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方法文章

展平哺乳动物皮层中的皮层模块可视化

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DOI：

10.3791/56992

⸱

2018年1月22日

 ,  ,  , 
1Bernstein Center for Computational Neuroscience, Humboldt University of Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, 3German Center for Neurodegenerative Diseases

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种从哺乳动物大脑皮层获取展平的切向切片，并利用组织化学和免疫组织化学方法可视化皮层功能模块的详细技术方案。

摘要

哺乳动物大脑的皮层被划分为不同的亚结构或模块。皮层模块通常与皮层表面平行，可通过某些组织化学和免疫组织化学方法进行界定。在本研究中，我们重点介绍一种从哺乳动物大脑中分离皮层并将其展平以获得与皮层表面平行切片的方法。我们进一步展示了若干选定的组织化学和免疫组织化学方法，用于处理这些展平的切向切片，以可视化皮层模块。在多种哺乳动物的体感皮层中，我们进行细胞色素氧化酶组织化学染色，以揭示代表动物身体不同部位的身体图谱或皮层模块。在生成网格细胞的内侧内嗅皮层区域，我们采用免疫组织化学方法突出显示由基因决定、在多个物种的皮层表面呈网格状排列的神经元模块。总体而言，我们提供了一个框架，用于分离和制备分层展平的皮层切片，并利用组织化学和免疫组织化学方法在多种哺乳动物大脑中可视化皮层模块。

引言

在系统发育过程中，大脑结构的一些最显著变化可体现在大脑皮层上。尽管不同物种间存在显著差异，动物的皮层仍遵循一种共同的模式，并可通过两种方式大致划分：分层和分区。1皮层各层与大脑表面平行，在爬行动物皮层中层数为3层2 哺乳动物大脑皮层的6层结构1另一方面，皮层区域是大脑皮层中具有不同功能的特定区域，通常与特定的功能相对应。 例如，体感皮层参与触觉感知，而视觉皮层则参与视觉输入的处理。这些皮层区域通常可进一步划分为斑块或模块3，这些是规律重复的解剖结构，基本与脑软脑膜表面平行。皮层模块可能局限于某一特定层4，或跨越多个层5.

对脑组织进行标准切片时，通常采用垂直于脑表面的切面，例如冠状面或矢状面。尽管这些方法可用于观察皮层功能模块，但当以与脑表面平行的切向平面观察皮层模块时，可揭示出大量有趣的特征。例如，啮齿类动物脑中代表触须的感觉模块，在垂直于脑表面的切片中呈现为桶状结构，因此该区域被称为桶状皮层。然而，当以切向方向观察这些桶状结构时，它们展现出一种触须图谱，其空间排布呈现出与动物体表触须排列完全对应的拓扑结构。在某些情况下，若未采用切向切片方式，模块化的结构甚至在很长一段时间内未能被发现。内侧内嗅皮层因存在网格细胞而闻名，这类神经元在动物探索环境时以规则的六边形模式放电。尽管该脑区已被广泛研究，但直到最近，人们才发现在内侧内嗅皮层中存在呈物理性六边形排列的细胞斑块或模块6。在大鼠脑中，正是通过制备内侧内嗅皮层的切向切片，并逐层分析其细胞构筑，才得以揭示这些模块的存在及其空间排布方式。

切片完成后，皮层模块的可视化也可通过多种方式实现。传统上，研究根据细胞密度或纤维排列来界定模块1。另一种常用方法是采用细胞色素氧化酶组织化学染色，以显示活性较高的区域8。较新的方法包括分析由基因决定的细胞类型，这些细胞类型可根据其蛋白质表达谱进行区分6,8。

本研究重点介绍从哺乳动物脑中分离皮层、获取展平的切向切片，并基于细胞色素氧化酶组织化学以及细胞类型特异性蛋白的免疫组织化学来可视化皮层功能模块的方法。

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方案

所有实验操作均在当地伦理委员会（LaGeSo）的监督下，依照德国动物福利指南进行。人和蝙蝠脑部数据来源于 Naumann 等5 以下操作在一只成年雄性Wistar大鼠（品系：RJHan:WI）上进行。

1. 灌注与脑组织提取

注意：为了获得均匀固定且无血液的脑组织，强烈建议对动物进行经心灌注，因为残留血液会增加染色过程中的非特异性背景信号。然而，也可以从未灌注的样本中获取展平切片并进行染色。样本的操作难易程度取决于所用固定剂的浓度：固定不足会增加在展平和切片过程中对脑组织造成机械损伤的风险，而固定剂浓度过高则会降低组织展平的灵活性以及染色信号的质量。

