需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养

21.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56997

⸱

2018年3月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是眼部一种具有多种功能的上皮组织。本文介绍一种从小鼠RPE中建立原代细胞培养的实验方案。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是一种高度极化的多功能上皮组织，位于眼球的神经视网膜与脉络膜之间。它由一层单层的色素细胞构成，细胞呈六边形紧密排列，并通过紧密连接相互连接。RPE的主要功能包括光吸收、吞噬脱落的光感受器外节段、离子的空间缓冲、营养物质、离子和水的转运，以及积极参与视觉循环。由于其功能重要且多样，研究RPE细胞的生物学特性至关重要。目前已建立多种RPE细胞系；然而，传代和永生化细胞已知会迅速丧失天然RPE细胞的部分形态和生理特征。因此，原代细胞更适合用于研究RPE细胞生物学和功能的各个方面。小鼠原代RPE细胞培养对研究人员非常有用，因为小鼠模型在生物学研究中被广泛使用，但由于小鼠眼球体积小，从中获取RPE细胞也极具挑战性。本文介绍一种建立小鼠原代RPE细胞培养的实验方案，包括眼球摘除、解剖分离以及RPE细胞层的提取，以获得可用于培养的细胞。该方法可实现高效的细胞回收。来自两只小鼠 的RPE细胞在培养一周后即可在培养板中预装的12 mm聚酯膜插入物上达到汇合状态，并在培养两周后表现出某些真实RPE细胞的原有特性，如六边形形态和色素沉着。

引言

视网膜色素上皮（RPE）是位于神经视网膜与脉络膜之间的一层极性上皮细胞。RPE细胞的功能及其单层结构的完整性对视觉至关重要，因为RPE在多种生理过程中发挥重要作用，包括维持外层血-视网膜屏障、介导视网膜与脉络膜之间的水和离子转运、光吸收、抵御氧化应激、调控视黄醇代谢以及吞噬光感受器外节段1,2。由于RPE位于眼球后部，且其屏障功能可阻止经全身给药的药物从血液进入玻璃体，因此在体内（in vivo）研究RPE功能的复杂性十分困难。因此，建立RPE细胞培养体系以在灵活且可控的环境中研究RPE细胞具有重要意义3,4。

目前已建立多种成熟的RPE细胞系，为细胞的获取和保存提供了简便途径；然而，与原代细胞相比，传代细胞存在一些缺点2,3,4。首先，这些细胞常表现出细胞形态的改变。例如，由于细胞极性表型的丧失以及紧密连接的部分消失，现有细胞系均不适合用于RPE屏障特性的可靠研究4。除了极性的丧失和细胞间连接的异常外，RPE细胞系还会因成年RPE中关键黑色素生成酶的缺失而迅速失去色素沉着5。虽然色素沉着可以恢复，但迄今尚未开展对复色素化机制的全面分析，此类分析应结合透射电子显微镜、基因表达分析和化学检测以确认黑色素的存在6。另一个局限性在于，RPE细胞系具有延长的细胞寿命（有时为永生化），在特定条件下可转化为自我更新的多能干细胞，这些细胞会从基质上脱落并形成悬浮集落7,8。这一局限性使得这些细胞系无法用于移植实验3。

鉴于已建立的RPE细胞系存在诸多缺点，从新鲜组织获取的原代RPE细胞培养物可能是研究RPE更为生物学相关的模型。原代RPE细胞不仅已被用于研究RPE特异性功能，如维生素A代谢9、光感受器外节的吞噬作用10以及离子转运11，还被用于研究上皮细胞极性2、溶酶体稳态和自噬12,13等基础细胞生物学过程。

