血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
在损伤或炎症发生时，白细胞向损伤部位或组织损伤区域的募集过程在过去几十年中得到了广泛研究，并由此提出了白细胞黏附级联反应的概念。然而，参与白细胞募集的精确分子机制尚未完全阐明。由于白细胞募集仍是感染、炎症及（自身）免疫研究领域的重要课题，本文介绍一种基于层流的简便实验方法，用于研究在静脉和动脉流动条件下白细胞黏附、去黏附及跨内皮迁移的潜在机制。体外实验可用于研究不同血管炎症模型中白细胞与其细胞伙伴相互作用背后的分子机制。本方案描述了一种基于层流的实验方法，使用平行流室装置，并结合连接摄像机的倒置相差显微镜，以观察、记录并离线分析白细胞与内皮细胞或血小板之间的相互作用。可通过抑制剂或抗体对内皮细胞、血小板或白细胞进行预处理，以确定特定分子在此过程中的作用。剪切条件，即动脉或静脉剪切应力，可通过灌注液体的黏度、流速以及流道高度进行灵活调节。
引言
当发生损伤、炎症或感染时，白细胞会迅速响应病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs），转变为活化状态，并从血液中迁移至炎症和组织损伤部位。白细胞与其细胞和分子环境相互作用的能力对其作为免疫细胞的正常功能至关重要，这一点在白细胞黏附缺陷等遗传性疾病中尤为突出。1白细胞黏附在过去的几十年中一直是深入研究的课题，这促成了20世纪90年代初白细胞黏附级联概念的提出。2,3白细胞黏附始于选择素介导的白细胞与内皮细胞的捕获，导致白细胞在血管表面滚动。这种滚动使白细胞能够扫描内皮表面结合的迁移信号。 例如趋化因子可诱导整合素的活化。随后，活化的整合素介导白细胞与内皮配体的结合，导致白细胞牢固黏附。白细胞可进一步通过爬行和铺展为穿出血管做准备，继而穿透内皮单层并迁移至下方组织。自提出以来，经典的白细胞级联反应基本概念基本保持不变，仅增加了一些中间步骤4然而，迄今为止，白细胞募集过程中涉及的众多分子机制及其参与因子的具体作用尚未完全阐明，白细胞募集仍是感染、炎症及（自身）免疫研究领域的重要课题。
例如，在动脉粥样硬化等血管炎症性疾病过程中，白细胞向血管壁的募集增加会促进斑块的形成。不稳定的动脉粥样硬化斑块可能发生破裂，导致血小板和凝血系统被大量激活，进而引起血管闭塞5这可能导致严重的心血管后果，例如心肌梗死或脑卒中。此外，临床上发生的心内膜剥脱 例如 冠状动脉支架植入术后，白细胞和血小板与暴露的血管壁内表面发生多种相互作用（例如、基质成分和平滑肌细胞）以及白细胞与覆盖血管损伤处的血小板之间的相互作用。这些相互作用对于疾病的进一步发展具有重要意义，因为单核细胞-血小板相互作用可能促进内膜增生的形成6,7此外，由白细胞整合素 Mac-1（αMβ2血小板GPIbα最近被鉴定为小鼠血栓形成的新驱动因子8.
