本研究介绍了一种同步记录自由活动大鼠脑部局部场电位、心电图、肌电图和呼吸信号的方法。该技术可降低实验成本并简化数据分析，有助于深入理解大脑与外周器官之间的相互作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
监测大脑及外周组织的生理动态，对于研究动物在面临情绪挑战和生活环境变化时，大脑如何调控身体功能和内脏器官节律等问题至关重要。通常的实验中，来自不同器官（如大脑和心脏）的信号需通过独立的记录系统采集，这需要多个记录设备以及不同的数据文件处理流程。本研究介绍了一种新方法，可在自由活动的大鼠中同时监测多种电生理生物信号，包括多个脑区的数十个局部场电位、反映心脏节律的心电图、反映觉醒/睡眠相关肌肉收缩的肌电图以及呼吸信号。该方法的记录构型基于传统的用于皮层局部场电位记录的微驱动电极阵列，可容纳数十根电极，这些电极采集的信号被整合至安装在动物头部的一个统一电路板上。本文对该记录系统进行了改进，使来自外周器官的信号也能传输至该电路接口板。在一次手术中，电极首先被分别植入适当的体表部位和目标脑区，随后将所有电极的裸露端分别焊接到动物头部上方电路板的独立通道上，从而将全部信号整合至同一电路板。将该电路板连接至记录设备后，所有信号即可被单一设备采集，从而降低实验成本并简化数据处理流程，因为所有数据均可保存于同一个数据文件中。该技术将有助于深入理解中枢与外周器官之间关联的神经生理学基础。
引言
中枢神经系统会根据各种环境变化调节机体状态，这种调节通常表现为心率、呼吸频率和肌肉收缩的变化。然而，目前很少有研究探讨这些外周生理因素如何与大脑皮层活动相关联。为解决这一问题，有必要采用一种能够同时记录中枢和外周组织生物电信号的大规模记录方法。在大脑皮层中，局部场电位（LFP）信号是通过插入皮层组织内的电极进行细胞外记录获得的1，2，3。为了在大鼠和小鼠等小型哺乳动物的大脑皮层区域同步记录多个LFP信号，已有许多研究开发了多种定制的电极组件，称为微驱动装置（micro-drives）。传统的微驱动装置由固定在电极中段（通常为四极电极）的金属螺钉、容纳螺钉和电极的主体结构，以及用于连接电极裸露端的金属孔的电接口板（EIB）组成（图1、图2和图3）。该电极组件使操作者能够在数天至数周内调节多个电极插入脑内的深度，从而在动物接受各种行为任务时进行长期慢性神经活动记录。在外周器官中，心跳信号通过植入心脏区域或其周围的成对电极记录为心电图（ECG）4，5，6，骨骼肌信号则通过插入肌肉组织的电极记录为肌电图（EMG）7，8，9。嗅球电信号与呼吸（BR）节律之间的关系已通过单细胞记录方法进行了研究10，11。在传统记录系统中，这些来自不同组织的信号通常由独立的记录设备采集，这意味着需要额外的实验系统来精确同步多个设备，以实现脑-体信号的同步记录。本系统正是为克服这一问题而开发的。在本系统中，所有来自外周器官的电信号，包括ECG、EMG以及反映呼吸节律的嗅球电信号，均被整合到一个单一的微驱动阵列1，2，3中，此处称之为整合式微驱动阵列（integrative micro-drive array）。该系统仅需一个多功能通道记录设备，且适用于任何传统的微驱动阵列。该技术的优势在于无需使用特殊设备或触发信号来匹配多个设备的记录时间，同时由于所有信号以相似的数据类型记录，数据处理更加便捷。该技术将有助于深入理解中枢与外周器官之间关联的神经生理学基础。本文描述了该技术的相关操作步骤，并展示了从大鼠获得的代表性数据集。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物实验的操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）关于动物护理与使用的指南进行。
1. 整合式微驱动阵列的制备
- 按照其他文献所述方法制备用于皮层局部场电位（LFP）记录的微型驱动阵列1,2,3。在电极接口板（EIB）上至少预留6个金属孔，用作连接生物柔性导线（bioflex wires）的ECG/EMG/BR通道，具体连接方式见1.2节。
- 将一根生物柔性导线剪成6段，每段长5.0 cm。将每段导线两端的聚四氟乙烯（PTFE）涂层剥离约5.0 mm。将每段导线的一端通过金针连接至EIB上预留的金属孔（ECG/EMG/BR通道）之一。
- 将一根漆包线剪成两段，每段长5.0 cm。将每根导线的一端焊接到EIB上的接地/参考（g/r）通道上（图3，另见先前的研究12,13）。