  1. 使用23G针头对动物进行心脏灌注。有关更详细的指南，请参见Gage 等9
    1. 使用磷酸盐缓冲液10 （PBS；0.02 M；pH 7.4）灌注动物脑组织及全身，以清除血液。持续灌注至流出液体澄清，经血管系统灌注的PBS总量至少为150 mL。
      注意：最佳结果是在压力接近被灌注动物的生理血压范围时获得的（例如，大鼠：120-130 mmHg）。可选地，向溶液中加入肝素（10 U/mL）以防止血液凝固11.
    2. 通过心脏灌注至少 100 mL 多聚甲醛固定脑组织12 （PFA，4%；溶于0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中）13直至动物颈部变僵硬。
      注意：PFA 是一种潜在的致癌物。
      注意：进行细胞色素氧化酶等组织化学活性染色时，使用2% PFA可获得最佳效果；而对于免疫组织化学等其他染色，则推荐使用4% PFA。
  2. 从颅骨中取出脑组织。
    注意：参见 Gage 等9 详情请见。
    1. 使用大剪刀或骨剪分离头部。
    2. 使用精细剪刀，沿中线从颈部向鼻部剪开皮肤。将皮肤向两侧拉开以暴露颅骨。使用精细剪刀去除颈部和颞部的肌肉。
    3. 从枕骨大孔开始，沿顶骨向上通过顶间骨做一正中切口。
    4. 使用咬骨钳剥离顶间骨。将精细剪刀沿矢状缝滑动，从顶骨后端剪至额骨前端。
    5. 使用咬骨钳剥离顶骨和额骨。也可用镊子将骨骼移除。用解剖勺切断腹侧神经索并取出脑组织。将脑组织转移至磷酸缓冲液（0.1 M；pH 7.4）中。
  3. 通过将未灌注的大脑浸入4% PFA中固定1-3小时 4 °C （根据脑组织大小和探针类型而定：鼩鼱：约1小时，人类：约3小时）。
    注意：对于人类等大型且具有脑回的脑组织，应分离并切出目标区域，以缩短固定时间。
  4. 为在切片中获得更大的皮层区域，可在进一步后固定前将脑组织压平，然后进行步骤2。然而，若要获取较难到达区域（如内侧内嗅皮层）的切片，则需先将脑组织在4% PFA中后固定24小时，再进行步骤2。

2. 脑组织解剖与展平

  1. 使用剃须刀片（无脑回大脑）或解剖刀（有脑回大脑）将大脑半球分离。
    注意：如果脑组织未经过后固定处理，则易因操作而受损。
  2. 有助于后续切片配准和收缩估计的可选步骤：
    1. 在非目标区域，使用35G针头垂直于皮层表面穿刺皮层。沿皮层表面在预定距离处重复该步骤两次。为确定沿皮层表面的距离，使用一段预先裁剪为固定长度的细线例如，5 mm）并沿皮层表面放置，以确定穿刺点。
  3. 无脑回脑：使用解剖铲去除皮层下结构。关键步骤：在整个操作过程中，始终用磷酸盐缓冲液（0.1 M；pH 7.4）保持脑组织湿润。
    1. 用镊子夹住小脑，轻轻插入解剖刀片以在胼胝体中打开一个解剖平面。解剖刀片的圆头应朝向远离皮层的方向。
    2. 将刮匙进一步滑入，轻柔牵拉直至刮匙位于丘脑与大脑皮层之间。通过刮擦动作分离皮层下结构。
    3. 检查半球的厚度是否均匀。
      注意：任何不平整的区域在切片过程中都可能导致跨层梯度。对于切向切片，使用解剖刀沿平行于所需切向切片区域的软脑膜表面，对脑组织进行整齐切割。
    4. 可选步骤以提高展片质量：
      1. 在纹状体、伏隔核和眶额皮层区域进行干净的切割，因为这些区域会增加外侧皮层的厚度。同时，在前额叶皮层内侧区域的基部增加一个释放切口，以使皮层的内侧部分能够展开。
    5. 将半球（皮层朝下）放置在玻片上，进行步骤 2.6。
  4. 具有脑回的脑：去除白质以展开脑回（详细方案参见：Sincich） 等14；Tootell 和 Silverman15）。重要提示：始终使用磷酸缓冲液（0.1 M；pH 7.4）保持脑组织湿润。
    1. 将感兴趣区域置于大型培养皿中湿润的滤纸上，皮层朝上。
    2. 使用两把镊子去除蛛网膜和软脑膜。
    3. 使用湿润的棉签轻轻插入每条脑沟，以分离脑回之间的粘连。
    4. 使用另一张湿润的滤纸将大脑翻转。
    5. 使用两把弯头显微解剖铲展开单个脑回。利用解剖铲的凸面轻轻分离白质，直至接近脑回的凹面末端。用湿润的棉签以旋转动作继续操作，到达脑回的凹面末端。
    6. 分离单个脑回。如有必要，若张力过高，可作少量减张切口。
    7. 将展开的脑组织在培养皿或类似容器中展平。
  5. 可选地，将较大的脑组织置于覆盖滤纸的海绵上，以确保各脑区不会干燥。
  6. 在两侧各放置一块卷好的黏土。关键点：由于黏土的厚度决定了半球体可被压平的程度，需确保黏土厚度比未压平的皮层薄10-20%。
  7. 轻轻将第二块载玻片或小型培养皿压在脑皮层上，直至半球完全展平。为获得目标区域的最佳效果，应先将载玻片置于相应区域。对于无脑回脑组织，为获得最佳结果，应先将载玻片沿外侧区域切向放置，并对该区域施加集中压力。
  8. 放入一个重物（例如，一个陶瓷表面皿）置于载玻片/培养皿上，并压平半球状样品，于3-5 h内完成 4 °C 在 PB 中。
  9. 用于后固定时，释放压力并取下玻璃片，将展平的半脑置于PFA中（自由漂浮），在摇床上4 ℃孵育24 h 4 °C.
    注意：进行组织化学活性染色时，使用1% PFA可获得最佳结果。对于未灌注脑组织的其他染色（如免疫组织化学染色），可使用2% PFA。

