从肉瘤患者来源的异种移植瘤中分离与表征肿瘤起始细胞

摘要

我们描述了一种通过荧光激活细胞分选法从人源异种移植性肉瘤组织中分离肿瘤起始细胞的详细方案，该方法以人白细胞抗原-1（HLA-1）作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的肿瘤起始细胞进行验证和表征。

摘要

过去十年中，越来越多的证据支持肿瘤起始细胞（TICs）的存在及其重要性。研究表明，这些TICs在肿瘤的发生、转移以及耐药性中起关键作用。因此，除了目前主要针对非TICs肿瘤细胞群体的化疗策略外，开发特异性的TIC靶向治疗显得尤为重要。为了进一步理解TICs恶性行为背后的机制，本文描述了一种从人源肉瘤中分离和表征TICs的方法。在此，我们提供了一套详细的实验方案，用于建立人源肉瘤的患者来源异种移植模型（PDXs），并通过荧光激活细胞分选技术（FACS）利用人白细胞抗原I类分子（HLA-1）作为阴性标记物来分离TICs。此外，我们还阐述了如何对这些TICs进行功能学表征，包括成球形成实验和成瘤实验，并诱导其向间充质谱系分化。对PDX来源TICs的分离与表征，为发现潜在的靶向治疗药物提供了重要线索。而且，越来越多的证据表明，该方案还可进一步拓展应用于其他类型人类癌症中TICs的分离与鉴定。

引言

过去十年间，越来越多的证据表明人类癌症存在肿瘤内细胞异质性¹。与正常组织类似，肿瘤组织包含一小部分具有成瘤能力的肿瘤起始细胞（TICs，也称为肿瘤干细胞）；而大部分肿瘤细胞则表现出分化表型²。这些TICs具有类似干细胞的特性，包括表达干细胞标志物以及具备自我更新和不对称细胞分裂的能力，因此能够启动形成具有细胞异质性的肿瘤³。近期研究表明，TICs不仅在肿瘤发生中起关键作用，还与肿瘤侵袭性⁴、转移⁵以及耐药性⁶密切相关。因此，深入理解TICs的生物学特性，进而开发针对这些TICs的特异性治疗策略至关重要。

基于FACS的方法已被用于通过TIC标志物（如CD133、CD24和CD44¹）鉴定肿瘤起始细胞（TICs）。这些标志物中的大多数也在正常干细胞中表达⁷。然而，目前尚无任何一种标志物能够特异性地标记TICs。这些分子在TIC恶性表型中所起的作用仍不明确。例如，CD133常因DNA甲基化而失活，因此这种肿瘤间异质性可能影响这些标志物的准确性⁸。ALDH1是一种同样具有维持TIC干性功能的标志物⁹。它在鉴定乳腺癌TICs方面似乎更为有效，但在其他肿瘤类型中的适用性仍存疑⁹。一些信号通路在干细胞生物学中发挥重要作用，包括Wnt（wingless相关整合位点）、TGF-β（转化生长因子β）和Hedgehog通路¹。然而，要证明这些通路具有TIC特异性，并利用其活性从原发性肿瘤中分离TICs仍存在困难。因此，迫切需要发现一种可靠的新TIC标志物。

人类MHC I类分子，也称为HLA-1，是一种几乎在所有有核细胞表面表达的膜蛋白¹⁰。HLA-1作为抗原呈递分子，可被CD8 T细胞特异性识别¹⁰。当肿瘤细胞通过HLA-1呈递肿瘤抗原时，可激活CD8 T细胞的细胞毒性效应。因此，肿瘤细胞表面缺乏HLA-1可能导致其逃避免疫系统中细胞毒性CD8 T细胞的攻击。HLA-1的表达下调已在多种人类癌症中被报道，并与不良预后、转移及药物耐药性相关¹¹。我们已证实，HLA-1在细胞表面的表达缺失可用于鉴定肉瘤以及前列腺癌中的肿瘤起始细胞（TICs）^6,12。

本文详细描述了一种通过流式细胞术（FACS）从人源性肉瘤PDX模型中分离肿瘤起始细胞（TICs）的实验方案，该方法以HLA-1作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的TICs进行验证和表征。