- 制备ECG电极时，将一根生物柔性导线剪成两段，每段长16 cm。将每段导线一端的PTFE涂层剥离约5.0 mm（短端），另一端剥离约15 mm（长端）。
- 将导线的长端弯成直径为2.0 mm的环形，并通过焊接固定环形结构。
- 制备EMG电极时，将一根生物柔性导线剪成两段，每段长8 cm。将每段导线两端的PTFE涂层各剥离约5.0 mm。
- 制备BR电极时，将一根生物柔性导线剪成两段，每段长6.0 cm。将每段导线两端的漆包层各剥离约5.0 mm。将每段导线的一端焊接到不锈钢螺钉的头部（杆径：1.0 mm，杆长：4.0 mm）。
- 制备接地/参考（gr）电极时，将一根漆包线剪成两段，每段长6.0 cm。将每段导线两端的漆包层各剥离约5.0 mm。将每段导线的一端焊接到不锈钢螺钉的头部（杆径：1.4 mm，杆长：3.0 mm）。
- 对所有电极和不锈钢螺钉进行气体灭菌 ，并存放于洁净环境中。
2. 心电图/肌电图电极的植入
注意：所有外科手术步骤均须使用无菌技术操作，佩戴灭菌手套并使用经高压灭菌的器械。凡涉及切口操作的步骤，术前须用70%乙醇对皮肤进行消毒，并用手术巾覆盖切口部位。
- 将麻醉（1.0-3.0% 异氟烷气体）的大鼠仰卧固定在平坦的加热垫上。给予布托啡诺作为镇痛剂。在大鼠眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。 使用聚维酮碘清洁皮肤表面。
- 在胸部内侧区域做一条约 2.0 cm 的切口。分离胸部肌肉以暴露肋间肌。将心电图电极的环状部分缝合固定于肋间肌上。
- 将动物的腹部固定在加热垫上。在背部颈部区域做一条约 1.0 cm 的切口。
- 通过胸部切口将心电图电极皮下插入。将电极末端沿皮下缓慢滑动至背部颈部区域，并从颈部切口拉出。缝合胸部切口。
- 通过颈部切口将每根肌电图电极的一端皮下插入约 2.0 cm 深度。通过缝合将肌电图电极固定于颈部肌肉上。
3. 植入整合式微型驱动阵列和BR电极
- 将大鼠固定于立体定位仪上。沿头部正中线从两眼之间至颈部区域做一条长约3.0 cm的切口，暴露颅骨。
- 在嗅球上方、前囟前11.0 mm、旁开1 mm处，使用高速钻头制作两个直径为0.7–1.0 mm的圆形颅骨开窗。将两个BR电极植入颅骨，直至螺钉尖端接触脑表面。
- 在前额叶皮层上方、人字缝前2.7 mm、双侧距人字缝2.7 mm处，制作两个直径为0.7–1.0 mm的环形颅骨开孔。将两个接地/参考电极植入颅骨，直至螺钉杆的尖端接触脑表面。
- 在大颅骨开孔周围的区域钻出6至8个直径为1.0 mm的孔。将锚定螺钉（杆径：1.4 mm，杆长：3.0 mm）植入颅骨。
- 在颅骨上制作一个直径约2.0 mm的大型环形开颅孔，位置位于前囟后方3.8 mm、旁侧2.5 mm处的海马上方。将整合式微型驱动阵列放置到位，使驱动阵列的套管尖端位于大型开颅孔上方
- 用约 100 µL 的两种溶液填充套管尖端与脑表面之间的间隙， 即0.5%（质量分数）海藻酸钠和10%（质量分数）氯化钙。
注意：将两种溶液在颅骨上混合后，约5分钟内会形成透明凝胶。 - 用厚度为0.5 cm的牙科水泥覆盖套管、BR电极、g/r电极和固定螺钉。注意操作 非 在此步骤中，使用水泥覆盖BR和g/r电极的裸露端部。
- 将心电图（ECG）、肌电图（EMG）、脑电图（BR）以及g/r电极的裸露端分别焊接到之前连接至EIB的各导线端部（参见步骤1.2和1.3）。
- 用牙科水泥覆盖整合式微型驱动阵列的底部以及所有电极导线。确保所有电极导线均被覆盖 完全覆盖 以便大鼠在植入后无法将其抓挠掉。
- 在动物恢复至能够维持胸卧位的足够意识水平后，将其放回透明的Plexiglas饲养笼中，单独饲养，并自由提供水和食物。 手术后，用抗生素（庆大霉素）处理动物。
- 手术后，对动物进行监测 每日观察。检查小鼠行走是否正常，以及当实验人员触碰微驱动阵列时是否发出吱吱声。
4. 在体实验 记录
注意：所有信号均经过放大，采样频率为 2 kHz，并进行带通滤波（0.1 - 500 Hz），但单个神经元活动信号除外（采样频率为 30 kHz，带通滤波范围为 500 - 6 kHz）。
- 将整合式微型驱动器阵列的EIB连接到记录设备的前置放大器头级。
- 术后数周内通过旋转螺钉推进四极电极。当四极电极接近目标脑区后，需在数天内逐步将其稳定置入目标区域，以获得稳定的记录信号。
- 在动物于记录舱内自由活动时，实时监测其电信号。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