鉴于人和动物血液作为白细胞和血小板研究来源的广泛可得性，以及分离基质分子和源自白细胞与血管的永生化细胞系的多样性，在实验室环境中使用专门设计的流动灌注腔室模拟流动条件下的白细胞相互作用是可行的。在过去几十年中已设计出多种变体，从真空驱动到自粘式灌注腔室不等。所有变体的共同点在于其固定部分（例如，培养的血管细胞或基质蛋白）被组装到一个更大的无泄漏腔室中，该腔室配备有预定义的通道，可使液体流经固定部分。此外，模具技术的进步推动了基于硅基聚合物的定制化解决方案的开发9灌注液的黏度和流速以及通道的高度主要决定了流动灌注装置的剪切应力特性10在本文中，我们介绍了一种 体外 研究白细胞在静脉和动脉血流条件下黏附、去黏附及跨内皮迁移潜在机制的方法。本文所介绍方法的优势在于，仅需使用常规的连接相机的荧光显微镜即可完成实验，且不要求操作者具备高难度的技术操作能力。 体外 检测方法可以通过多种方式进行调整（例如，通过添加抑制剂或阻断抗体），因此适用于不同类型的血管炎症模型，可用于研究黏附蛋白的功能或评估特定化合物的效果。
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方案
本文所述所有方法均已获得马斯特里赫特大学医学伦理委员会和动物伦理委员会的批准。
1. 基于流动的人类细胞检测实验
- 从人血中分离血小板
- 使用含3.2%枸橼酸盐抗凝剂采集静脉血。
- 向血液中加入1/15体积的酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD：80 mM 枸橼酸三钠、52 mM 柠檬酸和183 mM 葡萄糖）。
- 以350 × g离心15分钟，不使用刹车，以获得富血小板血浆（PRP）。
- 将上清液转移至15 mL锥形管中，并加入1/20体积的ACD。
- 以1,110 g离心15分钟，不使用刹车，以获得乏血小板血浆（PPP）。
- 弃去上清液。剪掉移液器吸头（P 1000）的尖端，使其成为宽口吸头，以帮助防止血小板活化，并在血小板缓冲液 pH 6.6（PB：136 mM NaCl，10 mM Hepes，2.7 mM KCl，2 mM MgCl₂）中，小心地将血小板沉淀重悬至与PRP相同的体积2，0.1% 牛血清白蛋白和 0.1% 葡萄糖）。加入 1/20 体积的 ACD，轻轻混匀。
- 在1,110 g条件下离心15分钟，不使用刹车，使血小板沉淀。
- 弃去上清液，然后如上所述在1 mL血小板缓冲液（pH 7.5）中小心重悬血小板。
- 使用全自动血细胞分析仪检测1/10稀释度的血小板浓度。
- 用血小板缓冲液（pH 7.5）调节体积，使细胞浓度达到 2 × 107/mL
- 从人血中分离多形核细胞（改编自 Brinkmann） 等11 )
- 使用肝素（10 U/mL）作为抗凝剂，采集24 mL血液。
- 加入6 mL密度为1.077 g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠介质（参见 材料表) 加入15 mL锥形管中，小心地将5-6 mL全血覆盖于上层。
- 800 × g 离心 20 分钟，不使用刹车。
- 吸弃上层澄清的淡黄色液体，将含有粒细胞的下层红色相转移至新的15 mL锥形管中。加入含2 mM EDTA的PBS至终体积14 mL洗涤细胞，300 × g离心10分钟，离心时不用刹车。
- 同时，准备密度梯度介质（例如，Percoll，参见 材料表将18 mL密度梯度介质与2 mL 10x PBS储存液混合，配制成工作液。再用PBS（1x）将该工作液稀释，分别获得85%、80%、75%、70%和65%的梯度介质溶液各4.25 mL。
- 准备两个锥形管，通过将每种浓度的介质按从高到低的顺序依次叠加2 mL形成密度梯度。从最高浓度开始，依次递减。使用防水记号笔在管壁上标记各层位置。
- 将2 mL细胞悬液小心地铺加到两个已制备好的梯度液上层。
- 在已精确平衡的离心机中，以800 × g离心20分钟，不使用刹车。
- 离心后，移除上层及大部分65%层（第一环，含PBMCs），收集白色残留的界面层至新离心管中，直至85%层（第二环，PMN）。
- 用含2 mM EDTA的PBS填充离心管洗涤细胞，300 × g离心10分钟，不启用刹车。
- 移去上清液，将沉淀的细胞（通常 ≥95% 为 PMN）重悬于 1 mL Hank's 缓冲液（pH 7.45），该缓冲液含有 10 mM Hepes 和 0.2% 人血清白蛋白（测定缓冲液）。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞悬浮于 1 x 106/mL
- 继续进行白细胞的荧光标记和灌注（步骤 3.3）。
- 制备贴壁血小板及血管细胞单层
- 细胞培养皿制备（培养细胞）
- 用1 mL稀释的大鼠尾胶原（30 µg/mL，溶于PBS，经0.2 µm滤膜过滤）预包被35 mm细胞培养皿。
- 37 °C孵育30分钟，弃去胶原溶液，用PBS洗涤一次。
- 培养皿中血管细胞的培养
- 分离原代（例如，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人主动脉内皮细胞（HAoEC）、人主动脉平滑肌细胞（HAoSMC）或永生化血管细胞（例如，EA.Hy926，SVEC）在T75培养瓶中培养至融合，加入1.5 mL细胞解离溶液例如，Accutase）。加入4.5 mL合适的生长培养基以中和细胞解离液，并使用细胞计数板测定细胞浓度。将细胞重悬于0.5 × 105 细胞/mL，置于适当的生长培养基中（例如完全内皮细胞生长培养基
- 向每个35 mm培养皿中加入2 mL细胞悬液。将细胞置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中培养。2 直至细胞融合（所需时间根据细胞类型而定，为24–48小时）。
- 玻璃盖玻片制备（黏附血小板）
- 将玻璃盖玻片浸入 HCl-EtOH（1.2 M / 50% v/v）中一次。
- 用超纯水冲洗盖玻片2次。
- 在氮气下干燥盖玻片2.