近年来，已有多篇关于建立原代RPE细胞培养的文献发表，表明该研究领域日益受到关注3,14,15。已有大量针对人RPE细胞以及非人RPE细胞（如牛和猪RPE细胞）的实验方案被报道16,17,18,19。然而，由于小鼠RPE细胞体积更小，其操作难度相对更高。尽管已有不少文献描述了从小鼠眼组织中分离RPE细胞的方法14,20,21，但仍有许多研究人员在分离过程中难以避免脉络膜细胞或神经视网膜碎片的污染。本文提供了建立原代小鼠RPE细胞培养的完整实验方案，包括从小鼠获取眼球、眼球解剖以及分离RPE细胞层以获得可用于培养的细胞。本视频方案特别适用于刚开始从事小鼠原代RPE细胞培养的研究人员，为其提供解剖技术方面的指导。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

涉及动物实验的程序已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准 匹兹堡大学

1. 准备溶液

  1. 通过在高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素、2.5 mM L-谷氨酰胺和 1× MEM 非必需氨基酸来制备生长培养基。使用前将培养基置于 37 °C 培养箱中预热。
  2. 制备 2%（wt/vol）dispase II 工作液：
    1. 通过将 30 mg dispase II 溶解于 300 µL HEPES 缓冲盐溶液（50 mM HEPES/KOH，pH 7.4，150 mM NaCl）中，配制 100 mg/mL dispase II 储存液。此体积适用于 3–4 只小鼠，可根据实验所需小鼠数量按比例放大或缩小。该储存液可在 4 °C 下保存至少 1 周。
    2. 将 300 µL 的 100 mg/mL dispase II 储存液加入 1.2 mL 无菌高糖 DMEM 中，配制成 2% dispase 工作液，并通过 0.22 µm 滤器过滤。此步骤应在超净台内无菌条件下进行。使用前将配制好的 dispase II 置于 37 °C 培养箱中预热。

2. 获取小鼠眼球

  1. 采用任何经批准的方法处死小鼠，并将其放置在吸水垫上。
  2. 佩戴手套，用拇指和食指环绕眼睛周围，轻轻推动皮肤使眼球突出。
  3. 将弯头剪刀的尖端插入皮肤与眼球之间，小心剪下眼球。为避免污染，将眼球短暂浸入70%乙醇中。
  4. 立即将眼球放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。
  5. 重复步骤2.2至2.4以摘除第二只眼球。

3. 眼球解剖

  1. 在解剖显微镜下仔细去除眼球周围的结缔组织。此步骤可在 PBS 中或干燥的培养皿中进行。
    1. 使用缝合镊子提起眼球上的结缔组织，并用Vannas剪刀将其剪除。切勿剪破巩膜，因为一旦巩膜被剪破，几乎无法获得完整的后极部眼杯。
    2. 清除结缔组织后，将处理后的眼球置于PBS中，以进行下一步洗涤。
      注意：以下所有步骤均应在超净工作台内无菌条件下操作。
  2. 用预热至37 °C的DMEM（高糖）培养基洗涤眼球两次。使用镊子小心地将眼球转移至预热至37 °C的DMEM（高糖）培养基中。吸去旧培养基，将眼球转移至新培养皿中的新鲜培养基内。
  3. 吸去DMEM（高糖）培养基，将眼球置于预热的2%（wt/vol）dispase II工作液中，在37 °C培养箱中孵育45分钟。
    注意：在后续所有步骤中，应将眼球或眼杯放置并操作于生长培养基中，以保护组织并为解剖提供适宜环境。
  4. 移除dispase II溶液，并用生长培养基洗涤眼球两次：吸去旧培养基，加入预热至37 °C的新鲜生长培养基（图1a）。
    注意：经dispase II消化后，眼球会变得柔软。
  5. 用镊子夹住眼球，在置于超净工作台内的解剖显微镜下，使用Vannas剪刀沿每只眼球的锯齿缘做环形切口。
    1. 保持眼球处于液体环境中，沿锯齿缘完整切开后，轻轻向外牵拉，将前段角膜完整去除。
    2. 用齿镊轻柔地将晶状体囊及相关的虹膜色素上皮从眼杯中拉出（图1b，1c）。
  6. 将获得的后极部眼杯置于生长培养基中，在37 °C孵育20分钟，以促进神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）的分离。
  7. 在置于超净工作台内的解剖显微镜下，将后极部眼杯切成4个瓣状。切口应足够长以展平眼杯，但又不宜过长，以保持各瓣之间仍相连（图1d）。
    1. 展平眼杯后，用另一把镊子固定剩余的RPE-脉络膜-巩膜复合体，同时用镊子极其轻柔地从边缘开始牵拉神经视网膜，将其剥离（图1e）。应从边缘开始牵拉，避免从中心开始。
  8. 将所有四等分的组织转移至一个新的无菌培养皿中，该培养皿内已加入预热至37 °C的生长培养基。