方案

本文所讨论的小鼠实验的所有方案均符合机构指南，并已获得西奈山医学中心机构人类研究伦理委员会和动物护理与使用委员会的批准。

1. 肉瘤组织样本的处理及PDX模型的建立

1. 在机构审查委员会批准的方案下，由病理科工作人员从手术标本中获取肉瘤样本，并立即将每个样本置于冰上，放入100 mm培养皿中。
2. 将样本放入含有6 mL冷的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基（添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素）的15 mL聚苯乙烯圆锥形离心管中。立即处理组织样本。
3. （可选）仅针对骨肉瘤，执行以下步骤；软组织肉瘤可跳过这些步骤。
   1. 使用解剖刀将组织切成20 mm³大小的组织块。将组织块转移至含有3 mL胶原酶溶液（RPMI 1640加1 mg/mL胶原酶）的15 mL离心管中。
   2. 将离心管置于37 °C水浴中30分钟。
   3. 充分涡旋混匀后，加入3 mL含10% FBS的RPMI 1640培养基以中和胶原酶活性。
   4. 在室温下以350 × g离心5分钟。弃去上清液。
4. 在无菌生物安全柜中操作，将组织样本放入100 mm培养皿中。向组织中加入500 μL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）。使用无菌解剖刀将组织机械吹打成小块，直至无任何肉眼可见大于0.1 mm的组织块。
5. 将500 μL细胞悬液转移至35 μm细胞滤器中，并用50 mL聚苯乙烯离心管收集滤过液。将含有细胞悬液的50 mL聚苯乙烯离心管置于冰上。
6. 向组织中再加入500 μL PBS。第二次进行吹打，将悬液通过细胞滤器转移，并收集至同一50 mL离心管中。
7. 重复上述步骤（步骤1.5–1.6），直至组织完全解离，通常需6–8次。
8. 在室温下以350 × g离心10分钟，使细胞悬液沉淀。弃去上清液，用5 mL溶血缓冲液（0.15 M NH₄Cl、10 mM KHCO₃和0.1 mM EDTA）重悬沉淀，并在室温下孵育5分钟以去除红细胞。
9. 在室温下以350 × g离心5分钟，弃去溶血缓冲液。用5 mL PBS洗涤沉淀，再次以350 × g离心5分钟，弃去上清液。
10. 用1 mL PBS重悬沉淀，使用血细胞计数板或其它替代方法计数活细胞数量。将细胞稀释至最终浓度为200 μL PBS中含1 × 10⁷个细胞。将细胞悬液置于冰上保存。
11. 将基底膜基质置于冰上使其融化。将200 μL基底膜基质加入200 μL细胞悬液中。轻轻混匀后保持在冰上。
12. 将细胞悬液与基底膜基质（1:1）混合物皮下注射至两只NOD scid gamma（NSG）小鼠的侧 flank 部位。每次注射使用200 μL。
13. 每周检查两次小鼠注射部位，监测PDX（人源肿瘤异种移植）形成情况。当肿瘤直径达到1 cm时，取出移植瘤组织。

2. 通过FACS从PDX中分离肿瘤起始细胞

1. 按照先前所述方法，通过手术从小鼠体内取出PDX¹²。
2. 将肿瘤切成两半。其中一半异种移植组织用4%多聚甲醛固定过夜，用于组织学分析。另一半组织按照上述步骤（1.3–1.8）进行处理，以获得肿瘤细胞悬液。
3. 用PBS重悬细胞沉淀，并计数活细胞数量。
4. 将细胞悬液用含5% FBS的PBS稀释至浓度为2 × 10⁶ 个细胞/mL。将细胞悬液置于冰上30分钟。将细胞悬液分装至两个离心管中，分别标记为同型对照管和抗体管。记录每管中的细胞数量。
5. 用含5% FBS的PBS将HLA-1-PE抗体按1:250比例稀释，配制2×抗体工作液；同型对照抗体在相同条件下进行稀释。将“抗体”管中的细胞悬液与稀释后的抗体按1:1比例混合，使最终抗体稀释比例为1:500；将“同型对照”管中的细胞悬液与同型对照抗体按1:1比例混合。将两管细胞悬液置于冰上孵育90分钟。
6. 在4 °C条件下，以350 × g 离心5分钟，弃上清。加入10 mL PBS洗涤沉淀，重复洗涤两次。
7. 将4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）加入PBS中，使其终浓度为10 μg/mL。将该DAPI溶液加入细胞沉淀中，重悬成浓度为10⁷ 个细胞/mL的细胞悬液（依据步骤2.4中记录的细胞数进行调整）。
8. 将细胞悬液通过35 μm滤网帽过滤，收集至12 mm × 75 mm聚苯乙烯试管中。
9. 使用流式细胞仪分选HLA-1阴性的TIC亚群⁶。设门筛选活细胞（DAPI阴性），并将HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群分别收集至两个15 mL收集管中，每管预先加入4 mL RPMI 1640培养基。

