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方法文章

相互作用组测序：通过噬菌体展示与下一代测序进行结构域组文库构建、验证与筛选的实验方案

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DOI：

10.3791/56981

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2018年10月3日

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1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

本文内容

摘要

本文所述方案可用于构建、表征和筛选（针对特定目标）来源于任意DNA样本的“"结构域组"文库。该流程通过整合多种技术实现：噬菌体展示技术、折叠报告系统、高通量测序以及用于数据分析的网络工具。

摘要

折叠报告蛋白是一类具有易于识别表型（如抗生素抗性）的蛋白质，当其与折叠不良的蛋白质或随机开放阅读框融合时，其折叠和功能会受到损害。我们开发了一种策略，通过在基因组规模上利用TEM-1 β-内酰胺酶（赋予氨苄青霉素抗性的酶），可以从任何无内含子基因组的编码DNA区域筛选出正确折叠的蛋白质结构域集合。通过该方法获得的蛋白质片段，即所谓的"结构域组"，具有良好的表达性和可溶性，适用于结构与功能研究。

通过克隆并展示 "结构域组学" 在噬菌体展示系统中直接进行，我们已证明可以选择具有所需结合特性的特定蛋白质结构域（例如， 与其他蛋白质或抗体结合，从而为基因注释或抗原鉴定提供关键的实验信息.

通过使用新型的下一代测序技术（NGS），可以鉴定出选定多克隆群体中富集程度最高的克隆。基于这些原因，我们引入了对文库本身及其筛选结果的深度测序分析，以提供有关多样性、丰度以及每个被筛选片段精确图谱的完整信息。本文所展示的实验方案涵盖了文库构建、表征和验证的关键步骤。

引言

本文介绍一种高通量方法，用于从任意基因/基因组来源构建并筛选具有正确折叠和可溶性的蛋白质结构域文库。该方法结合了三种不同的技术：噬菌体展示技术、折叠报告系统以及下一代测序（NGS）技术，并配合特定的网络工具进行数据分析。该方法可广泛应用于基于蛋白质的各类研究，包括新蛋白质/蛋白质结构域的鉴定与注释、已知蛋白质结构与功能特性的表征，以及蛋白质相互作用网络的界定。

基于蛋白质的研究中仍存在许多未解的问题，而开发最优蛋白质生产方法对于多个研究领域而言至关重要。例如，尽管已有数千种原核和真核生物的基因组可供使用1，但对于绝大多数生物体而言，仍缺乏与之对应的、对编码蛋白质和肽段进行直接注释的相对蛋白质组图谱。构建完整蛋白质组目录正成为一个极具挑战性的目标，需要在时间和资源方面投入巨大努力。实验注释的金标准仍然是克隆一个基因组中的所有开放阅读框（ORF），构建所谓的"ORFeome"。通常，基因功能是基于与已知功能基因的同源性来推断的，但由于参考数据库中存在大量错误注释，该方法的准确性较差2,3,4,5。此外，即使对于已被鉴定和注释的蛋白质，仍需进一步研究以明确其丰度、在不同条件下的表达模式，以及结构与功能特性、相互作用网络等方面的特征。

此外，由于蛋白质由不同的结构域组成，每个结构域具有特定的特征，并对蛋白质功能产生不同程度的贡献，因此对这些结构域的研究和精确定义有助于在单个基因和全基因组水平上获得更全面的认识。所有这些必要的信息使得基于蛋白质的研究成为一个广泛而富有挑战性的领域。

从这一角度来看，无偏倚且高通量的蛋白质生产方法可能发挥重要作用。然而，这类方法的成功不仅需要大量投入，更依赖于可溶性/稳定性蛋白构建体的生产能力。这是一个主要的限制因素，据估计，仅有约30%的蛋白质能够成功表达并达到实验所需的足够产量6,7,8。为克服这一限制，一种策略是利用随机断裂的DNA生成不同的多肽片段，这些片段共同构成单个基因的重叠片段表达谱。在随机生成的DNA片段中，仅有极小部分为功能性开放阅读框（ORF），而绝大多数片段是非功能性的（因其序列中含有终止密码子），或编码无生物学意义的非天然多肽（即ORF处于不同于原始基因的读码框中）。