脑切片示意图；解剖切片方法，脑结构，组织学制备。
图1：大鼠大脑皮层半球压平及体感皮层模块可视化的流程示意图。 经心脏灌流后，分离小鼠脑组织（A）。去除皮层下结构，将皮层置于磷酸盐缓冲液中，用两片玻璃片压平（B）。压平后的半球（C）进行后固定，行切向切片，并进行细胞色素氧化酶活性染色（D）。比例尺 = 1 cm。R：吻侧，C：尾侧，L：外侧，M：内侧。该图改编自 Lauer et al.23 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 切割切向切片

注意：根据染色方案的要求，可调整切片程序和厚度。用于进一步组织化学处理（步骤 3.2）的半脑使用振动切片机在 80–150 µm 厚度下进行切片。然而，免疫组织化学处理需要更薄的切片，因此使用冷冻切片机在 10–60 µm 厚度下进行切片（步骤 3.3）。参见视频 1。

  1. 用 PB（0.1 M；pH 7.4）清洗压平的半球体 15 分钟。
  2. 用振动切片机切割半球。
    1. 将半球形组织切片切向放置于切片 holder 上。可选择在固定位置前，用玻璃片轻轻按压一次（例如，用万能胶）。
      注意：应尽量减少胶水用量，因为半球体压平后厚度较小，过多胶水可能导致切割假象。
    2. 从较厚且更稳定的一端向较薄的一端（此处为从后向前）切割半球体至所需厚度。继续进行步骤 3.4。
      注意：如果使用了较低的固定浓度，则应以低速和高振幅进行切割。
  3. 在冷冻切片机上切割半球。
    1. 用30%蔗糖溶液（溶于PB）浸泡脑组织，直至其沉底，以进行冷冻保护。
      注意：根据待冷冻保护组织的大小，其在溶液中沉降所需时间可能从数小时到数天不等。对于较大的脑组织，可考虑采用其他冷冻保护方法（参见 Rosene 等16).
    2. 在冰冻切片机上制备冰基底以固定脑组织。通过将磷酸盐缓冲液（PB）冷冻在冰冻切片机的块面来构建冰基底。关键步骤：确保冰基底表面与切片刀刃平行。为此，使用切片刀切割空的冰基底，使其表面精确地与切割面平行。
    3. 将脑组织包埋于冷冻介质中，并将其固定在切片机的切块面上，使感兴趣区域与切块面平行。脑组织的软脑膜面应朝向切片机的切块面。关键步骤：根据样本大小调整冷冻温度；较高的温度可确保切片过程中组织切片的完整性，但较大的样本需较低温度以实现均匀冷冻。
    4. 以所需的厚度对脑组织进行切向切割（较慢且均匀的切割速度可获得最佳切片质量）。
  4. 在摇床上用 PB 缓冲液洗涤切片 15 分钟。