3. 肿瘤起始细胞的表征

1. 肌球形成
   1. 使用α-MEM细胞培养基配制肌球生长培养基。加入补充剂，使其终浓度为B-27补充剂（1×）、N2补充剂（1×）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（20 ng/mL）、表皮生长因子（EGF）（20 ng/mL）以及青霉素/链霉素（100 IU/mL）。使用0.2 μm细胞培养滤器过滤培养基后使用。
   2. 将步骤2.9中分选得到的HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群离心成团，并计数各亚群的细胞数量。
   3. 将1.5 × 10⁶个细胞加入15 mL肌球生长培养基中，配制成细胞浓度为1 × 10⁵个细胞/mL的细胞悬液。
   4. 用新鲜的肌球生长培养基对细胞进行连续稀释，分别配制15 mL浓度为10⁴、10³和10²个细胞/mL的细胞悬液。然后准备四块96孔超低吸附细胞培养板，每块用于一种细胞稀释浓度。
   5. 从10⁵个细胞/mL的细胞悬液中取100 µL，加入第一块96孔超低吸附细胞培养板的每个孔中。该板每孔含有10⁴个细胞。
   6. 将另外三块96孔超低吸附细胞培养板分别用于其余三种细胞稀释浓度：10⁴、10³和10²个细胞/mL。向每块96孔超低吸附细胞培养板的每个孔中加入100 µL细胞悬液。这三块培养板每孔分别含有1,000个、100个和10个细胞。
   7. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。
   8. 每隔三天直接向培养基中添加新的bFGF和EGF（终浓度为20 ng/mL），不更换培养基，以避免悬浮培养过程中细胞丢失。
   9. 使用光学显微镜每天观察肌球形成情况，持续三周，如图2A所示。
   10. 三周后，分别统计HLA-1阴性和HLA-1阳性细胞在各稀释浓度下肌球阳性孔和肌球阴性孔的数量。
   11. 基于泊松概率分布¹³计算成球细胞频率。比较HLA-1阴性肿瘤起始细胞（TICs）与HLA-1阳性 bulk 细胞。
2. 连续稀释肿瘤形成实验
   1. 计数步骤2.9中获得的HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群细胞数量。
   2. 用PBS将细胞进行连续稀释，配制成浓度分别为10⁶、10⁵、10⁴和10³个细胞/mL的细胞悬液。每种稀释液取1 mL用于在10只小鼠中进行肿瘤形成实验。
   3. 将每种稀释液的1 mL细胞悬液与1 mL基底膜基质混合（1:1）。将每种2 mL混合液置于冰上保存。
   4. 使用25G注射器，将200 µL细胞与基底膜基质的混合液皮下注射至NGS小鼠的两侧 flank 部位，同一小鼠一侧注射HLA-1阴性细胞，另一侧注射HLA-1阳性细胞。每种稀释浓度使用10只小鼠。
   5. 根据肿瘤生长速度，监测小鼠体内肿瘤形成情况，持续四至八周。
   6. 根据不同接种细胞数量下的肿瘤形成比例，计算肿瘤起始细胞频率。比较HLA-1阴性TICs与HLA-1阳性 bulk 细胞。
3. 诱导向间充质谱系分化
   1. 取前期步骤（步骤3.1.9）中形成的肌球，转移至新的6孔板中。加入2.5 mL含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基，使细胞贴壁附着于培养板表面。
   2. 贴壁培养两天后，将培养基由含10% FBS的α-MEM更换为含10% FBS的α-MEM与人源间充质干细胞（hMSC）生长培养基的1:1混合液。
   3. 再培养两天后，更换为完全hMSC生长培养基。
   4. 当细胞融合度达到90%时，吸除hMSC培养基，加入分化诱导培养基。成骨分化时，加入成骨分化培养基（在hMSC生长培养基中添加10 nM地塞米松、5 mM β-甘油磷酸钠、50 µg/mL L-抗坏血酸和10 mM氯化锂）。脂肪分化时，加入脂肪细胞分化培养基（在hMSC生长培养基中添加0.5 µM地塞米松、0.5 µM异丁基甲基黄嘌呤和50 µM吲哚美辛）。
   5. 每三天更换一次分化培养基。
   6. 三至四周后终止分化，用PBS洗涤细胞，吸除PBS后加入2 mL 10%甲醛溶液进行固定，室温孵育45分钟。用去离子水洗涤细胞。细胞即可用于茜素红S染色（步骤3.3.6.1）或油红O染色（步骤3.3.6.2）。
      1. 为检测成骨分化，进行茜素红S染色。吸除去离子水，向细胞中加入2 mL茜素红S工作液（2%茜素红S，pH 6.0），室温染色5分钟。用去离子水洗涤细胞后，在显微镜下观察染色结果。
      2. 为检测脂肪分化，进行油红O染色。
         1. 配制油红O溶液。将300 mg油红O粉末溶于100 mL异丙醇中，配制储备液。
         2. 使用前2小时内，将三份（30 mL）油红O储备液与两份（20 mL）去离子水混合，室温静置10分钟。
         3. 使用前用滤器过滤工作液。
         4. 吸除步骤3.3.6中处理好的细胞表面的去离子水，加入2 mL 60%异丙醇覆盖单层细胞，室温孵育2分钟。
         5. 吸除异丙醇，加入2 mL油红O工作液，室温孵育5分钟。
         6. 用去离子水冲洗细胞，在光学显微镜下观察染色结果。