为解决上述所有问题，我们课题组开发了一种高通量蛋白质表达与相互作用分析平台，可在基因组尺度上应用9,10,11,12。该平台整合了以下技术：1）一种从任意生物体DNA编码区中筛选正确折叠蛋白质结构域集合的方法；2）利用噬菌体展示技术筛选相互作用配体；3）采用下一代测序技术（NGS）全面表征目标相互作用组并鉴定感兴趣的克隆；以及4）一种网络分析工具，使不具备任何生物信息学或编程技能的用户也能以简便、友好的方式完成相互作用组测序（Interactome-Seq）分析。

该平台的使用相较于其他研究策略具有重要优势；尤其在于该方法完全无偏倚性、通量高，并且具有模块化特点，可适用于从单个基因到整个基因组范围的研究。该流程的第一步是构建一个来源于待研究DNA的随机片段化文库，随后通过高通量测序（NGS）对其进行深度表征。该文库利用一种经过改造的载体构建，目标基因或DNA片段被克隆至编码信号序列的区域之间，该信号序列可引导蛋白质分泌至周质空间（即，一个Sec信号肽）以及TEM1 β-内酰胺酶基因。只有当克隆的片段与这两个元件保持正确的阅读框，且表达的融合蛋白能够正确折叠时，该融合蛋白才能赋予细胞氨苄青霉素抗性，并使其在氨苄青霉素压力下存活10,13,14所有经抗生素筛选后获得的克隆，即所谓的 "筛选后的克隆"，是开放阅读框（ORFs），其中绝大多数（超过80%）来源于真实基因9此外，该策略的优势在于研究发现，所有经过ORF筛选的克隆均编码正确折叠/可溶性的蛋白质/结构域。15由于文库中位于同一区域/结构域的多个克隆具有不同的起始和终止位点，这使得能够实现无偏倚的单步分析 鉴定可能产生可溶性产物的最小片段。

通过使用高通量测序（NGS）对文库进行表征，该技术得到了进一步改进。此平台与特定的网络数据分析工具相结合，能够在无需进一步大量分析或实验投入的情况下，提供关于所选开放阅读框（ORF）在目标参考DNA上的精确核苷酸序列及其位置的重要无偏信息。

结构域组文库可转入筛选体系中，作为通用工具用于开展功能研究。我们整合并称之为“互作组测序”（Interactome-Seq）的高通量蛋白质表达与相互作用分析平台，利用噬菌体展示技术，将筛选后的开放阅读框（ORF）转入噬菌粒载体，构建噬菌体-ORF文库。一旦重新克隆至噬菌体展示体系中，蛋白质结构域即可展示于M13噬菌体颗粒表面；通过该方式，可直接对编码具有特定酶活性或结合特性的结构域的基因片段进行筛选，从而实现互作组网络的图谱绘制。该方法最初由Zacchi et al.16 报道，随后在多个其他研究中被应用13,17,18。

与其他用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的技术（包括酵母双杂交系统和质谱分析19,20）相比，噬菌体展示技术的一个主要优势在于，多轮筛选过程中可对结合伴侣进行扩增。这提高了筛选的灵敏度，从而能够鉴定文库中丰度较低的结合蛋白结构域。使用经过ORF筛选的文库可进一步提高筛选效率，因为该文库不含非功能性克隆。最后，该技术可用于以蛋白质和非蛋白质作为诱饵进行筛选21,22,23,24,25。

使用域组噬菌体文库进行噬菌体筛选时，可采用来自不同病理状态下患者血清中的抗体， 例如 自身免疫性疾病13，癌症或感染性疾病作为诱饵。该方法用于获得所谓的 "抗体特征谱" 该疾病的研究能够大规模地同时鉴定和表征患者抗体特异性识别的抗原/表位。与其他方法相比，噬菌体展示技术能够鉴定出线性及构象性抗原表位。特异性免疫特征的发现可能对理解发病机制、设计新型疫苗、发现新的治疗靶点以及开发新型且特异性的诊断与预后工具具有重要意义。此外，当研究集中于传染病时，一个主要优势在于免疫原性蛋白的发现不依赖于病原体的培养。

我们的方法证实，折叠报告系统可用于基因组规模，以筛选“"结构域组"：即从任何生物体的DNA和/或cDNA编码区中获得的正确折叠、高效表达且可溶的蛋白质结构域集合。一旦分离出这些蛋白质片段，便可用于多种用途，为基因注释、结构研究、抗体表位作图、抗原鉴定等提供关键的实验信息。etc。高通量测序（NGS）所提供的数据完整性使得对高度复杂样本（如噬菌体展示文库）的分析成为可能，并有望避免传统方法中对单个噬菌体拯救克隆进行繁琐的挑取与检测过程。

