血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
在损伤或炎症发生时，白细胞向损伤部位或组织损伤区域的募集过程在过去几十年中得到了广泛研究，并由此提出了白细胞黏附级联反应的概念。然而，参与白细胞募集的精确分子机制尚未完全阐明。由于白细胞募集仍是感染、炎症及（自身）免疫研究领域的重要课题，本文介绍一种基于层流的简便实验方法，用于研究在静脉和动脉流动条件下白细胞黏附、去黏附及跨内皮迁移的潜在机制。体外实验可用于研究不同血管炎症模型中白细胞与其细胞伙伴相互作用背后的分子机制。本方案描述了一种基于层流的实验方法，使用平行流室装置，并结合连接摄像机的倒置相差显微镜，以观察、记录并离线分析白细胞与内皮细胞或血小板之间的相互作用。可通过抑制剂或抗体对内皮细胞、血小板或白细胞进行预处理，以确定特定分子在此过程中的作用。剪切条件，即动脉或静脉剪切应力，可通过灌注液体的黏度、流速以及流道高度进行灵活调节。
引言
当发生损伤、炎症或感染时，白细胞会迅速响应病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs），转变为活化状态，并从血液中迁移至炎症和组织损伤部位。白细胞与其细胞和分子环境相互作用的能力对其作为免疫细胞的正常功能至关重要，这一点在白细胞黏附缺陷等遗传性疾病中尤为突出。1白细胞黏附在过去的几十年中一直是深入研究的课题，这促成了20世纪90年代初白细胞黏附级联概念的提出。2,3白细胞黏附始于选择素介导的白细胞与内皮细胞的捕获，导致白细胞在血管表面滚动。这种滚动使白细胞能够扫描内皮表面结合的迁移信号。 例如趋化因子可诱导整合素的活化。随后，活化的整合素介导白细胞与内皮配体的结合，导致白细胞牢固黏附。白细胞可进一步通过爬行和铺展为穿出血管做准备，继而穿透内皮单层并迁移至下方组织。自提出以来，经典的白细胞级联反应基本概念基本保持不变，仅增加了一些中间步骤4然而，迄今为止，白细胞募集过程中涉及的众多分子机制及其参与因子的具体作用尚未完全阐明，白细胞募集仍是感染、炎症及（自身）免疫研究领域的重要课题。
例如，在动脉粥样硬化等血管炎症性疾病过程中，白细胞向血管壁的募集增加会促进斑块的形成。不稳定的动脉粥样硬化斑块可能发生破裂，导致血小板和凝血系统被大量....
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方案
本文所述所有方法均已获得马斯特里赫特大学医学伦理委员会和动物伦理委员会的批准。
1. 基于流动的人类细胞检测实验
- 从人血中分离血小板
- 使用含3.2%枸橼酸盐抗凝剂采集静脉血。
- 向血液中加入1/15体积的酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD：80 mM 枸橼酸三钠、52 mM 柠檬酸和183 mM 葡萄糖）。
- 以350 × g离心15分钟，不使用刹车，以获得富血小板血浆（PRP）。
- 将上清液转移至15 mL锥形管中，并加入1/20体积的ACD。
- 以1,110 g离心15分钟，不使用刹车，以获得乏血小板血浆（PPP）。
- 弃去上清液。剪掉移液器吸头（P 1000）的尖端，使其成为宽口吸头，以帮助防止血小板活化，并在血小板缓冲液 pH 6.6（PB：136 mM NaCl，10 mM Hepes，2.7 mM KCl，2 mM MgCl₂）中，小心地将血小板沉淀重悬至与PRP相同的体积2，0.1% 牛血清白蛋白和 0.1% 葡萄糖）。加入 1/20 体积的 ACD，轻轻混匀。
- 在1,110 g条件下离心15分钟，不使用刹车，使血小板沉淀。
- 弃去上清液，然后如上所述在1 mL血小板缓冲液（pH 7.5）中小心重悬血小板。
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结果
为研究内皮细胞-白细胞黏附，将荧光标记的 THP-1 细胞在 3 dyne/cm2 的剪切力下，灌注于经 TNFα 刺激或未刺激的内皮单层细胞上持续 2 分钟。灌注 2 分钟后，在 2 至 6 分钟内采集 6 个独立视野，以确定黏附的单核细胞总数。使用倒置相差/荧光显微镜（例如，EVOS-FL）在 10X 放大倍数下连接数字 CCD 或 CMOS 相机拍摄至少 6 张图像，对黏附细胞进行定量分析，并以每平方毫米黏附细胞数（cells/mm2）表示平均值。经 TNFα 刺激内皮细胞后，THP-1 细胞的黏附显著高于未刺激的内皮层。非刺激或 TNFα 刺激的内皮细胞上牢固黏附的 THP-1 细胞的代表性显微图像及其定量结果见图 1。通过在 1 dyne/cm2 的剪切力下将荧光标记的中性粒细胞灌注于经 TRAP-6 刺激或未刺激的血小板单层上 2 分钟，评估血小板-白细胞黏附。黏附的中性粒细胞定量方法同上。与未刺激的血小板相比，TRA.......