- 用移液器吸取100 µL稀释的大鼠尾部I型胶原蛋白溶液（用0.2 µm滤器过滤的PBS将胶原蛋白稀释至30 µg/mL），根据灌流室通道的位置，预先包被在玻璃盖玻片上。
- 室温孵育30分钟，弃去胶原溶液，用PBS洗涤盖玻片3次。
- 在室温下用 HEPES 中的 1% BSA 封闭胶原包被的盖玻片 0.5 小时。
- 清洗并干燥盖玻片，然后将其安装到灌流室中。按照步骤1.1或2.1所述，分别从人或小鼠血液中分离血小板。
- 血小板的固定化
- 加入70 µL浓度为2 × 107每通道加入 /mL 血小板悬浮液，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1.5 小时2.
- 小心地用封闭液（含5% BSA的HEPES溶液）替换未贴壁的血小板，室温孵育至少30分钟。随后进行荧光标记及白细胞灌注（步骤3.3）。
- 血管细胞单层刺激
- 用含有 10 ng/mL 肿瘤坏死因子 α (TNFα) 的新鲜培养基替换原有培养基，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下刺激血管细胞 4 小时。2.
- 细胞培养皿制备（培养细胞）
2. 基于流动的小鼠细胞检测实验
- 从小鼠血液中分离血小板
- 使用21 G针头通过心脏穿刺采集麻醉小鼠（氯胺酮80 mg/kg和美托咪啶0.3 mg/kg）的血液（约1 mL），以3.2%枸橼酸钠作为抗凝剂。
- 加入1/6体积的ACD溶液。
- 以220 × g离心5分钟，使用中等刹车，获得富血小板血浆（PRP）。
- 将上清液（约600 µL）连同1/3体积的红细胞转移至新管中。
- 以95 × g离心6分钟，不使用刹车。
- 转移上清液（PRP），并在Tyrode缓冲液（TH缓冲液：136 mM NaCl、5 mM Hepes、2.7 mM KCl、0.42 mM NaH2PO4·H2O、2 mM MgCl2、0.1%牛血清白蛋白和0.1%葡萄糖）中按1:10稀释，使用全自动血液分析仪测定血小板浓度。
- 加入1/25体积的ACD溶液和0.1 U/mL无机焦磷酸酶（apyrase），洗涤血小板，并以2,870 × g离心2分钟，使用中等刹车。
- 弃去上清液，加入600 µL TH缓冲液、1/10体积的ACD溶液和0.1 U/mL无机焦磷酸酶。剪去移液枪头（P1000）的尖端，使其成为宽口枪头，有助于防止血小板活化，然后轻柔重悬沉淀。
- 以2,870 × g离心2分钟，使用中等刹车。
- 弃去上清液，用TH缓冲液轻柔重悬血小板。
- 用TH缓冲液调整体积，使血小板浓度达到2 × 107/mL。
- 制备贴壁血小板单层
- 按照步骤1.3.3制备玻璃盖玻片（用于贴壁血小板）。
- 血小板的固定
- 每通道加入100 µL浓度为2 × 107/mL的血小板悬液，在37 °C、5% CO2条件下孵育1.5小时。
- 小心移除非贴壁血小板，加入封闭液（含5% BSA的HEPES缓冲液），室温孵育至少30分钟。随后进行荧光标记和白细胞灌注（步骤3.3）。
- 刺激小鼠血小板单层
- 在进行白细胞灌注前（步骤3.3），使用含0.5 nM凝血酶的HHHSA缓冲液在37 °C下灌注3分钟，以刺激血小板。
3. 白细胞（人源性中性粒细胞PMN或THP-1，以及小鼠源性RAW264.7或原代小鼠单核细胞）的荧光标记与灌注（用于基于流动的实验）
- 荧光标记
- 标记白细胞（1 × 106/mL）与细胞膜通透性绿色荧光核酸染料（1 µM）孵育，37 °C 条件下培养 30 分钟。
