本文所述方案可用于构建、表征和筛选（针对特定目标）来源于任意DNA样本的“"结构域组"文库。该流程通过整合多种技术实现：噬菌体展示技术、折叠报告系统、高通量测序以及用于数据分析的网络工具。
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本文内容
摘要
摘要
折叠报告蛋白是一类具有易于识别表型（如抗生素抗性）的蛋白质，当其与折叠不良的蛋白质或随机开放阅读框融合时，其折叠和功能会受到损害。我们开发了一种策略，通过在基因组规模上利用TEM-1 β-内酰胺酶（赋予氨苄青霉素抗性的酶），可以从任何无内含子基因组的编码DNA区域筛选出正确折叠的蛋白质结构域集合。通过该方法获得的蛋白质片段，即所谓的"结构域组"，具有良好的表达性和可溶性，适用于结构与功能研究。
通过克隆并展示 "结构域组学" 在噬菌体展示系统中直接进行，我们已证明可以选择具有所需结合特性的特定蛋白质结构域（例如， 与其他蛋白质或抗体结合，从而为基因注释或抗原鉴定提供关键的实验信息.
通过使用新型的下一代测序技术（NGS），可以鉴定出选定多克隆群体中富集程度最高的克隆。基于这些原因，我们引入了对文库本身及其筛选结果的深度测序分析，以提供有关多样性、丰度以及每个被筛选片段精确图谱的完整信息。本文所展示的实验方案涵盖了文库构建、表征和验证的关键步骤。
引言
本文介绍一种高通量方法，用于从任意基因/基因组来源构建并筛选具有正确折叠和可溶性的蛋白质结构域文库。该方法结合了三种不同的技术：噬菌体展示技术、折叠报告系统以及下一代测序（NGS）技术，并配合特定的网络工具进行数据分析。该方法可广泛应用于基于蛋白质的各类研究，包括新蛋白质/蛋白质结构域的鉴定与注释、已知蛋白质结构与功能特性的表征，以及蛋白质相互作用网络的界定。
基于蛋白质的研究中仍存在许多未解的问题，而开发最优蛋白质生产方法对于多个研究领域而言至关重要。例如，尽管已有数千种原核和真核生物的基因组可供使用1，但对于绝大多数生物体而言，仍缺乏与之对应的、对编码蛋白质和肽段进行直接注释的相对蛋白质组图谱。构建完整蛋白质组目录正成为一个极具挑战性的目标，需要在时间和资源方面投入巨大努力。实验注释的金标准仍然是克隆一个基因组中的所有开放阅读框（ORF），构建所谓的"ORFeome"。通常，基因功能是基于与已知功能基因的同源性来推断的，但由于参考数据库中存在大量错误注释，该方法的准确性较差2,3,4,5。此外，即使对于已被鉴定和注释的蛋白质，仍需进一步研究以明确其丰度、在....
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方案
1. ORF文库的构建（图1）
- 插入DNA的制备
- 从合成或基因组DNA制备片段
- 使用标准方法提取/纯化 DNA26.
- 使用超声处理将DNA片段化。若使用常规超声仪，一般建议以100%输出功率进行30秒脉冲处理。
注意：应通过不同功率和超声时间的预实验来确定DNA制备的最佳条件。每次测试后，通过琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的大小。 - 将超声处理后的DNA与100 bp DNA Marker一同上样至1.5%琼脂糖凝胶中，在5 V/cm条件下进行短时电泳运行15分钟，切下含有DNA片段弥散条带的凝胶区域。
- 使用基于离心柱的凝胶回收试剂盒纯化插入片段DNA，并用紫外分光光度计测定其浓度。
注意：此步骤后应至少获得 500 ng 纯化的插入片段，用于与 1 µg 经消化的载体进行连接，具体操作如步骤 1.3 所述。通过检测 A260 nm/A280 nm 和 A260 nm/A230nm 比率，因为样品质量低会影响连接效率。 - 根据制造商说明书，用1 μL快速平端化试剂盒酶混合物....
- 从合成或基因组DNA制备片段
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结果
过滤方法的示意图见图1。可使用各种无内含子的DNA。在图1A中展示了过滤方法的第一部分：在琼脂糖凝胶或生物分析仪上样后，目标DNA的良好片段化表现为一条长度分布在150-750 bp预期大小范围内的弥散条带。图中提供了一个获得的DNA片段化结果的代表性虚拟凝胶图像。然后回收琼脂糖凝胶中的片段，进行末端修复和磷酸化修饰，再克隆至先前已钝化的pFILTER载体中，以构建随机DNA片段文库。为获得高质量文库并对所研究DNA实现充分的总覆盖度，必须在克隆实验的每一步骤中均采用最佳条件。
在图1B中展示了筛选策略：文库在仅含氯霉素（pFILTER抗性）或同时含有氯霉素和氨苄青霉素的条件下培养，以筛选含有开放阅读框（ORF）的克隆。只有那些含有对应于ORF的DNA片段的克隆才能产生有功能.......
