Method Article

化学共轭法在戊型肝炎病毒纳米粒子表面功能化中的应用

DOI:

10.3791/57020

⸱

May 11th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis

In This Article

Summary

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我们已将戊型肝炎病毒的衣壳蛋白作为 theranostic 纳米微粒 (HEVNP) 进行了设计。HEVNP 自组装成一个稳定的 icosahedral 笼在黏膜分娩。在这里, 我们描述了 HEVNPs 的改变的肿瘤靶向性的变异表面暴露残留到半胱氨酸, 共轭合成配体, 具体绑定肿瘤细胞。

Abstract

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病毒样粒子 (VLPs) 被用作 nanocarriers, 用于显示异物抗原和/或在各种疾病的检测和治疗中提供小分子。该应用依赖于基因修饰、自组装和半胱氨酸共轭来实现重组 VLPs 的肿瘤靶向应用. 与单基因修饰相比, 国外多肽对 VLPs 的化学共轭提供了一种很大的优势, 因为它允许多种实体, 如合成肽或寡糖, 以调制和灵活的方式共轭到 VLPs 表面, 而不改变 vip 组装。

在这里, 我们演示如何使用 E 型肝炎病毒纳米粒子 (HEVNP), 一个模块化的 theranostic 胶囊, 作为一个多功能运送载体。HEVNPs 的功能包括组织靶向、影像学和治疗性分娩。在 HEVNP 的结构研究基础上, 选取了结构上独立的和表面暴露的残留物作为 maleimide 连接化学基团的共轭点, 通过硫醇选择性的联系来选择半胱氨酸置换。一种特殊的半胱氨酸修饰 HEVNP (胱氨酸取代天门冬在 573 aa (HEVNP-573C)) 被共轭到乳腺癌细胞特异配体, LXY30 和标记为近红外线 (近红外) 荧光染料 (Cy5.5), 呈现肿瘤靶向HEVNPs 作为有效的诊断胶囊 (LXY30-HEVNP Cy5.5)。类似的工程策略可以与其他大分子复合物与众所周知的原子结构, 以探索潜在的应用 theranostic 交付。

Introduction

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在治疗和诊断分娩中纳米载体的发展, 被称为 nanotheranostics, 已经把大部分生物医学领域从广义治疗转移到目标传递1。靶向 nanotheranostic 交付将纳米载体 (纳米粒子) 与 theranostic 分子结合在一起, 稳定地直接 theranostic 分子到特定患病组织或生物化学途径2,3,4.纳米医学已经走到了目标交付的前列, 因为最佳尺寸的纳米粒子有能力稳定 theranostic 分子的循环, 有选择地靶向细胞表面分子呈现在患病的组织上。许多 nanotheranostic 平台仍然遭受被动细胞吸收, 前成熟退化, 毒性和与 theranostic 分子不充分的联系。VLPs 克服了目标交付中的许多障碍。它们被用作 nanocarriers 来显示外来的表位和/或提供小分子: 一种可以用来对抗许多疾病的方案1。该应用主要依赖于自组装的特性以及遗传修饰的方便性, 以满足给定 vip 的设计应用。与基因工程相比, 国外多肽对 vip 的化学共轭显示了一个重要的优势, 因为它允许多种实体, 如多肽或寡糖, 被共轭到 VLPs 的表面, 在调制和灵活的方式, 不改变贵宾大会。

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Protocol

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1. 昆虫细胞的 HEVNP 生产

注意: 所有以下步骤都应在单元格培养罩中执行。有关更详细的 HEVNP 生产过程11, 请参阅我们以前的出版物。

  1. 在昆虫细胞介质中培养 Sf9 细胞 (参见材料表), 以 50-75% 汇流在6井板上。
  2. 利用昆虫细胞转染试剂根据制造商的协议, 染 Bacmids 含有 HEVNP-573C ORF2 到 Sf99 细胞生产重组杆状病毒。根据细胞的生存能力, 在27摄氏度孵育转染细胞, 3-6 天。
  3. 在感染后 3-6 天收集上清液 (转染后的细胞因杆状病毒感染裂解) 为 P0 杆状病毒。
  4. 在25厘米2单层烧瓶中应用200µL P0 库存到 50-75% 汇合 Sf9 细胞之前, 移除培养基。每15分钟摇动烧瓶, 确保接种的全部覆盖。重复4次, 总共60分钟。
  5. 添加2毫升的昆虫细胞培养培养基到烧瓶, 并保持在27摄氏度 3-6 天, 取决于细胞的生存能力, 放大杆状病毒, 以更高的效价。
  6. 进行斑块化验以获得杆状病毒滴度阅读12。
  7. 培养悬浮的 Tn5 昆虫细胞 (材料表) 与100毫升昆虫细胞媒介在250毫升瓶并且在27°c ....