同时，得益于筛选文库的特性以及高通量测序（NGS）分析的极高灵敏度和强大能力，可以在初始筛选中直接鉴定出每种相互作用所涉及的蛋白质结构域，而无需为每种结合蛋白单独构建额外的文库。NGS能够全面定义任何基因/基因组来源的完整结构域组（domainome），而配套的数据分析网络工具则可实现对相互作用组蛋白质结构域在定性和定量两个层面的高度特异性表征。

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方案

1. ORF文库的构建（图1）

  1. 插入DNA的制备
    1. 从合成或基因组DNA制备片段
      1. 使用标准方法提取/纯化 DNA26.
      2. 使用超声处理将DNA片段化。若使用常规超声仪，一般建议以100%输出功率进行30秒脉冲处理。
        注意：应通过不同功率和超声时间的预实验来确定DNA制备的最佳条件。每次测试后，通过琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的大小。
      3. 将超声处理后的DNA与100 bp DNA Marker一同上样至1.5%琼脂糖凝胶中，在5 V/cm条件下进行短时电泳运行15分钟，切下含有DNA片段弥散条带的凝胶区域。
      4. 使用基于离心柱的凝胶回收试剂盒纯化插入片段DNA，并用紫外分光光度计测定其浓度。
        注意：此步骤后应至少获得 500 ng 纯化的插入片段，用于与 1 µg 经消化的载体进行连接，具体操作如步骤 1.3 所述。通过检测 A260 nm/A280 nm 和 A260 nm/A230nm 比率，因为样品质量低会影响连接效率。
      5. 根据制造商说明书，用1 μL快速平端化试剂盒酶混合物处理最多5 μg的插入片段。在70 °C加热10分钟以灭活酶。样品可于-20 °C保存，直至使用。
    2. cDNA片段制备
      1. 使用标准方法提取 RNA（例如， 使用TRizol或类似试剂。
      2. 在进行逆转录之前，通过加热对mRNA进行片段化。最终DNA片段的长度由mRNA煮沸时间和随机引物浓度控制。例如，在95 °C下加热样品6分钟。
      3. 使用随机引物和任意可用的试剂盒，按照制造商提供的说明书制备cDNA。
      4. 通过与生物素标记的聚-dA在37 °C杂交3小时，耗尽cDNA的poly-dT尾，并按Carninci所述方法在链霉亲和素磁珠上分离 等13
      5. 回收未结合的物质，并使用基于柱的DNA纯化试剂盒按照制造商说明书进行纯化。使用紫外分光光度计测定浓度。参见步骤1.1.1.4中的注释。
  2. 过滤载体的制备
    1. 消化5 µg纯化的克隆载体pFILTER312 使用10 U EcoRV限制性内切酶，按照制造商说明书操作。
    2. 将2 µL（200 ng）酶切后的载体、100 ng未酶切载体以及1 kb DNA分子量标记物加载至1%琼脂糖凝胶上，以检测酶切是否完全。随后对限制性内切酶进行热失活处理。
    3. 加入1/10体积的10×磷酸酶缓冲液和1 µL（5 U）磷酸酶，37 °C孵育15分钟。65 °C加热5分钟以终止反应。
    4. 通过琼脂糖凝胶回收消化后的质粒，并使用紫外分光光度计测定其浓度。样品可于 -20 °C 保存至使用。
  3. 连接与转化
    1. 连接反应操作如下：每1 µg消化后的质粒中加入400 ng磷酸化的插入片段（质粒:插入片段摩尔比为1:5），10 µL T4 DNA连接酶10×缓冲液，2 µL高浓度T4 DNA连接酶，最终反应体系为100 µL。16 °C孵育过夜。65 °C加热10 min以终止反应。
    2. 加入1/10体积的乙酸钠溶液（3 M，pH 5.2）和2.5体积的100%乙醇，沉淀连接产物。混匀后于-80 °C冷冻20分钟。
    3. 在 4 °C 条件下以最大速度离心 20 分钟。弃去上清液。
    4. 向沉淀中加入500 µL预冷的70%乙醇，在4 °C下以最大速度离心20 min。弃去上清液。
    5. 将沉淀物风干。用10 µL水重悬沉淀的DNA。
    6. 进行细菌细胞电穿孔。
      注意：应使用高效细胞（高于 5x109 每微克 DNA 的转化子数）是必需的。我们建议使用 大肠杆菌 DH5αF' (F'/endA1 hsd17 (rK− mK+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15))，可自行制备或从多家生产商购买。
      1. 将适量的微量离心管和0.1 cm电穿孔比色皿置于冰上。向25 µL细胞中加入1 µL纯化的连接产物溶液（溶于去离子水中），轻轻弹击管壁数次。
      2. 将DNA-细胞混合物转移至预冷的比色皿中，轻敲台面2次，擦去比色皿外壁的水分，放入电穿孔模块中，按下脉冲键。
      3. 使用标准电穿孔仪进行电穿孔，参数设置为25 µF、200 Ω和1.8 kV，时间常数必须为4–5 ms。
    7. 立即加入1 mL不含任何抗生素的液体2xYT培养基，转移至10 mL离心管中，在37 °C、220 rpm振荡条件下培养1 h。
    8. 将转化后的 DH5αF' 涂布于添加 34 µg/mL 氯霉素（pFILTER 抗性）和 25 µg/mL 氨苄青霉素（ORF 筛选标记）的 15 cm 2xYT 琼脂平板上，于 30 °C 过夜培养。
    9. 在添加氯霉素+氨苄青霉素以及仅添加氯霉素的10 cm 2xYT琼脂平板上进行文库的涂布稀释，以完成文库滴定。于30 °C过夜培养。
  4. pFILTER-ORF文库验证
    1. 从氯霉素平板和氯霉素/氨苄青霉素平板中分别挑取15-20个菌落，以评估插入片段大小的分布情况。用枪头挑取单菌落，分别在不含抗生素的100 µL 2xYT培养基中稀释。取0.5 µL该溶液作为DNA模板进行PCR反应，使用任意标准的Taq DNA聚合酶，并按照制造商提供的说明书操作。
    2. 使用55 °C退火温度和72 °C延伸40秒的条件进行25个循环的扩增。引物序列见于 材料表.
    3. 将PCR产物与100 bp DNA Marker一同上样至1.5%琼脂糖凝胶中电泳。
  5. pFILTER-ORF文库集合
    1. 从150 mm培养皿中收集细菌，加入3 mL新鲜的2xYT培养基，用无菌细胞刮刀刮取菌体，充分混匀，加入20%无菌甘油，分装后于-80 °C保存。
    2. 使用基于离心柱的质粒提取试剂盒，按照制造商说明书从文库的一份等分试样（添加甘油前）中纯化质粒DNA。
    3. 使用紫外分光光度计测定浓度。样品可在-20 °C保存，直至用于噬菌粒文库构建和/或通过高通量测序进行表征。