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讨论
构建高质量且高度多样化的ORF筛选文库是整个流程中的首个关键步骤，因为它将影响后续流程中的所有步骤。
本方法的一个重要优势在于，任何来源的（无内含子的）DNA（cDNA、基因组DNA、PCR扩增产物或合成DNA）均适用于文库构建。首先需要考虑的一个参数是，克隆到pFILTER载体中的DNA片段长度应能够代表基因组或转录组中所有结构域的集合，即所谓的"结构域组"。我们已证明，可以从长度分布在150至750 bp之间的DNA片段成功克隆、筛选并最终鉴定出蛋白质结构域33,34，这与文献报道一致：大多数蛋白质结构域的长度约为100个氨基酸（范围为50至200个氨基酸）15。
DNA 起始材料必须被片段化至选定的大小范围，随后克隆至筛选（pFILTER）12 载体中。在这些步骤中，应尽可能提高本方案所包含的所.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了意大利教育与大学部资助（项目编号：2010P3S8BR_002，授予 CP）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sonopuls 超声波均质仪 | Bandelin | HD2070 | 或同类产品 |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Marker | Thermo Scientific | SM0321 | 或同类产品 |
| GeneRuler 1 kb DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | 或同类产品 |
| 分子生物学级琼脂糖 | BioRad | 161-3102 | 或同类产品 |
| Green Gel Plus | Fisher Molecular Biology | FS-GEL01 | 或同类产品 |
| 6x DNA 上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 或同类产品 |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | 或同类产品 |
| Quick Blunting 末端修复试剂盒 | New England Biolabs | E1201S | |
| NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
| 链霉亲和素磁珠 | New England Biolabs | S1420S | 或同类产品 |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | 或同类产品 |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195L | |
| 南极磷酸酶 | New England Biolabs | M0289S | |
| T4 DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0202T | |
| 3M 醋酸钠溶液（pH 5.2） | 通用实验室供应商 | ||
| 分子生物学级乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 或同类产品 |
| DH5αF' 感受态细菌细胞 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 0.2 ml 离心管 | 通用实验室供应商 | ||
| 1.5 ml 离心管 | 通用实验室供应商 | ||
| 0.1 cm 电穿孔比色皿 | Biosigma | 4905020 | |
| Electroporator 2510 电穿孔仪 | Eppendorf | ||
| 2x YT 培养基 | Sigma-Aldrich | Y1003 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| DreamTaq DNA 聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | EP0702 | |
| 脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合溶液 | New England Biolabs | N0447S | |
| 96 孔温控 PCR 仪（带加热盖） | 通用实验室供应商 | ||
| 150 mm 培养皿 | 通用实验室供应商 | ||
| 100 mm 培养皿 | 通用实验室供应商 | ||
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| BssHII | New England Biolabs | R0199L | |
| NheI | New England Biolabs | R0131L | |
| QIAprep Spin 质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27104 | 或同类产品 |
| M13KO7 辅助噬菌体 | GE Healthcare Life Sciences | 27-1524-01 | |
| 硫酸卡那霉素（来源于卡那链霉菌） | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| 聚乙二醇（PEG） | Sigma-Aldrich | P5413 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| PBS | 通用实验室供应商 | ||
| Dynabeads Protein G 免疫沉淀磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 或同类产品 |
| MagnaRack 磁力分离架 | Thermo Fisher Scientific | CS15000 | 或同类产品 |
| 吐温 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 脱脂奶粉 | EuroClone | EMR180500 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems, Fisher Scientific | 7958935001 | |
| AMPure XP 磁珠 | Agencourt, Beckman Coulter | A63881 | |
| Nextera XT 双端索引引物 | Illumina | FC-131-2001 或 FC-131-2002 或 FC-131-2003 或 FC-131-2004 | |
| MiSeq 或 Hiseq2500 | Illumina | ||
| 分光光度计 | Nanodrop | ||
| Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation | Agilent | ||
| PCR 正向引物 | 通用实验室供应商 | 5’ TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’ | |
| PCR 反向引物 | 通用实验室供应商 | 5’ TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’ | |
| NGS 正向引物 | 通用实验室供应商 | 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3’; | |
| NGS 反向引物 | 通用实验室供应商 | 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3’; |
参考文献
- Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
- Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8
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重印与许可