显示海马旁回副区和内嗅皮层区域被标记的大脑解剖图。
视频 1：大鼠内嗅皮层水平切片示意图及副海马旁回与内嗅皮层模块的分布。 啮齿类动物脑的内嗅皮层位于大脑皮层的后端，并向内侧和腹侧倾斜。通过沿此角度放置刀片可获得水平切片。因此，适当的细胞类型特异性染色可揭示内嗅皮层及其相邻副海马旁回中的模块化结构。视频改编自 Ray 和 Brecht8。 请点击此处观看该视频。（右键可下载。）

4. 使用细胞色素氧化酶染色法观察皮层功能模块

注：已开发出多种不同的染色方案用于细胞色素氧化酶活性的组织化学检测， 例如，首先由 Wong-Riley 提出17 并由 Divac 后续修改 等18 本方案基于 Divac 的方法 等18，因为使用硫酸镍铵（NiAS）可在染色的皮层区域产生更高的对比度和更清晰的模块结构。

  1. 制备细胞色素氧化酶染色液（参见 Divac et al.18）。配制 10 mL 溶液，加入：10 mL HEPES 缓冲液（0.1 M，pH 7.4）、400 mg 蔗糖、12.5 mg NiAS、2 mg 细胞色素 C、6 mg 二氨基联苯胺（DAB）。
    警告：DAB 和 NiAS 具有致癌性。
    注意：在切片孵育前立即加入 DAB。
  2. 在摇床上用 HEPES 缓冲液（0.1 M，pH 7.4）清洗切片 15 分钟。
  3. 在室温下，将切片置于染色液中，在摇床上孵育。
    注意：观察染色速度。若无明显反应，可改为 37 °C 孵育。根据固定程度不同，染色可在 10 分钟后或数小时内观察到。
  4. 加入 4% 多聚甲醛（PFA）终止反应；此举可防止非特异性再染色及背景信号增强。
  5. 用 HEPES 缓冲液清洗切片三次，每次 10 分钟。
  6. 将切片贴附于载玻片上并干燥。
  7. 使用梯度酒精脱水：
    1. 将载玻片在 60% 乙醇中清洗 1 分钟；在 80% 乙醇中清洗 1 分钟；在 96% 乙醇中清洗 2 分钟；在 100% 乙醇中清洗 3 分钟；在异丙醇中清洗 5 分钟；在二甲苯中清洗 5 分钟。
  8. 立即加入快速硬化封片介质，并加盖盖玻片。关键：切勿使用水性封片剂，否则 NiAS 会被洗脱，导致染色降解。
  9. 将切片于 4 °C 保存，以长期储存。

5. 使用免疫组织化学染色法观察皮层功能模块

注意：针对不同样本和探针类型，存在多种可用于免疫组织化学的实验方案。可根据需要通过调整抗体浓度、通透剂及孵育时间等方式对方案进行优化。以下方案适用于多种抗体的检测，并能通过荧光探针实现良好的可视化效果。

  1. 用 PBS（0.1 M；pH 7.4）冲洗切片 15 分钟。
  2. 可选：使用水浴进行抗原修复，以暴露表位（基于 Jiao 等19；有关替代方法，请参见 Pileri 等20).
    1. 将水浴预热至 80 °C. 配制三水合柠檬酸钠缓冲液19 （pH 8.0）并在水浴中预热至 80 °C.
    2. 将切片转移至三钠柠檬酸缓冲液中，在以下条件下孵育30分钟： 80 °C
    3. 将切片冷却至室温
    4. 用 PBS 清洗切片 15 分钟。
  3. 用 PBS-X（含 0.5% Triton-X 的 0.1 M PBS）洗涤切片，每次 15 分钟，共洗涤两次。
  4. 用含牛血清白蛋白（BSA；2.5%）和Triton-X（0.75%）的PBS溶液孵育切片，以封闭非特异性表位，孵育时间为2 h。
  5. 将切片在一抗中孵育， 例如，钙结合蛋白D28k（1:5,000，溶于含1% BSA的PBS-X中），在摇床上孵育2–3天 4 °C.
    注意：一抗的最佳稀释度取决于所用抗体的具体种类。请参考生产商提供的信息以确定特定抗体的稀释条件。可同时使用多种抗体，但这些抗体必须针对不同物种产生。
  6. 用 PBS 清洗切片，每次 15 分钟，共清洗三次。
  7. 在二抗（1:200，PBS 中含 1% BSA）中孵育切片过夜，于 4 °C 在摇床中。
    注意：若使用了多种一抗，可在不同光谱范围使用多种二抗。
  8. 用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟，以洗去二抗。
  9. 将切片在载玻片上贴附并干燥，用于显微镜观察。
    注意：在放置盖玻片之前，各区域仍应保持湿润。
  10. 在组织切片上滴加适用于荧光染料的封片剂，并加盖盖玻片。
  11. 将切片干燥1 h。
  12. 长期储存时，使用指甲油密封盖玻片，并置于暗处保存于 4 °C.