2. 将筛选后的ORF亚克隆至噬菌粒载体中（图2）

  1. ORF过滤DNA片段的制备
    1. 使用 pFILTER-ORF 文库载体中纯化的 5 µg 载体，加入 10 U BssHII 进行限制性酶切，按照制造商说明书条件孵育。随后灭活酶，并加入 10 U NheI 进行消化。
    2. 将消化后的DNA与100 bp DNA Ladder一同上样至1.5%琼脂糖凝胶中，在5 V/cm条件下进行短时间电泳约15分钟，或直至足以区分切除片段形成的弥散条带，并切下含有这些片段的凝胶区域。
    3. 使用柱式凝胶回收试剂盒纯化插入片段DNA，并用紫外分光光度计测定其浓度。
  2. 噬菌粒DNA的制备
    1. 设置限制性内切酶消化反应，对5 µg纯化的pDAN5进行消化27 至于插入片段。
    2. 使用0.75%琼脂糖凝胶电泳分离经消化的质粒DNA，并利用基于离心柱的试剂盒从凝胶中回收纯化。
    3. 使用紫外分光光度计测定浓度。样品可于 -20 °C 保存至使用。
  3. 文库连接、转化与收集
    1. 按照pFILTER载体所述方法进行连接和转化。
    2. 将转化后的 DH5αF' 菌株接种于添加 100 µg/mL 氨苄青霉素的 150 mm 2xYT 琼脂平板上，30 °C 过夜培养。
    3. 培养皿 在添加了100 µg/mL氨苄青霉素的100 mm 2xYT琼脂平板上进行文库稀释，以确定文库大小。
    4. 通过PCR对随机挑选的克隆进行文库验证，具体步骤如1.4所述。
    5. 从150 mm培养皿中收集含噬粒-ORF文库的细菌，充分混匀，加入20%无菌甘油，分装后于-80 °C保存。
    6. 使用基于柱的质粒提取试剂盒，按照制造商说明书从文库的一个等分试样中纯化质粒DNA。
    7. 在紫外分光光度计中测定浓度。样品可在-20 °C保存，直至用于下一代测序（NGS）表征。