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讨论
这种 in vitro 检测是一种研究血管炎症过程中白细胞募集潜在机制的简便方法，但需注意一些关键要点。成功实施该检测的首要条件是将白细胞灌注于完整且融合的血管内皮单层或血小板单层表面。可通过预先用 I 型胶原对表面进行包被来实现这一点。通常，在使用原代血管细胞时，重要的是使用推荐的含胶原酶的解离液（见材料表）轻柔地解离细胞，这种方法比胰蛋白酶更温和，但效果相当。对于血小板单层，重要的是在分离过程中轻柔洗涤血小板，以防止血小板活化和聚集。
另一个关键考虑因素是保持灌注过程中泵吸模式的连续性，因为不连续会导致流速和剪切条件紊乱。这将导致实际剪切应力的不准确，进而造成对生理上依赖剪切力过程的误判。通过定期维护泵可避免这一问题。此外，灌注过程中保持连续性的关键在于每次实验均使用新的注射器。由于注射器内橡胶材质随着使用次数增加以及实验间隔时间延长而发生改变，会影响连续吸液的稳定性。
另一个关键步骤是在白细胞灌注过程中防止空气滞留，因为空气随后会将细胞从表面撕脱并改变剪切条件。为避免此.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Martin M. Schmitt 博士和 Line Fraemohs 博士。本工作由荷兰科学研究基金会（ZonMW VIDI 016.126.358）、兰德施泰纳输血研究基金会（LSBR 编号 1638）以及德国研究基金会（SFB1123/A2）资助，资助授予 R.R.K.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 倒置荧光显微镜，例如 EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| 泵，例如 型号：210-CE | World Precision Instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm 组织培养处理型易握式细胞培养皿 | Corning | 353001 | |
| 50 mL 注射器 | Becton Dickinson | 300137 | |
| 硅胶管 | VWR | 228-0700 | |
| Luer 接头弯头公接头 | Ibidi | 10802 | |
| Luer 锁母接头 | Ibidi | 10823 | |
| 流动腔室 | 亚琛工业大学附属医院 | 专利 DE10328277A1：Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| 用于粘附式载片的盖玻片 | Ibidi | 10812 | |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| 重组人肿瘤坏死因子-α | Peprotech | 300-01A | |
| 肽6血栓调节蛋白受体激活剂（TRAP-6） | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 绿色荧光核酸染料 | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ 平衡盐溶液 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES 缓冲液 1 M，液体 | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE 白蛋白，25% | Baxter | 60010 | |
| 注射用水 | B. Braun | 3624315 | |
| 二水合氯化钙 | Merck | 102382 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| 腺苷三磷酸双磷酸酶（Apyrase） | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| 原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC） | Promocell GmbH | C-12203 | |
| 内皮细胞生长培养基（即用型） | Promocell GmbH | C-22010 | |
| 原代人主动脉内皮细胞（HAoEC） | ATCC | PCS-100-011 | |
| 血管细胞基础培养基 | ATCC | PCS-100-030 | |
| 内皮细胞生长试剂盒-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| 原代人主动脉平滑肌细胞（HAoSMC） | ATCC | PCS-100-012 | |
| 血管平滑肌细胞生长试剂盒 | ATCC | PCS-100-042 | |
| 人内皮细胞系 EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | ATCC | 30-2002 | |
| 小鼠内皮细胞系，SV40 转化（SVEC4-10） | ATCC | CRL-2181 | |
| 人单核细胞系 THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| 含超量谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基 | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| 小鼠单核/巨噬细胞 RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖 | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer 塑料采血管（含肝素钠） | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE 采血管 9 ml 9NC 凝血用 3.2% 枸橼酸钠 | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/乙醇混合液（1.2 mol/L HCl 和 50% 乙醇）水溶液 | Sigma-Aldrich Chemie | 在通风橱中将 0.3 L HCl（4 mol/L）与 0.7 L 70% v/v 乙醇混合配制 |
参考文献
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leuko....
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