结果

建立并染色了一种人源肉瘤PDX模型。通过使用HLA-1抗体进行免疫组织化学染色，显示了肿瘤内的异质性。该异种移植瘤包含两个不同的亚群，即HLA-1阳性和阴性亚群（图1A）¹²。该肉瘤PDX在组织学上与原始原发性肿瘤具有相似性（图1A）。通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出肉瘤PDX的肿瘤起始细胞（TICs）。采用双轮分选方法，从亲本细胞群体中高度富集了HLA-1阴性细胞（图1B）¹²。

与HLA-1阳性细胞相比，分离得到的HLA-1阴性细胞中干细胞表达的基因（如 Oct4、Nanog 和 Myc）表达水平显著升高（图1C）。Sox-9 是一种发育相关基因，据报道在其他癌症干细胞（如乳腺癌）中发挥重要作用，该基因在HLA-1阴性细胞中特异性表达（图1D）。

为了验证分离得到的HLA-1阴性亚群，进行了肉瘤球形成实验，以检测这些细胞的自我更新能力。仅需初始接种10个HLA-1阴性细胞，即可形成细胞球（图1E）¹²。为了检测其成瘤能力，进行了系列稀释的成瘤实验。将相同数量的HLA-1阴性和HLA-1阳性细胞分别皮下注射至同一只小鼠的两侧。HLA-1阴性细胞表现出显著更高的成瘤能力（图1F）¹²，而由HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群形成的异种移植瘤均为细胞异质性肿瘤（图1H）。

我们对分离得到的HLA-1阴性肿瘤起始细胞（TICs）进行了基因表达分析¹²。与正常间充质细胞分化相关的基因在TICs中表达升高¹²。因此，我们进一步检测了HLA-1阴性TICs是否可被诱导发生终末分化，从而降低其成瘤能力。结果显示，HLA-1阴性细胞可在脂质生成和成骨生成通路中被诱导分化，并呈现强烈的油红O和茜素红S染色（图1G）。相比之下，在相同条件下，HLA-1阳性细胞无法发生分化。因此，这些结果提示了一种有前景的分化治疗策略，可用于靶向肉瘤TICs。

图1：从肿瘤内异质性肉瘤PDX模型中分离HLA-I阴性细胞。（A）通过免疫组织化学（IHC）方法在不同亚型的人类肉瘤中均发现HLA-I阴性细胞（箭头所示）。（a和b）透明细胞肉瘤。（c和d）多形性脂肪肉瘤。（e和f）平滑肌肉瘤。（g和h）恶性外周神经鞘膜瘤。（i和j）未另行说明的脂肪肉瘤。（k和l）去分化脂肪肉瘤。比例尺 = 100 µm。（B）肉瘤PDX模型在组织学上与其亲本肿瘤相似（苏木精和伊红[H&E]染色），并通过IHC显示HLA-I表达存在细胞异质性。图中展示了代表性肉瘤PDX模型图像，包括透明细胞肉瘤（CCS）、去分化软骨肉瘤（DCS）和去分化脂肪肉瘤（DDL）。比例尺 = 100 µm。（C）通过流式细胞术采用双次分选法分离出HLA-I阴性细胞亚群。从上至下分别为：第一次分选、第二次分选和纯度检测。分离得到的HLA-I阴性细胞与HLA-I阳性细胞随后用于进一步功能分析，包括肿瘤形成实验。本图结果来自先前发表的研究¹²。请点击此处查看本图的高清版本。