- 以300 × g离心5分钟，用PBS洗涤细胞，然后将细胞重悬至浓度为0.5 × 106 细胞/mL（每种检测条件5 mL，根据流速而定）于检测缓冲液中。
- 流动腔实验准备
- 对于白细胞在细胞单层上的黏附实验，弃去培养皿中的细胞培养基，并将培养皿组装到流动室中。将管路连接至注射器。对于白细胞在固定化血小板上的黏附实验，将微滑片连接至注射器。将水浴预热至 37 °C。
- 取一个灌注注射器（50 mL），将注射器安装在注射器架上，并将泵设置为抽取模式。将泵的体积设为 0 mL，对于 50 mL 注射器，将直径设为 26.70 mm。
- 将一个弯头鲁尔接头连接到管路的一端。将鲁尔锁紧接头安装在注射器上，并将带弯头鲁尔接头的管路连接至该鲁尔锁紧接头。将管路的自由端连接至灌流 chamber。
- 白细胞灌注与黏附
- 对于白细胞在细胞单层上的黏附实验，弃去培养皿中的细胞培养基，并将培养皿组装到流动腔室中。将管路连接至注射器。对于白细胞在固定化血小板上的黏附实验，将微滑片连接至注射器。
- 对于白细胞在血管或血小板单层上的灌注与黏附实验，将第二根管路插入含有检测缓冲液的50 mL锥形管中，使用1 mL移液器向管路内注液，随后挤压管路并将其连接至流动腔室。
- 白细胞灌注前，加入 3 mM CaCl2 和 2 mM MgCl2 向细胞悬液中加入并置于37 °C孵育5分钟。
- 在灌注细胞之前，先灌注测定缓冲液，以去除腔室和管路中可能存在的空气。
- 通过捏紧管端封闭，将管路从检测缓冲液切换至细胞悬液，避免产生气泡。以适当的流速/剪切应力灌注细胞，直至首个细胞到达。
- 以适当的流速/剪切应力灌注细胞2分钟，并在滚动和黏附细胞的2–6分钟期间，使用倒置相差/荧光显微镜至少采集6张图像例如，使用100倍放大倍数的EVOS-FL显微镜连接数字CCD或CMOS相机。
注意：流速/剪切应力取决于灌注室的尺寸和灌注液的黏度。对于本实验所用的灌注室（见 材料表):
τ=η*97.1*Φ
τ：剪切应力（1 达因/平方厘米）2)
η：黏度（0.015 dyn·s/cm）2)
Φ流速（0.67 mL/min）
- 白细胞去黏附
- 去黏附时，通过挤压管路将细胞悬液切换至检测缓冲液，防止产生气泡。
- 通过以适当的流速/剪切力用检测缓冲液灌注来解离细胞（参见3.3.7注释）。
- 白细胞跨内皮迁移
- 对于白细胞跨内皮迁移实验，灌注白细胞（步骤3），直至有足够数量的白细胞黏附（约50个细胞/视野）。
- 用检测缓冲液替换白细胞悬液。
- 在37 °C条件下，每隔10–15秒进行一次延时成像，持续记录30–60分钟内的迁移细胞。
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结果
为研究内皮细胞-白细胞黏附，将荧光标记的 THP-1 细胞在 3 dyne/cm2 的剪切力下，灌注于经 TNFα 刺激或未刺激的内皮单层细胞上持续 2 分钟。灌注 2 分钟后，在 2 至 6 分钟内采集 6 个独立视野，以确定黏附的单核细胞总数。使用倒置相差/荧光显微镜（例如，EVOS-FL）在 10X 放大倍数下连接数字 CCD 或 CMOS 相机拍摄至少 6 张图像，对黏附细胞进行定量分析，并以每平方毫米黏附细胞数（cells/mm2）表示平均值。经 TNFα 刺激内皮细胞后，THP-1 细胞的黏附显著高于未刺激的内皮层。非刺激或 TNFα 刺激的内皮细胞上牢固黏附的 THP-1 细胞的代表性显微图像及其定量结果见图 1。通过在 1 dyne/cm2 的剪切力下将荧光标记的中性粒细胞灌注于经 TRAP-6 刺激或未刺激的血小板单层上 2 分钟，评估血小板-白细胞黏附。黏附的中性粒细胞定量方法同上。与未刺激的血小板相比，TRA...
