原体（SPF）条件，使用独立通风笼具，并在层流罩内进行所有操作。每两周采用下颌下采血法，用毛细管采集60 µL血液。将毛细管插入5 mL圆底试管中。用无菌纱布轻压止血。用洁净注射器推出血液。 
  3. 加入1 ml裂解缓冲液，孵育5分钟。然后以300 × g离心5分钟。用PBS洗涤，并以300 × g离心5分钟。弃去上清液，加入含10%牛血清白蛋白（BSA）的100 µL PBS，再加入3 µL抗人CD45-FITC和1 µL抗小鼠CD45-APC，4°C避光孵育30分钟。
  4. 用含10% BSA的PBS（2 mL）洗涤细胞沉淀两次，300 × g离心5分钟。
  5. 分装至最多 1 × 106 每100 µL PBS中加入细胞至流式细胞术管中。
  6. 每两周通过CD45表达的嵌合体分析来监测移植情况（人 与 小鼠）通过流式细胞术图2A 和 B).
  7. 在处死时（外周血原始细胞计数超过70%或出现严重临床病征），按照先前所述方法，用PBS冲洗胫骨和股骨，从破碎的脾脏及骨髓中收集单个核原始细胞13按照国际指南，通过颈椎脱位法处死小鼠。   
  8. 如果细胞沉淀中含有红细胞，使用裂解缓冲液裂解红细胞（步骤 2.1）。
  9. 用含10% BSA的PBS（2 mL）重悬细胞沉淀，洗涤两次，每次在300 × g离心5分钟。
  10. 收集细胞并分装，每份不超过 1 x 106 每100 µL PBS中加入细胞至流式细胞术管中。

4. 染色

  1. 加入偶联抗体（参见步骤4.2），涡旋混匀。将细胞在室温避光条件下孵育15分钟。
  2. 对于人原代细胞或PDX样本，使用以下抗体组合：10 µL anti-CD36-FITC、5 µL anti-CD19-ECD、5 µL anti-CD33-PC5.5、5 µL anti-CD90-APC、5 µL anti-CD34-AA700、5 µL anti-CD45RA-APC-H7、5 µL anti-CD38-Pacific Blue、5 µL anti-CD123-PC7 和 2.5 µL anti-CD45-KO。
  3. 用2 mL PBS通过300 × g离心5分钟，洗涤细胞以去除未结合的抗体。
  4. 将细胞重悬于450 µL PBS中，用于最终的流式细胞术分析。

5. 流式细胞术分析的设门策略

  1. 使用配备红色、蓝色和紫色激光的流式细胞仪进行数据采集（至少 500,000 个细胞）。每天验证细胞仪设置：1）光学校准，2）流体系统，3）光学灵敏度，以及 4）使用荧光微球进行标准化。
  2. 按照顺序设门策略定义 CD38 表达（图 1）。
    1. 使用正常骨髓样本中的细胞定义造血母细胞或浆细胞，作为 CD38 表达的阳性对照  。
      注意：此设门尤为关键，因为后续推定的白血病干细胞（LSC）群体依赖于该门的定义。
    2. 根据 CD45dim/SSC（侧向散射）低信号群体标准定义生理性前体细胞（正常原始细胞）（图 1A）。在此原始细胞群体中，定义显示 CD38++CD19+ 表型的造血母细胞（图 1B）；最后，利用 CD36 和 CD33 表达区分原粒细胞、原单核细胞和原红细胞（图 1C）。如（图 1E）所示，检测造血母细胞上的 CD34 表达。分析在原始细胞中定义的 P6-P10 多个前体细胞亚群（图 1D）。根据预设的 CD38 设门，将原始细胞中的 CD34 阳性群体分为 P6、P7 和 P8 三个前体亚群。确保 P8 群体包含与造血母细胞具有相同 CD38 荧光强度的原始细胞，P6 群体包含基于 CD38 荧光减一（FMO）对照确定的 CD38 阴性细胞，而 P7 群体在 CD38 表达水平上介于上述两个极端之间（图 1D）。
  3. 从 CD34+38-（P6）设门的细胞中，通过 CD90 和 CD45RA 表达将造血干细胞（HSC）与推定的白血病干细胞（LSC）区分开（图 1F）。
    注意：HSC 表型为 CD34+CD38-CD90+CD45RA-，多能前体细胞（MPP）定义为 CD34+CD38-CD90-CD45RA-。推定的 LSC 表型为 CD34+CD38-CD90dimCD45RA+，而更早期的下游群体为淋巴系倾向前体细胞（LMPP），定义为 CD34+CD38-CD90-CD45RA+。