3. 噬菌体文库制备与筛选流程

  1. 噬菌体生产
    1. 将一份噬菌粒文库的储存液稀释至10 mL添加100 µg/mL氨苄青霉素的2xYT液体培养基中，使OD600nm = 0.05。
    2. 将稀释后的文库置于无菌锥形瓶中培养，锥形瓶体积应为原始体积的5–10倍，在37 °C、220 rpm振荡条件下培养至OD600nm = 0.5。
    3. 以感染复数（MOI）20:1的比例用辅助噬菌体（e.g. M13K07）感染细菌，37 °C孵育45分钟，期间每隔10分钟轻轻振荡一次。
    4. 在室温下以4000 × g离心10分钟，弃上清液，将菌体沉淀重悬于40 mL添加100 µg/mL氨苄青霉素和50 µg/mL卡那霉素的2xYT液体培养基中，于28 °C、220 rpm振荡条件下过夜培养。
    5. 次日，在4 °C下以4000 × g离心20分钟，收集含有噬菌体的上清液。
  2. 噬菌体的PEG沉淀
    1. 向澄清的噬菌体上清液中加入1/5体积的0.22 µm滤膜过滤的PEG/NaCl溶液（20% w/v PEG 6000，2.5 M NaCl），冰上孵育30–60分钟。
      注：数分钟后溶液呈现烟雾状，表明噬菌体成功沉淀。随着孵育时间延长，溶液浑浊度会逐渐增加。
    2. 在4 °C下以4000 × g离心15分钟，可见形成白色微小沉淀。
    3. 将沉淀重悬于1 mL无菌PBS中，转移至1.5 mL离心管，在4 °C下以最大转速离心10分钟，以去除污染细菌，可见形成棕色沉淀。
    4. 将含有噬菌体的上清液转移至新管中，置于冰上，用于后续滴定和噬菌体筛选。
  3. 噬菌体滴定
    1. 对噬菌体溶液进行系列稀释。取10 µL噬菌体溶液加入990 µL PBS中，得到10-2稀释液；再将此稀释液进一步稀释得到10-4稀释液，并由此获得10-6稀释液。
    2. 将DH5αF'细菌在37 °C振荡培养于2xYT液体培养基中，直至OD600nm = 0.5。取1 mL菌液转入1.5 mL离心管中，立即加入1 µL的10-4噬菌体稀释液，37 °C静置孵育45分钟。对10-6稀释液重复相同操作。
    3. 将感染后的菌液涂布于100 mm 2xYT琼脂平板，30 °C过夜培养。
    4. 取100 µL未感染的DH5αF'菌液涂布于添加100 µg/mL氨苄青霉素的2xYT琼脂平板，以检测制备过程中是否存在污染。
    5. 次日计数菌落数量并计算噬菌体滴度，以每毫升噬菌体数量（phages/mL）表示。预期滴度为1012–13 phages/mL。
  4. 噬菌体筛选
    1. 使用纯化抗体作为诱饵进行噬菌体筛选
      1. 通过将200 µL噬菌体样品与等体积的PBS-4%脱脂奶粉混合，室温缓慢旋转孵育1小时，实现噬菌体的饱和阻断，以减少非特异性结合。取30 µL蛋白G包被的磁珠转移至1.5 mL离心管中。
      2. 洗涤两次：每次加入500 µL PBS，室温缓慢旋转孵育2分钟，用磁铁将磁珠吸附至管壁一侧，弃去上清液。