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Results

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类似于 HEV-VLPs, 所有胱氨酸改性 HEVNPs 形成可溶性 icosahedral 衣壳, 并没有聚集在溶液中的生产或纯化。在单步 maleimide-生物素共轭之前和之后, 每个胱氨酸修改后的 HEVNPs 在负染色 EM (图 2) 中都与混合动力 VLPs 不区分。Maleimide-生物素共轭效率胱氨酸改性 HEVNPs 首次测试与西方印迹通过化学发光链亲和素结合。继 maleimide-生物素共轭后, 胱氨酸修饰 HEVNPs 显示链亲和素绑定信号(图 2)。

有效的两步半胱氨酸共轭受共轭的顺序影响。由于α3β1整合素是抗原乳腺癌肿瘤细胞, 一个合成配体, LXY30, 与α3β110特定的亲和力, 被选为肿瘤靶向共轭分子。直接 maleimide (马伊) 功能化的.......

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Discussion

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与耗时的基因工程程序, 这通常需要几个星期, 在这里我们演示简单的两步和一步化学共轭程序, 可以在3天内完成, 增加癌症靶向配体和/或荧光检测染料到胱氨酸/赖氨酸 HEVNPs 的部位。该技术可用于筛选候选池中的最佳配体目标, 从而在合理的成本和交付时间内利用可用的肽/小分子合成服务。

不同于传统的基因工程, 它只能将多肽插入到感兴趣的蛋白质中, 化学共轭可以将各种材料 (包括肽、小化学分子和纳米粒子) 连接到表面上。蛋白质的兴趣, 只要有胱氨酸或赖氨酸残留物作为反应部位使用。如果在化学共轭部位没有这样的残留物, 简单的胱氨酸/赖氨酸置换可以在感兴趣的蛋白质上进行基因修饰, 使其在化学上激活, 如以前的研究4所示。

为了控制化学共轭只发生在选择性反应部位, 需要对共轭分子和蛋白质的结构进行深入研究, 以避免分子内反应。如本文所示的乳腺癌靶向肽 LXY3010, 临界二硫化键稳定循环配体构象。鉴于 maleimide 的硫醇反应性, .......

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Disclosures

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作者声明他们没有竞争的兴趣。

Acknowledgements

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提交人承认, 资助 RHC 由 NIH 赠款 # 的 AI095382, EB021230, CA198880, 国家粮食和农业研究所, 以及芬兰杰出的教授计划。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
迷你透析装置，10K MWCOThermo Fisher Scientific69572迷你透析装置
High Five CellsThermo Fisher ScientificB85502Tn5 细胞
SF9 细胞 Thermo Fisher Scientific11496015Sf9 细胞
Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统Thermo Fisher ScientificA11101， A11100杆状病毒表达系统
Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统Life Technologies10359-016， 10360-014， 10584-027， 10712-024杆粒
ESF921 昆虫细胞培养基表达系统 LLC96-001-01昆虫细胞培养基
Cy5.5 NHS 酯，5mgLumiprobe Corp27020Cy5.5 NHS 酯
Zeba 离心脱盐柱，40K MWCO，0.5 mLThermo Scientific87766离心脱盐柱
MES 水合物Sigma-Aldrich Chemical CoM8250-250GMES
超透明离心机 薄壁超离心管Beckman Coulter， Inc取决于转子超速离心管
NuPage 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶Thermo Fisher ScientificNPO321BOXSDS 蛋白凝胶
Cellfectin II 试剂Thermo Fisher Scientific10362100转染试剂
EMS 辉光放电显微镜 Science辉光放电器
器 电子

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10....

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Hepatitis E Virus NanoparticlesChemical ConjugationSurface FunctionalizationMaleimide BiotinLXY30 LigandCy5 5 Fluorescent TagClick ChemistryTEM ImagingConfocal MicroscopySpin Desalting Column

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