该方法可同时采集来自多个器官的生物电信号，这些信号分别代表脑部的神经元活动、心率、呼吸节律以及骨骼肌收缩 (图1)。图4 展示了一只在矩形箱体（25 × 40 cm2）内自由觅食的自由活动大鼠的代表性记录数据。示例数据集包含了在运动与静止状态之间典型的行为转换。通过小波分析对海马局部场电位（LFP）信号进行处理，计算得到功率谱。从嗅球表面区域记录到的呼吸（BR）信号用于粗略估计呼吸频率的相对变化，例如在探索性嗅闻行为期间发生的频率变化。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了理解大脑如何调节外周活动水平，以及外周活动如何反过来影响大脑，有必要采用大规模记录方法，以同时采集来自身体多个区域的电生理生物信号。本研究描述了一种手术方法及一种记录系统，用于监测脑部局部场电位、心率、肌肉收缩幅度和呼吸频率，该系统是在用于脑组织胞外记录的原有记录系统基础上改进而成。该系统将来自大脑和外周器官的电信号整合至一个集成式微驱动阵列的单一记录接口板（EIB）上进行采集。集成式微驱动阵列的制备应至少在手术前数小时开始，因其制备过程耗时较长。此处所述驱动阵列包含用于记录脑局部场电位的四极电极，但其他类型的金属电极（如铂电极或钨电极）只要其末端能够正确焊接至记录接口板（EIB），也可被安装使用。按照本实验方案中的手术步骤操作时，经验丰富的实验人员通常可在2至3小时内完成全部操作。
本方案中的一个关键步骤是将电极放置在组织上的位置，尤其是心电图（ECG）和肌电图（EMG）电极的放置。可能需要进行多次训练才能获得稳定的记录。迄今为止，所有记录在手术后至少一个月内均保持稳定。实验人员应注意，如果记录数据的信噪比降低，这一问题通常是由于接地/参考电极固定不牢，或电极引线在EIB之间...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由 Kaken-hi（17H05939；17H05551）、中谷基金会和铃木纪念基金会资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FEP 连接线，绞合不锈钢芯 | Cooner Wire Company，美国加利福尼亚州查茨沃思 | AS 633 | Bioflex 导线 |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc.，美国蒙大拿州博兹曼 | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems，美国犹他州盐湖城 | 数字前置放大器 | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems，美国犹他州盐湖城 | 数据采集系统 | |
| UEW 聚氨酯漆包线 | Oyaide.com，日本东京 | UEW 0.14mm 20m | 漆包线 |
| SD-102 | Narishige，日本东京 | SD-102 | 高速钻机 |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co., Ltd，日本东京 | C2012 | 高速钻机电源 |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc.，日本京都 | 213620136 | 牙科水泥 |
| 小型动物麻醉机 | Biomachinery，日本千叶 | TK-7 | 麻醉机 |
| 盐酸丁丙诺啡 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | B7536-1ML | 镇痛剂 |
| 异氟烷 | DS Pharma Animal Health，日本大阪 | Isoflu 250mL | |
| 凡士林，白色 | 和光纯药工业株式会社，日本大阪 | 224-00165 | 兽用软膏 |
| 海藻酸钠 | Nacalai Tesque，日本京都 | 31131-85 | |
| 二水合氯化钙 | 和光纯药工业株式会社，日本大阪 | 031-00435 | |
| 不锈钢螺钉 M1.0×4.0 | MonotaRO，日本兵库 | 42617504 | 用于 BR 电极的不锈钢螺钉 |
| 不锈钢螺钉 M1.4×3.0 | MonotaRO，日本兵库 | 42617687 | 用于 g/r 电极和锚定螺钉的不锈钢螺钉 |