图 2：通过功能实验对 HLA-I 阴性肿瘤起始细胞（TICs）进行表征。（A）类球体形成实验显示，仅需 10 个 HLA-I 阴性细胞即可形成肉瘤类球体。左图：肉瘤类球体的代表性图像。右图：类球体形成频率；均值 ± 标准差（SD）。比例尺 = 100 µm。（B）从肉瘤患者来源异种移植模型（PDX）中分离出的 HLA-I 阴性细胞具有高度致瘤性。图中显示的是由去分化脂肪肉瘤（DDL）来源的 HLA-I 阴性和 HLA-I 阳性细胞所形成的肿瘤的代表性图像。将 1000 个 HLA-I 阴性 DDL 细胞和 HLA-I 阳性 DDL 细胞分别注射至同一只小鼠的两侧 flank 部位。（C）干细胞基因 Oct4、Nanog 和 Myc 的 mRNA 水平在 HLA-I 阴性细胞中高于 HLA-I 阳性细胞。数据表示均值 ± 标准差（n = 5）。（D）油红 O 和茜素红 S 染色呈强阳性，表明肉瘤 TICs 可诱导向脂质生成和成骨方向的终末分化。（E）由 HLA-I 阳性（左）和 HLA-I 阴性（右）亚群形成的 PDX 组织的 HLA-I 免疫组织化学染色。比例尺 = 100 µm。本图结果来自先前发表的研究¹²。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

有若干关键步骤限制了本方案从人源肉瘤PDX模型中分离和鉴定肿瘤起始细胞的成功率。人源肉瘤包含多种不同亚型。我们观察到PDX模型的建立在很大程度上依赖于肉瘤的亚型。具有组织学上未分化表型的临床侵袭性肉瘤（例如， 多形性未分化肉瘤 [成功率100%] n = 2]，去分化脂肪肉瘤[成功率100%， n = 2]，以及滑膜肉瘤[成功率100%， n = 3]）的PDX模型构建成功率较高。而具有分化表型的肉瘤（例如高分化脂肪肉瘤[成功率为0%]， n = 3]）的亚型表现出较低的PDX形成率。可能的原因是，在恶性程度较高的亚型中，肿瘤起始细胞所占比例高于恶性程度较低、分化较好的亚型。此外，我们建议在一天内完成肿瘤起始细胞的分离操作，中间不要中断，以尽量减少细胞活力的损失。

我们已发现HLA-1阴性细胞广泛存在于人类肉瘤中。但不同患者的样本之间，HLA-1阴性细胞的比例可能存在差异。通过该方法，我们已成功从HLA-1阴性细胞比例从低于0.5%到超过30%的样本中分离出肿瘤起始细胞¹²。重要的是，需通过成球实验和成瘤实验对HLA-1阴性细胞进行功能表征，以确认所分离的HLA-1阴性细胞具有肿瘤起始细胞特性。

然而，本文所述方案也存在局限性。既往数据显示，HLA-1 的表达受表观遗传调控，这与同一肿瘤内 HLA-1 表达存在细胞异质性的观察结果一致¹²。在肉瘤及其他癌症类型中已检测到 HLA-1 的基因组突变。HLA-1 基因的突变可能导致整个肿瘤细胞表面 HLA-1 完全缺失，或表达无功能的突变型 HLA-1。无论哪种情况，HLA-1 阴性均不能用于识别肿瘤内的肿瘤起始细胞（TICs）。

利用 HLA-1 作为阴性标志物，我们已成功从多种人类肉瘤亚型中分离出肿瘤起始细胞（TICs），并通过功能分析验证了结果。因此，我们能够对这些 TICs 进行包括基因表达分析在内的分子学研究，以开发靶向这些 TICs 的特异性治疗方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm细胞培养滤膜	赛默飞世尔科技	450-0020
100 mm 培养皿	Falcon	353003
15 mL 一次性离心管	Falcon	352196
35 μm细胞滤筛	Falcon	352340
50 mL 聚苯乙烯管	Falcon	352070
96孔超低吸附细胞培养板	康宁	7007
茜素红S	Sigma-Aldrich	A5533
B-27	Gibco	08-0085SA
bFGF	Invitrogen	PHG0021
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902
EGF	Invitrogen	PHG0311
HLA-1-PE 抗体	Abcam	ab43545
hMSC 生长培养基	ATCC	PCS-500-030
吲哚美辛	Sigma-Aldrich	I7378
异丁基甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292907
同型对照抗体	Abcam	ab103534
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A5960
氯化锂	Sigma-Aldrich	62476
Matrigel 基底膜基质	Corning	354230
MEM α	Gibco	12571-063
N2	Gibco	17502-048
NSG小鼠	杰克逊实验室	005557
油红O	Sigma-Aldrich	O0625
PBS	Corning	21-040-CM
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
带针头的注射器	BD	309626
β-甘油磷酸盐	Sigma-Aldrich	G9422