4. 原代RPE细胞的分离

  1. 用超细镊子夹住四分之一的视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体的一片花瓣状组织，在层流柜内的解剖显微镜下，使用显微外科半月形刀轻轻将完整的视网膜色素上皮（RPE）细胞层从其下方的基底膜（Bruch膜）上剥离下来（图1f）。
    1. 使用P200移液器将RPE细胞片转移至含有培养基的新无菌培养皿中。转移RPE细胞片时，需先用培养基反复吹打润湿移液器吸头数次，以防止组织黏附在吸头内部。RPE组织与脉络膜可明显区分：RPE颜色偏棕褐色，而脉络膜颜色更深，外观呈黏稠且蓬松状。
    2. 或者，可采用酶消化法并结合轻柔解离，无需使用镊子即可将RPE从脉络膜上分离14。
  2. 在无菌培养皿中用预热至37 °C的培养基清洗RPE细胞片2–3次。每次清洗后，小心收集RPE细胞片，避免混入视网膜碎片或其他组织如脉络膜。最后一次清洗结束后，用P200移液器收集RPE细胞片，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    注意：无需离心RPE细胞片：它们将在1分钟内依靠重力自然沉降。
  3. 用P200移液器吸除多余的培养基。将细胞重悬于新鲜预热的培养基中，并使用P200移液器轻柔吹打混匀。避免产生气泡。理想状态为单细胞悬液，但切勿过度吹打，否则RPE细胞将无法存活。建议非常轻柔地吹打40–50次。

5. 培养RPE细胞

  1. 将细胞接种于培养板中。
    1. 如果下游应用需要维持RPE细胞的极性，则将来自2只小鼠的RPE细胞 接种至一个预先置于12孔培养板中的12 mm聚酯膜插入式培养小室中。建议以高密度接种细胞，因为在此条件下RPE细胞能够保持其原有特性，如六边形形态和色素沉着。
  2. 培养的前72小时内不要移动培养板或更换培养基。3天后，用新鲜预热的生长培养基替换旧培养基。此后每隔一天更换一次培养基。一旦RPE细胞达到汇合状态，将生长培养基中的FBS浓度降低至2%。
    注意：可使用0.25%胰蛋白酶对细胞进行传代。然而，传代后细胞可能在后续培养中失去六边形形态和色素沉着。我们不建议对细胞进行传代，但如果下游实验确实需要，请注意原代细胞无法无限传代：已知其在5–7 次传代后会发生去分化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

由2只小鼠的RPE组织建立的原代培养物，在12 mm聚酯膜插入式培养皿中培养1周后，细胞融合度可达90 - 95%。培养2周后，细胞达到100%融合，并开始形成由六边形、含色素且双核的细胞组成的镶嵌状结构。培养至3周时，细胞继续维持该形态和色素沉积特征，但在培养4周后，部分细胞出现过度色素化（图2）。

可通过使用RPE65抗体（视黄醇异构水解酶，一种在脊椎动物视觉循环中起关键作用的酶，可在光转导过程中将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇）进行免疫染色来评估原代RPE细胞培养的纯度（图3，红色）。通过鬼笔环肽染色可显示细胞间连接的完整性以及六边形形态的存在（图3，绿色）。此外，可利用Western blotting（图4