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结果

我们获得了多种动物大脑的体感皮层压平切片，并对其进行细胞色素氧化酶组织化学处理，以可视化代表不同身体部位的躯体定位模块。这种比较方法有助于研究塑造大脑皮层的进化力量。 例如，显示啮齿类和兔形目动物触须垫触须在皮层的高度保守桶状表征21 (图2相比之下，其他身体部位（如爪子和生殖器）在相对大小上表现出差异，反映了对生态位的适应或性选择的特化。22,23.

为了理解内侧内嗅皮层的结构，我们获取了平行于软脑膜表面的切片。这主要是通过对小鼠、大鼠和埃及果蝠的内侧内嗅皮层进行切向切片实现的。由于人类的内嗅皮层尺寸显著更大且表面起伏更多，因此在对内嗅皮层进行切向切割后，我们对其进行了轻柔展平处理。随后，所有脑组织均经冷冻保存...

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讨论

已通过多种技术在大脑皮层中识别出模块化结构。早期研究通常通过可视化细胞密集区域或纤维缺失区域来确定皮层模块1。后续方法则利用树突束的存在24、来自特定区域的传入纤维25，或神经递质的富集26。本文展示了两种技术：（i）细胞色素氧化酶组织化学染色；（ii）免疫组织化学染色。

细胞色素氧化酶染色是可视化皮层功能模块最常用的方法之一，已广泛应用于初级感觉皮层27,28。该方法通过在高线粒体活性区域呈现更深的染色来显示模块17，从而作为引发显著功能反应的解剖学模块的间接指标。该技术已被用于可视化体感皮层的功能模块（图2）以及视觉皮层中的皮层模块...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

本工作得到了柏林洪堡大学、柏林计算神经科学伯恩斯坦中心、德国神经退行性疾病中心（DZNE）、德国联邦教育与研究部（BMBF，资助编号 01GQ1001A）、NeuroCure 以及德国研究基金会（DFG）戈特弗里德·威廉·莱布尼茨奖的支持。我们感谢 Shimpei Ishiyama 提供出色的平面设计，以及 Juliane Diederichs 提供出色的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞色素氧化酶染色
马心细胞色素cSigma-AldrichC2506
3,3'二氨基联苯胺四盐酸盐水合物Sigma-AldrichD5637
D(+)-蔗糖Carl Roth 4621.1
六水合硫酸镍铵Sigma-AldrichA1827
HEPESCarl Roth 9105.4
名称公司目录编号备注
抗原修复
二水合柠檬酸三钠Sigma-AldrichS1804
一水合柠檬酸Sigma-AldrichC1909
名称公司目录编号备注
磷酸盐缓冲液/磷酸盐缓冲生理盐水/前缀/PFA
磷酸二氢钾Carl Roth3904.2
氯化钠Carl Roth9265.1
二水合磷酸氢二钠Carl Roth4984.3
多聚甲醛Carl Roth0335.3
TRITON-X 100Carl Roth3051.3
名称公司目录编号备注
免疫组织化学
鸡肠纯化的钙结合蛋白D-28k，小鼠单克隆抗体SwantRRID: AB_10000347
重组大鼠钙结合蛋白D-28k来源的钙结合蛋白D-28k，兔多克隆抗体SwantRRID: AB_10000340
第五组分白蛋白，无生物素Carl Roth0163.4
名称公司目录编号备注
封片或冷冻介质
Fluoromount（免疫荧光）Sigma-AldrichF4680
Eukitt（组织化学）Sigma-Aldrich03989
组织冷冻介质Leica BiosystemsNC0696746
名称公司目录编号备注
酒精脱水
乙醇 100%Carl Roth9065.3
乙醇 96%Carl RothP075.3
2-丙醇Carl Roth6752.4
二甲苯替代物Fluka78475
名称公司目录编号备注
设备/工具
Microm HM 650VThermo Scientific
Jung RM2035Leica Biosystems
Dumont #55 镊子 - 不锈钢Fine Science Tools11255-20
Dumont #5 镊子 - 不锈钢生物学尖头Fine Science Tools11252-30
Dumont #5SF 镊子 - 不锈钢超细尖头Fine Science Tools11252-00
骨剪 - 24 cmFine Science Tools16150-24
弗里德曼咬骨钳Fine Science Tools16000-14
钝头剪刀Fine Science Tools14000-18
手术剪 - 大环Fine Science Tools14101-14
手术剪 - 尖头钝头Fine Science Tools14001-13
精细虹膜剪Fine Science Tools14094-11

参考文献

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