      3. 将已阻断的噬菌体与洗涤后的磁珠在室温下缓慢旋转孵育30分钟。
      4. 用磁场将磁珠吸附至管壁一侧，收集上清液（含待用于筛选的噬菌体）。
      5. 在进行上一步的同时准备磁珠：将纯化抗体偶联至磁珠。按上述方法洗涤30 µL蛋白G包被的磁珠，将10 µg纯化抗体溶于500 µL PBS中，加入洗涤后的磁珠，室温缓慢旋转孵育45分钟，随后用PBS洗涤两次。
        注：需制备两种不同的磁珠：一种偶联目标抗体，另一种偶联对照抗体（e.g., 来自健康供体的纯化抗体）。在结果分析阶段，使用对照抗体筛选出的抗原序列将被扣除。或者，也可使用偶联对照抗体的磁珠对噬菌体进行预清除（参照未偶联磁珠的孵育方案操作）。
      6. 噬菌体筛选：用磁铁将磁珠吸附至管壁一侧，弃去最后一次洗涤液，加入噬菌体，室温缓慢旋转孵育90分钟。用500 µL PBS-0.1% Tween-20洗涤5次，再用PBS洗涤5次。
      7. 洗脱结合的噬菌体（即筛选产物）：将磁珠与1 mL OD600 = 0.5的DH5αF'菌液混合，37 °C孵育45分钟，期间每隔10分钟轻轻振荡一次。将洗脱产物涂布于添加100 µg/mL氨苄青霉素的150 mm 2xYT琼脂平板。
      8. 取100 µL未稀释及不同稀释度（10-1至10-5）的洗脱产物进行滴定。次日，向150 mm平板中加入3 mL新鲜2xYT培养基，用无菌刮刀收集菌体，充分混匀，加入20%无菌甘油，分装后于-80 °C保存。
      9. 取一份保存菌液重新培养，进行第二轮筛选。重复上述淘选流程，但洗涤条件不同：本步骤中用PBS-1% Tween-20洗涤10次（将溶液加入管中后立即倒出）。随后加入500 µL PBS，室温旋转孵育10分钟，再用PBS洗涤10次。后续洗脱步骤与第一轮相同。
      10. 使用柱式质粒提取试剂盒，按照制造商说明书从一份筛选产物中提取质粒DNA。提取的质粒于-20 °C保存，待用于深度测序。
    2. 使用重组蛋白作为诱饵进行噬菌体筛选
      1. 将200 µL噬菌体样品与等体积的PBS-4%脱脂奶粉混合，室温缓慢旋转孵育1小时，以实现噬菌体的饱和阻断。
      2. 加入100 µL链霉亲和素磁珠，室温孵育1小时，以去除可结合链霉亲和素的噬菌体。用磁铁将磁珠吸附至管壁一侧，弃去上清液。取上一步的上清液，加入生物素标记的蛋白（终浓度100–550 nM），在旋转仪上室温孵育30分钟至1小时。
      3. 准备磁珠：在进行上一步的同时，用PBS洗涤100 µL链霉亲和素磁珠，重悬于含2%脱脂奶粉的PBS中，室温旋转孵育30分钟至1小时。
      4. 噬菌体筛选：用磁铁将磁珠吸附至管壁一侧，弃去PBS-2%脱脂奶粉溶液，将磁珠重悬于噬菌体-蛋白混合液中，室温缓慢旋转孵育90分钟。
      5. 用磁铁将磁珠吸附至管壁一侧，弃去上清液，用500 µL PBS-0.1% Tween-20小心洗涤5次。洗脱步骤参照前述方法进行。