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讨论
这种 in vitro 检测是一种研究血管炎症过程中白细胞募集潜在机制的简便方法，但需注意一些关键要点。成功实施该检测的首要条件是将白细胞灌注于完整且融合的血管内皮单层或血小板单层表面。可通过预先用 I 型胶原对表面进行包被来实现这一点。通常，在使用原代血管细胞时，重要的是使用推荐的含胶原酶的解离液（见材料表）轻柔地解离细胞，这种方法比胰蛋白酶更温和，但效果相当。对于血小板单层，重要的是在分离过程中轻柔洗涤血小板，以防止血小板活化和聚集。
另一个关键考虑因素是保持灌注过程中泵吸模式的连续性，因为不连续会导致流速和剪切条件紊乱。这将导致实际剪切应力的不准确，进而造成对生理上依赖剪切力过程的误判。通过定期维护泵可避免这一问题。此外，灌注过程中保持连续性的关键在于每次实验均使用新的注射器。由于注射器内橡胶材质随着使用次数增加以及实验间隔时间延长而发生改变，会影响连续吸液的稳定性。
另一个关键步骤是在白细胞灌注过程中防止空气滞留，因为空气随后会将细胞从表面撕脱并改变剪切条件。为避免此...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Martin M. Schmitt 博士和 Line Fraemohs 博士。本工作由荷兰科学研究基金会（ZonMW VIDI 016.126.358）、兰德施泰纳输血研究基金会（LSBR 编号 1638）以及德国研究基金会（SFB1123/A2）资助，资助授予 R.R.K.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 倒置荧光显微镜，例如 EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| 泵，例如 型号：210-CE | World Precision Instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm 组织培养处理型易握式细胞培养皿 | Corning | 353001 | |
| 50 mL 注射器 | Becton Dickinson | 300137 | |
| 硅胶管 | VWR | 228-0700 | |
| Luer 接头弯头公接头 | Ibidi | 10802 | |
| Luer 锁母接头 | Ibidi | 10823 | |
| 流动腔室 | 亚琛工业大学附属医院 | 专利 DE10328277A1：Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| 用于粘附式载片的盖玻片 | Ibidi | 10812 | |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| 重组人肿瘤坏死因子-α | Peprotech | 300-01A | |
| 肽6血栓调节蛋白受体激活剂（TRAP-6） | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 绿色荧光核酸染料 | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ 平衡盐溶液 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES 缓冲液 1 M，液体 | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE 白蛋白，25% | Baxter | 60010 | |
| 注射用水 | B. Braun | 3624315 | |
| 二水合氯化钙 | Merck | 102382 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| 腺苷三磷酸双磷酸酶（Apyrase） | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| 原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC） | Promocell GmbH | C-12203 | |
| 内皮细胞生长培养基（即用型） | Promocell GmbH | C-22010 | |
| 原代人主动脉内皮细胞（HAoEC） | ATCC | PCS-100-011 | |
| 血管细胞基础培养基 | ATCC | PCS-100-030 | |
| 内皮细胞生长试剂盒-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| 原代人主动脉平滑肌细胞（HAoSMC） | ATCC | PCS-100-012 | |
| 血管平滑肌细胞生长试剂盒 | ATCC | PCS-100-042 | |
| 人内皮细胞系 EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | ATCC | 30-2002 | |
| 小鼠内皮细胞系，SV40 转化（SVEC4-10） | ATCC | CRL-2181 | |
| 人单核细胞系 THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| 含超量谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基 | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| 小鼠单核/巨噬细胞 RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖 | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer 塑料采血管（含肝素钠） | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE 采血管 9 ml 9NC 凝血用 3.2% 枸橼酸钠 | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/乙醇混合液（1.2 mol/L HCl 和 50% 乙醇）水溶液 | Sigma-Aldrich Chemie | 在通风橱中将 0.3 L HCl（4 mol/L）与 0.7 L 70% v/v 乙醇混合配制 |
参考文献
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