使用双光子激光显微镜的细胞膜修复检测方法

摘要

通过双光子激光对细胞膜造成损伤是评估细胞膜修复能力的常用方法，可应用于多种细胞类型。本文介绍了一种实验方案 体外 活体成像双光子激光消融后肌萎缩蛋白病患者细胞的膜修复过程

摘要

多种病理生理损伤可导致细胞膜受损，当这些损伤与细胞膜修复或完整性的先天缺陷相结合时，可能引发疾病。因此，阐明细胞膜修复相关的分子机制，对于开发针对细胞膜动力学功能障碍相关疾病的新型治疗策略具有重要意义。许多 体外 和 在体内 旨在研究多种疾病背景下细胞膜修复机制的研究常采用双光子激光消融技术，作为评估实验处理后功能结果的标准方法。在该检测中，利用双光子激光对细胞膜造成损伤，导致细胞膜破裂并使荧光染料进入细胞内。随后可通过监测细胞内荧光强度的变化，定量分析细胞自我修复的能力。目前存在多种评估细胞膜损伤反应的替代方法，且双光子激光损伤技术本身也存在较大差异，因此建立一种统一、标准化的细胞损伤模型将有助于减少不同方法之间的变异。本文概述了一种用于评估细胞膜修复能力的简易双光子激光损伤实验方案 体外 在转染或未转染全长dysferlin质粒的健康人和dysferlinopathy患者成纤维细胞中。

引言

真核细胞的细胞膜由双层镶嵌蛋白质的磷脂构成，它界定了细胞的胞内/胞外环境，对维持细胞稳态和细胞存活至关重要。由机械或化学损伤引起的细胞膜损伤在多种哺乳动物细胞类型中十分常见，包括骨骼肌和心肌细胞、胃细胞以及肺细胞^1,2,3,4。除了日常生理功能所导致的损伤外，细胞膜还可能受到环境因素、细菌毒素以及缺血再灌注的损害⁵。若细胞膜破裂后无法重新封闭，将导致细胞外Ca²⁺及其他潜在有毒的胞外成分不受调控地涌入细胞内，进而激活下游信号级联反应，最终迅速引发细胞死亡^1,4,5,6。

迄今为止，已有多种关于细胞膜修复的模型被提出。不同的修复机制可能根据膜破裂的大小和性质被激活。例如，有研究认为细胞膜可能通过侧向流动或蛋白质堵塞来修复微小损伤（<1 nm）。侧向融合模型提出，膜破裂可通过快速募集含dysferlin的膜结构进行侧向修复⁷，而蛋白质堵塞模型则认为微小穿孔是通过蛋白质聚集（主要是annexins）实现修复的⁸。相反，较大的膜损伤会触发依赖Ca²⁺、由dysferlin介导的囊泡融合，并形成修复性“斑块”。在修复斑块模型中，细胞内迅速流入的Ca²⁺会募集多种蛋白质（dysferlin、annexins、mitsugumin-53和EDH蛋白），这些蛋白在膜损伤部位与细胞内囊泡或溶酶体融合，共同形成一个复合物或“"斑块"）^4,9,10,11,12。需要指出的是，这些模型并非互斥，可能协同作用以促进膜修复。若细胞膜损伤无法有效重新封闭，则与多种疾病状态相关，包括肌营养不良（dysferlinopathy——包括Miyoshi肌病、肢带型肌营养不良II型B以及胫前肌起始的远端肌病）¹³、心肌病¹⁴以及Chediak-Higashi综合征（CHS）¹⁵。

鉴于细胞膜完整性和重新封闭在健康与疾病中具有重要作用，深入理解细胞膜修复的潜在分子机制将有助于寻找新的治疗策略。因此，必须具备适当的实验技术来 监测细胞膜修复的动力学过程，并评估其修复能力。多个 体外 已设计出多种用于模拟膜修复的方法。其中一种策略是通过机械损伤实现，可通过移液器、手术刀或剃刀刮擦细胞，或通过在细胞上滚动玻璃珠来完成。¹⁶然而，这种机械损伤会产生较大的病灶，并在培养物内部及不同培养物之间导致细胞损伤程度的高度变异。