4. 噬菌体文库深度测序平台（图3）

  1. 从 pFILTER-ORF 文库、pDAN5-ORF 文库或筛选噬菌体文库中回收 DNA 插入片段
    1. 解冻一份文库样品，使用分光光度计进行定量，并使用特异性引物通过扩增回收 DNA 插入片段。
      注意：用于回收插入片段的引物在其 5' 端连接了接头序列，从而允许对获得的扩增子池进行后续索引，并使用测序仪直接对回收的 DNA 插入片段进行测序。引物序列见材料表。接头序列以粗体标出，特异性引物以斜体标出。
    2. 取 2.5 µL 的（pFILTER/噬粒/筛选噬菌体）文库作为 PCR 反应的 DNA 模板。
    3. 使用以下程序：95 °C 预变性 3 min；25 个循环（95 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 30 s）；72 °C 最终延伸 5 min；4 °C 保存。
      注意：此时建议取 1 µL PCR 产物在 Bioanalyzer 或 TapeStation 上进行检测，以确认扩增子大小是否处于正确范围内。
  2. PCR 产物纯化
    1. 将磁珠（例如，AMPure）恢复至室温。将 PCR 管中的全部 PCR 产物转移至 1.5 mL 离心管中。涡旋振荡磁珠 30 s，确保磁珠均匀分散。向每管含 PCR 产物的样品中加入 20 µL 磁珠，轻轻吹打混匀。室温孵育 5 min，避免振荡。
    2. 将离心管置于磁力架上 2 min，或直至上清澄清。在保持磁珠吸附于管壁的状态下，小心移除并弃去上清液。
    3. 用新鲜配制的 80% 乙醇洗涤磁珠，操作如下：向每个样品孔中加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇；将板置于磁力架上孵育 3 s；小心移除并弃去上清液。
    4. 进行第二次乙醇洗涤，仍保持样品在磁力架上；第二次洗涤结束后，小心彻底去除所有乙醇，并让磁珠在空气中干燥 10 min。
    5. 将离心管从磁力架上取下，向每管中加入 17.5 µL 10 mM Tris（pH 8.5），轻轻吹打 10 次，确保磁珠完全重悬。室温孵育 2 min。
    6. 将离心管放回磁力架上 2 min，或直至上清澄清，小心转移 15 µL 含纯化 PCR 产物的上清至新的 1.5 mL 离心管中。若不立即进行索引 PCR，可将纯化的 PCR 产物在 -15 °C 至 -25 °C 保存最多一周。
  3. 索引 PCR
    注意：完成 PCR 纯化后，进行索引 PCR。使用 Nextera XT Index 试剂盒，以便可在多重 Illumina 测序运行中对所得的双索引文库进行测序。
    1. 将全部 15 μL 纯化产物转移至新的 PCR 管中，配制如下反应体系：15 µL 纯化扩增产物、5 µL Index Primer 1、5 µL Index Primer 2、25 µL 2x PCR 混合液；终体积为 50 µL。
    2. 在 PCR 仪上运行以下程序：95 °C 预变性 3 min；8 个循环（95 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 30 s）；72 °C 最终延伸 5 min；4 °C 保存。
  4. PCR 纯化 2
    1. 按照第 4.2 节所述的 PCR 纯化方案操作，但作如下修改：第一步中，向每 50 µL PCR 产物中加入 56 µL 磁珠。
    2. 在纯化最后一步，用 27.5 µL 10 mM Tris（pH 8.5）重悬磁珠，并将 25 µL 上清转移至新管中（此即用于定量和后续测序的纯化终末文库）。
    3. 若不立即进行文库定量，可将板在 -15 °C 至 -25 °C 保存最多一周。
  5. 测序文库的定性与定量评估
    1. 纯化后，取终末文库 1:10 稀释液 1 µL 在 Bioanalyzer 上运行，通过选择终末文库电泳图谱中的目标区域来验证片段大小并进行定量。
    2. 同时，按照制造商说明书使用文库定量试剂盒通过实时荧光定量 PCR 进行文库定量。
  6. 文库测序
    1. 将生成的双索引文库与其他双索引测序文库混合。使用 Hiseq2500 或 MiSeq 仪器生成长读长数据，至少进行 250 bp 双端测序，前者可获得 250 bp PE 读长，后者可获得 300 bp PE 读长。

5. 使用相互作用组测序网络工具进行生物信息学数据分析

  1. 使用Interactome-seq数据分析流程分析来自pFILTER/噬菌粒/筛选噬菌体文库测序的读长。该网络工具可免费在以下地址获取：http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

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结果

过滤方法的示意图见图1。可使用各种无内含子的DNA。在图1A中展示了过滤方法的第一部分：在琼脂糖凝胶或生物分析仪上样后，目标DNA的良好片段化表现为一条长度分布在150-750 bp预期大小范围内的弥散条带。图中提供了一个获得的DNA片段化结果的代表性虚拟凝胶图像。然后回收琼脂糖凝胶中的片段，进行末端修复和磷酸化修饰，再克隆至先前已钝化的pFILTER载体中，以构建随机DNA片段文库。为获得高质量文库并对所研究DNA实现充分的总覆盖度，必须在克隆实验的每一步骤中均采用最佳条件。

在图1B中展示了筛选策略：文库在仅含氯霉素（pFILTER抗性）或同时含有氯霉素和氨苄青霉素的条件下培养，以筛选含有开放阅读框（ORF）的克隆。只有那些含有对应于ORF的DNA片段的克隆才能产生有功能...