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本详细方案可稳定建立小鼠原代RPE细胞培养体系，细胞在培养1周后达到汇合状态，并在2周后表现出RPE细胞的主要特征，如六边形形态和色素沉着。所获得的RPE细胞可用于多种后续实验应用，包括维生素A代谢9、光感受器外节段的吞噬作用10、离子转运11、上皮细胞极性2、溶酶体稳态以及自噬12,13。根据不同的下游应用需求，可通过透射和扫描电子显微镜对所获得的细胞培养物形态进行验证，具体方法已在其他文献中详细描述14。为进一步证明培养细胞的成熟状态，还可进行跨上皮电阻（TEER）检测以评估RPE细胞的极性，以及通透性实验4,22、功能检测（如吞噬作用

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

DS 已获得德国拜耳医药保健公司和瑞士罗氏公司的研究资助。其余作者声明不存在竞争性经济利益。 本研究由“预防失明研究”组织提供支持（向威尔默眼科研究所和匹兹堡大学提供的无限制拨款）。  本研究还获得了匹兹堡大学眼科为 DS 提供的启动资金支持。

致谢

本研究部分由 BrightFocus 基金会资助（资助对象：DS）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物
2~3周龄野生型小鼠
名称公司目录编号备注
试剂
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），高糖GIBCO11965092
Dispase IISigmaD4693
胎牛血清（FBS）SigmaF4135
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）GIBCO15140122
MEM非必需氨基酸溶液（100X）GIBCO11140050
磷酸盐缓冲液（PBS），1X，pH 7.4GIBCO10010023
HEPESCellgro61-034
KOHSigma-Aldrich1310-58-3
NaClAmbionAM9759
L-谷氨酰胺（200 mM）GIBCO25030-081
乙醇Fisher Scientific111000200
RPE65抗体由Michael Redmond博士惠赠
荧光素鬼笔环肽                                                           InvitrogenF432
山羊抗兔IgG（H+L），Alexa Fluor 568                    InvitrogenA11011            
山羊血清Sigma-AldrichG9023
DAPIInvitrogenD1306
多聚甲醛（PFA）Polysciences, Inc00380
ZO-1多克隆抗体ThermoFisher Scientific40-2200
名称公司目录编号备注
仪器与设备
层流柜BakerSterilGARD SG403A
解剖显微镜（变倍体视显微镜）NikonSMZ1500
带热空气灭菌功能的CO2培养箱BinderC150
离心机Eppendorf5702
培养皿Fisher Scientific0875712
12 mm聚酯膜细胞培养小室，预装于12孔板中，孔径：0.4 µm，无菌Corning IncorporatedCOR-3460
Westcott肌腱剪，标准刀片，尖头STEPHENS instrumentsS7-1320
Castroviejo缝合镊，0.12 mmStroz Ophthalmic InstrumentsE1796
弯月形直刀Beaver-Visitec International373808
Dumont #5镊子，11 cm，直头，尖端尺寸0.1×0.06 mm，DumostarWorld Precision Instruments500233
Vannas剪刀，8 cm，45°角，标准型World Precision Instruments500260
Millex-GS针头式滤器，0.22 µmMilliporeSLGL0250S
注射器，5 mLBD309632
倒置显微镜 Leica DM IL LED Leica 
移液器Gilson
带滤芯和无滤芯移液器吸头Thermo Scientific

参考文献

  1. Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
  2. Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
  3. Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
  4. Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
  5. Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
  6. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
  7. Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
  8. Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
  9. Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
  10. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  11. Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
  12. Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
  13. Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
  14. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
  15. Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
  16. Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
  17. Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
  18. Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
  19. Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
  21. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
  22. Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
  23. Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

原代细胞培养小鼠RPE分离去眼球解剖组织解离RPE细胞层分离细胞吹打培养汇合度RPE65抗体ZO-1蛋白
小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。