另一种产生细胞膜损伤的方法是利用双光子显微镜进行激光消融。与采用单光子激发的传统激光共聚焦显微镜不同，双光子激光同时使用两个长波长、低能量的光子，以激发高能电子¹⁷。这种非线性过程仅在焦平面内发生激发，而不会沿整个光路发生激发¹⁷（图1）。这种减小的激发体积有助于在对活细胞成像时最小化光损伤^18,19。因此，研究人员能够通过荧光染料在细胞膜破裂并随后重新封闭的过程中，实时观察荧光强度的变化，从而在细胞膜上产生精确的损伤并监测其重新封闭过程。

该方法已被多次用于研究膜损伤 体外 和 在体 以及在多种细胞类型中^20,21例如，利用该技术评估了由肌 dysferlin 病患者来源的成纤维细胞和肌管细胞的膜修复缺陷^22,23此外，还使用从小鼠分离的单个肌纤维来监测修复斑块的形成^13,24,25荧光标记蛋白在单根肌纤维膜修复过程中的移动也可被观察到。⁹此外，可以在斑马鱼胚胎中实时观察双光子激光损伤后肌膜修复的过程。 体内²⁶.

本文介绍了一种利用双光子激光损伤技术评估成纤维细胞细胞膜修复动态的方法，尽管该方法也可应用于多种其他细胞类型，以在体外定量分析细胞质膜的再封闭能力。in vitro。在该方法中，细胞与FM4-64共同孵育，这是一种亲脂性、不可透过细胞膜的染料，当其通过细胞膜损伤处进入细胞并结合胞质内带负电荷的磷脂时，会迅速产生荧光（图2&3）。通过定量分析膜损伤附近区域的染料荧光强度，可监测细胞膜自我再封闭所需的时间。为展示该方法的应用价值，我们采用转染了GFP标记的全长dysferlin（DYSF）质粒的dysferlinopathy患者来源成纤维细胞，评估其对细胞膜修复功能的挽救效果。

方案

本研究中使用的人成纤维细胞已获得阿尔伯塔大学医学与牙科学院人类伦理委员会的批准。

1. 使用全长 DYSF 质粒转染细胞

1. 在含有 40 mL 生长培养基（36 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、4 mL 胎牛血清（FBS）和 20 µL 青霉素/链霉素（P/S））的 T225 培养瓶中培养成纤维细胞，置于 37°C 的 CO₂ 培养箱中。
   注意：细胞应培养至约 70–80% 汇合度，不应让其完全汇合。
2. 为接种细胞做准备，用 40 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞两次，然后加入 5 mL 0.05% 胰蛋白酶以使细胞脱落。将细胞放回 37°C CO₂ 培养箱，孵育 5 分钟。
   1. 当细胞完全脱落时，加入 40 mL 生长培养基以终止胰蛋白酶反应。
   2. 使用血细胞计数板或其他细胞计数装置对细胞进行计数。
3. 将浓度为 1×10⁵ 个细胞/mL 的 2 mL 细胞悬液接种至 35 mm 胶原包被的玻璃底培养皿中。在 37°C 的 CO₂ 培养箱中过夜孵育。
   注意：次日细胞汇合度应约为 50–60%。
4. 移除生长培养基，并替换为 2 mL 无血清培养基（不含 FBS 的生长培养基）。
5. 使用脂质体转染法将全长 dysferlin 质粒转染至细胞中。
   1. 在 1.5 mL 离心管中准备 150 µL 无血清培养基（每块待转染的培养皿使用一管）。
   2. 向每个含有无血清培养基的 1.5 mL 离心管中加入 3 µL 转染试剂。室温孵育至少 5 分钟。
   3. 在另一个 1.5 mL 离心管中，加入 175 µL 无血清培养基和 3.5 µg 质粒 DNA。
      注意：若需转染更多培养皿，按比例增加上述用量。
   4. 将含有质粒 DNA 的 150 µL 培养基加入含有 150 µL 无血清培养基和转染试剂的离心管中。室温孵育 20 分钟。
   5. 将 300 µL 含质粒和转染试剂的培养基均匀分布于培养皿中。在 37°C 的 CO₂ 培养箱中孵育 24 小时。
6. 更换为含血清的新鲜生长培养基，并在 37°C 的 CO₂ 培养箱中继续孵育 24 小时。