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讨论

构建高质量且高度多样化的ORF筛选文库是整个流程中的首个关键步骤，因为它将影响后续流程中的所有步骤。

本方法的一个重要优势在于，任何来源的（无内含子的）DNA（cDNA、基因组DNA、PCR扩增产物或合成DNA）均适用于文库构建。首先需要考虑的一个参数是，克隆到pFILTER载体中的DNA片段长度应能够代表基因组或转录组中所有结构域的集合，即所谓的"结构域组"。我们已证明，可以从长度分布在150至750 bp之间的DNA片段成功克隆、筛选并最终鉴定出蛋白质结构域33,34，这与文献报道一致：大多数蛋白质结构域的长度约为100个氨基酸（范围为50至200个氨基酸）15。

DNA 起始材料必须被片段化至选定的大小范围，随后克隆至筛选（pFILTER）12 载体中。在这些步骤中，应尽可能提高本方案所包含的所...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了意大利教育与大学部资助（项目编号：2010P3S8BR_002，授予 CP）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sonopuls 超声波均质仪BandelinHD2070或同类产品
GeneRuler 100 bp Plus DNA MarkerThermo ScientificSM0321或同类产品
GeneRuler 1 kb DNA MarkerThermo Fisher ScientificSM0311或同类产品
分子生物学级琼脂糖BioRad161-3102或同类产品
Green Gel PlusFisher Molecular BiologyFS-GEL01或同类产品
6x DNA 上样缓冲液Thermo Fisher ScientificR0611或同类产品
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704或同类产品
Quick Blunting 末端修复试剂盒New England BiolabsE1201S
NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计Thermo Fisher ScientificND-2000
高容量 cDNA 反转录试剂盒Thermo Fisher Scientific4368813
链霉亲和素磁珠New England BiolabsS1420S或同类产品
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104或同类产品
EcoRVNew England BiolabsR0195L
南极磷酸酶New England BiolabsM0289S
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202T
3M 醋酸钠溶液（pH 5.2）通用实验室供应商
分子生物学级乙醇Sigma-AldrichE7023或同类产品
DH5αF' 感受态细菌细胞Thermo Fisher Scientific
0.2 ml 离心管通用实验室供应商
1.5 ml 离心管通用实验室供应商
0.1 cm 电穿孔比色皿Biosigma4905020
Electroporator 2510 电穿孔仪Eppendorf
2x YT 培养基Sigma-AldrichY1003
氨苄青霉素钠盐Sigma-AldrichA9518
氯霉素Sigma-AldrichC0378
DreamTaq DNA 聚合酶Thermo Fisher ScientificEP0702
脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合溶液New England BiolabsN0447S
96 孔温控 PCR 仪（带加热盖）通用实验室供应商
150 mm 培养皿通用实验室供应商
100 mm 培养皿通用实验室供应商
甘油Sigma-AldrichG5516
BssHIINew England BiolabsR0199L
NheINew England BiolabsR0131L
QIAprep Spin 质粒小提试剂盒Qiagen27104或同类产品
M13KO7 辅助噬菌体GE Healthcare Life Sciences27-1524-01 
硫酸卡那霉素（来源于卡那链霉菌）Sigma-AldrichK1377
聚乙二醇（PEG）Sigma-AldrichP5413
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS3014
PBS通用实验室供应商
Dynabeads Protein G 免疫沉淀磁珠Thermo Fisher Scientific10003D或同类产品
MagnaRack 磁力分离架Thermo Fisher ScientificCS15000或同类产品
吐温 20Sigma-AldrichP1379
脱脂奶粉EuroCloneEMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa Biosystems, Fisher Scientific7958935001
AMPure XP 磁珠Agencourt, Beckman CoulterA63881
Nextera XT 双端索引引物IlluminaFC-131-2001 或 FC-131-2002 或 FC-131-2003 或 FC-131-2004
MiSeq 或 Hiseq2500Illumina
分光光度计Nanodrop
Agilent Bioanalyzer 或 TapeStationAgilent
PCR 正向引物通用实验室供应商5’ TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
PCR 反向引物通用实验室供应商5’ TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
NGS 正向引物通用实验室供应商5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
NGS 反向引物通用实验室供应商5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGAGACAGGGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;

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