参考文献
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication. JoVE. (26), e1094(2009).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (26), e1098(2009).
- Jog, M. S., et al. Tetrode technology: advances in implantable hardware, neuroimaging, and data analysis techniques. J Neurosci Methods. 117 (2), 141-152 (2002).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nat Protoc. 11 (1), 61-86 (2016).
- Rossi, S., et al. The effect of aging on the specialized conducting system: a telemetry ECG study in rats over a 6 month period. PLoS One. 9 (11), 112697(2014).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. JoVE. (57), (2011).
- Zeredo, J. L., Kumei, Y., Shibazaki, T., Yoshida, N., Toda, K. Measuring biting behavior induced by acute stress in the rat. Behav Res Methods. 41 (3), 761-764 (2009).
- Young, G. A., Khazan, N. Electromyographic power spectral changes associated with the sleep-awake cycle and with diazepam treatment in the rat. Pharmacol Biochem Be. 19 (4), 715-718 (1983).
- Oishi, Y., et al. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. JoVE. (107), e53678(2016).
- Chaput, M. A. Respiratory-phase-related coding of olfactory information in the olfactory bulb of awake freely-breathing rabbits. Physiol Behav. 36 (2), 319-324 (1986).
- Ravel, N., Pager, J. Respiratory patterning of the rat olfactory bulb unit activity: Nasal versus tracheal breathing. Neurosci Lett. 115 (2-3), 213-218 (1990).
- Okada, S., Igata, H., Sakaguchi, T., Sasaki, T., Ikegaya, Y. A new device for the simultaneous recording of cerebral, cardiac, and muscular electrical activity in freely moving rodents. J Pharmacol Sci. 132 (1), 105-108 (2016).
- Sasaki, T., Nishimura, Y., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Central and Peripheral Bioelectrical Signals in a Freely Moving Rodent. Biol Pharm Bull. 40 (5), 711-715 (2017).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