2. 双光子损伤实验的细胞准备

1. 用移液器吸去培养基，加入 1 mL Tyrode 溶液轻柔冲洗细胞一次，随后加入 1 mL 新鲜 Tyrode 溶液，并加入 1 µL 的 2.5 mM FM 4-64 染料。
   注意：FM 4-64 染料的终浓度为 2.5 µM。
2. 若需在无钙环境中评估细胞膜修复能力，先用 1 mL PBS 冲洗细胞，然后加入含 1 mM EGTA 的 1 mL PBS。
   注意：由于 PBS 会随时间推移导致细胞脱落，因此损伤实验应尽快完成。

3. 双光子激光损伤检测

1. 使用倒置共聚焦显微镜及配套程序软件，创建一个 0.2 µm × 2 µm 的目标区域，并将其放置在细胞膜边缘，使目标线与细胞膜走向重叠且垂直（图 2）。
2. 使用 543 nm 的 HeNe 激光激发 FM 染料信号，并将检测范围设定为 600–760 nm；使用 488 nm 的氩离子激光激发 GFP 信号（图 4），并将检测范围设定为 500–550 nm。
   1. 创建一个持续 5 分钟的时间序列，进行连续图像扫描，每 5 秒对细胞成像一次。
   2. 为制造细胞膜损伤，使用设定为 820 nm 的双光子激光对细胞进行漂白处理，激光功率为 15%，迭代次数为 10 次，在时间序列开始后 25 秒进行漂白。
3. 为定量分析 FM 4-64 染料的荧光强度，使用软件绘制一个 6 µm × 6 µm 的感兴趣区域（ROI），将其置于损伤部位附近且位于细胞内部（图 3）。
   注意：通过软件中的"Range Indicator"功能避免采集像素过饱和区域——在此应用中，红色像素代表过饱和像素。将原始荧光值导出至电子表格中用于统计分析。
4. 通过减去背景值（膜损伤前时间点的平均荧光值），再将净增加量除以 t = 0 时的荧光值，计算每个时间点的相对荧光值（图 5、6）。

结果

对健康人成纤维细胞、未经处理的肌营养不良蛋白病患者成纤维细胞以及转染了含有全长dysferlin序列质粒的患者成纤维细胞进行双光子激光损伤，以实时评估细胞膜的修复能力。激光损伤后，健康人成纤维细胞表现出较低水平的FM 4-64荧光激活，而未经处理的患者成纤维细胞在损伤后显示出较高的相对荧光强度（图5&6）。转染了全长dysferlin质粒的患者细胞其相对FM 4-64荧光强度较未经处理的患者对照组降低，且与健康对照组观察到的荧光值相当（图5&6）。

讨论

双光子激光损伤细胞膜是一种用于评估膜修复动态过程的精确且多功能的技术 体外本文介绍了一种利用双光子激光损伤检测法测定肌萎缩蛋白病患者细胞膜修复能力的实验方案。我们的结果显示，肌萎缩蛋白病患者的细胞在细胞膜修复方面存在缺陷，该结果与其他研究者的发现一致，进一步凸显了肌肉细胞与非肌肉细胞在细胞膜修复动力学方面的显著相似性。^3,11,15,22我们还观察到，转染了含有全长dysferlin序列质粒的患者细胞，其膜修复缺陷表型得到了挽救，表明全长dysferlin质粒不仅可在肌肉细胞中，也可在非肌肉细胞类型中挽救表型²⁷.

综上所述，我们的结果进一步验证了双光子细胞膜损伤实验在评估细胞膜修复能力方面的可行性和可靠性，使其成为该领域的金标准方法 体外然而...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher	11320033
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F1051
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher	15140122
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537
35 mm 胶原包被的玻璃底培养皿	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
无血清培养基	Thermo Fisher	31985070
转染试剂	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 染料	Invitrogen	T13320
Tyrode’s 盐溶液	Sigma-Aldrich	T2397
共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss	NA
Chameleon 双光子激光器	Coherent	NA