6. 通过RT-PCR进行MRD监测

  1. 按照先前所述方法，通过RT-PCR监测MRD水平14。

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结果

在此，我们介绍一种用于确定正常和恶性人类骨髓样本中前体细胞群体的方法。我们从一个成功的PDX模型中采集了骨髓和脾脏组织，并按照上述方法进行多参数流式细胞术分析。我们比较了诊断时患者样本与其相应PDX模型中多个原始细胞亚群，特别是CD34+CD38-前体细胞区室，该区室被认为富含潜在的白血病干细胞（LSC）。我们发现，PDX模型中的CD34+CD38-原始细胞比例较诊断时患者样本更高（3.48% vs. 0.53%） 图 2C, D）。有趣的是，我们发现PDX中具有CD34+CD38-CD90-CD45RA+表型的疑似LSC比例高于原始患者样本（2.76% vs. 0.48%） 图 2E, F)，提示在此小鼠模型的造血组织中可能存在恶性前体细胞的富集。PDX模型与患者样本中正常前体细胞组分的频率无显著差异。
此外，我们根据CD34、CD38、CD90和CD45A的表达情况（如本方案所述），分析了两个不同患者样本在诊断时及治疗随访期间的原始细胞祖细...

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讨论

准确且可重复地通过流式细胞术评估膜或胞质标志物，需要每天验证仪器设置，以确保光学对准以及流体系统的正常运行，  光学敏感性，以及使用校准微球进行标准化。

利用CD90和CD45RA通过多参数流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）中的原始细胞群体是一种相对简单且可靠的方法。该分析中的关键步骤是准确评估原始细胞上CD38的表达水平，以正确圈定CD34+CD38-细胞群。CD38的表达强度通过正常骨髓中的造血祖细胞和/或浆细胞（CD38+）来确定。其他标记物的强度则通过同型对照来确定。

通过加入CD45RA和CD90可用于区分造血干细胞（HSC）与假定的白血病干细胞（LSC）。后者而非HSC可能是疾病复发的原因，因此该方案对于利用流式细胞术检测面板进行微小残留病监测具有重要意义。在治疗过程中对急性髓系白血病（AML）进行监测，对于改善风险分层和指导AML治疗至关重要。然而，并非所有患者都有合适的分子标志物。因此，通过流式细胞术进行MRD监测可能适用于所有AML病例。尽管该方法可能并不全面，因其主要针对具有CD34+CD38...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了法国Laurette Fugain协会、法国抗癌联盟（北部中心）、法国基金会（白血病委员会）、SIRIC Oncolille以及法国国家癌症研究所的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
潘科尔PAN-BiotechP04-60500
红细胞裂解缓冲液 (10x)OzymeBLE420301红细胞裂解液 A：8.29 g NH4Cl + 0.037 g Na2EDTA 溶于 100 mL 无菌 H2O；红细胞裂解液 B：1 g KHCO3 溶于 100 mL 无菌 H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  小鼠JACKSON LABORATORY货号：005557
PBSGibco by life technologies14190-144
AutoMACS 运行缓冲液 – MACS 分离缓冲液MACS Buffer Miltenybiotec130-091-221
抗 CD36-FITC（克隆 FA6-152，Iotest）Beckman CoulterPN IM0766U
抗 CD33-PC5.5（克隆 D3HL60.251，Iotest）Beckman CoulterB36289
抗 CD90-APC（克隆 5E10）Biolegend328114
抗 CD19-ECD（克隆 J3-119，Iotest）Beckman CoulterA07770
抗 CD34-AA700（克隆 581，Iotest）Beckman CoulterB92417
抗 CD45RA-APC-H7（克隆 HI100） Beckton Dickinson560674
抗 CD38-Pacific Blue（克隆 LSI98-4-3，Iotest）Beckman CoulterB92396
抗 CD45-KO（克隆 J.33，Iotest）Beckman CoulterB36294
抗 CD3-PEBeckman CoulterIM1451
抗 CD20-PEBeckman CoulterA07747
抗 CD123-PC7Beckman CoulterB13647
Flow-SetBeckman CoulterA63492
Flow-CheckBeckman CoulterA63493
NaviosBeckman CoulterDS-14644A
LSR Fortessa X20BD Biosciences
CST BDBD Biosciences655051
FacsFlow BD Biosciences336911
抗 hCD45-FITCBiolegendBLE304006
抗 mCD45-APCBiolegendBLE103112
EasySep 人 PE 选择试剂盒Stem Cell Technologies18000
EasySep  磁力架 Stem Cell Technologies18551

参考文献

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  2. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587(2014).
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