我们详细描述了以下操作步骤：1）利用磁性纳米颗粒高效构建用于慢病毒或逆转录病毒转导的肠道类器官；2）对经基因工程改造的类器官制备冷冻切片。该方法为高效调控类器官中的基因表达以研究其下游效应提供了有力工具。
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本文内容
摘要
摘要
肠道类器官培养为在体外研究肠道干细胞和隐窝生物学提供了独特的机会，尽管目前在类器官中调控基因表达的高效方法在此领域进展有限。虽然CRISPR/Cas9技术能够对用于类器官生成的细胞进行精确的基因组编辑，但该策略需要通过测序分析进行大量筛选和鉴定，耗时且成本高昂。本文提供了一种高效的病毒转导肠道类器官的详细实验方案。该方法快速且效率高，显著降低了CRISPR/Cas9技术所固有的时间和经济成本。我们还介绍了一种从完整类器官培养物制备冷冻切片的方案，可用于后续的免疫组织化学或免疫荧光染色分析，以验证基因表达或沉默效果。在成功实现病毒载体介导的基因表达或沉默后，可快速评估肠道干细胞和隐窝功能。尽管大多数类器官研究采用体外检测方法，但类器官也可移植至小鼠体内进行体内功能分析。此外，我们的方法在预测药物治疗反应方面具有优势，因为目前可用的治疗方法通常通过调控基因表达或蛋白质功能发挥作用，而非改变基因组。
引言
将小鼠或人类小肠和结肠隐窝细胞在体外长期培养为三维（3D）类器官的能力是一项重大突破，因为这些培养物能够再现体内肠上皮的关键特征1,2,3。源自原代隐窝的类器官具有自我更新和自我组织的能力，表现出与其来源组织相似的细胞功能。事实上，类器官不仅重现了体内隐窝的结构组织，还保留了多种分子特征，因此为研究正常生理机制和疾病状态提供了有力的工具。例如，类器官研究已揭示了参与组织再生的新分子通路1,2,3,4,5，以及在病理条件下可能增强功能的药物靶点6,7。
肠道干细胞的研究备受关注，因为肠上皮是哺乳动物体内再生能力最强的组织之一，每3-5天即可自我更新一次，从而保护机体免受肠道腔内细菌、毒素及其他病原体的侵害。肠道干细胞（ISCs）正是介导这种强大再生能力的关....
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方案
本实验方案已获约翰斯·霍普金斯医学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本方案改编自先前发表的方法10,11,12,13。
1. 试剂的准备
- 提前数小时配制新鲜的293T培养基，并在使用前于水浴中加热至37 °C，至少预热10分钟（表1）。
- 准备用于病毒包装的质粒DNA2,13,14（表2）。
- 准备所有其他所需材料（材料表）。
2. 慢病毒或逆转录病毒颗粒的制备
- 人胚胎肾（HEK）293T 细胞接种 （第 1 天）
- 用含 50 µg/mL 多聚-L-赖氨酸的磷酸盐缓冲液（PBS；每皿 1....
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结果
本文介绍了一种快速且高效的转导技术，该技术利用暴露于磁场中的磁性纳米颗粒将慢病毒递送至目标细胞。借助 readily available 工具，我们不仅将该方法应用于新分离的隐窝细胞的转导（图1A），还成功用于类器官（图2）以及其他对常规转导方法不敏感的细胞类型。慢病毒颗粒可轻松与磁性纳米颗粒偶联，通过使用磁板施加磁场，病毒-纳米颗粒复合物能够被高效递送至细胞。为优化该方法，我们首先测试了携带 GFP 的慢病毒载体，以便通过荧光显微镜观察 GFP 表达来识别被转导的细胞。在类器官发育的各个阶段均可观察到 GFP 信号，包括早期隐窝细胞形成囊状结构时（图4A），以及后期类器官出芽阶段（图4B）。成功转导的肠类器官可进一步进行功能分析，通过染色细胞膜和细胞核以计数总细胞数，并结合谱系标记物（如溶菌酶用于鉴定潘氏细胞）分析发育过程中的变化（<.......
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讨论
成年肠道上皮组织的类器官原代培养为研究干细胞功能、肠道上皮稳态及病理过程中的分子机制提供了一种强有力的工具1,2,3,4。尽管CRISPR/Cas9技术可用于对类器官进行基因工程改造9，但其应用受限于必须通过测序分析对目标遗传改变进行大量筛选和筛选。本实验方案的目标是提供清晰简明的操作步骤，并辅以基于视频的教程，介绍利用磁性纳米颗粒将慢病毒或逆转录病毒递送至肠道类器官，随后进行冷冻切片以供进一步分析的方法。
本方案是一种快速高效的方法，用于对肠道类器官进行基因工程改造，并分析从冷冻切片中基因过表达或沉默的影响。图2和图3概述了关键步骤。该策略可用于研究在三维培养条.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（R01DK102943、R03CA182679、R03CA191621）、马里兰干细胞研究基金（2015-MSCRFE-1759、2017-MSCRFD-3934）、美国肺脏协会、阿勒格尼健康网络-约翰斯·霍普金斯研究基金以及霍普金斯消化系统疾病基础研究核心中心的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | 293T 细胞的基础培养基 |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | 类器官培养基和类器官消化缓冲液的基础培养基 |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | 病毒质粒转染培养基 |
| 胎牛血清 | Corning | 35-011-CV | 病毒收集培养基和 293T 培养基的组分 |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 类器官培养基和隐窝解离缓冲液的组分 |
| PBS（不含 Ca2+、Mg2+） | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 洗涤缓冲液及隐窝解离缓冲液的组分 |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | 类器官培养基的组分 |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | 类器官培养基的组分 |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 类器官培养基的组分 |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | 类器官培养基的组分 |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | 类器官培养基的组分 |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | 类器官培养基的组分 |
| 人重组胰岛素 | Millipore Sigma | I9278-5ml | 类器官培养基的组分 |
| 烟酰胺 | Millipore Sigma | N3376-100G | 转导培养基的组分 |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | 转导培养基的组分 |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | 转导培养基的组分 |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 隐窝解离缓冲液的组分 |
| DTT（二硫苏糖醇） | Thermo Fisher Scientific | R0861 | 隐窝解离缓冲液的组分 |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | 类器官消化缓冲液的组分 |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | 类器官消化缓冲液的组分 |
| Matrigel（生长因子减少型） | Corning | 356231 | 用于包埋类器官的基质 |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | 病毒生产中用于转染的培养基 |
| ViralMag R/L | Oz Biosciences | RL40200 | 病毒转导用磁性颗粒 |
| 磁力板 | Oz Biosciences | MF10000 | 促进病毒转导的磁力板 |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | 病毒生产中的转染试剂 |
| 多聚-D-赖氨酸 | Millipore Sigma | A-003-E | 接种 293T 细胞前对培养板的包被处理 |
| 4% 甲醛溶液 | Boster | AR1068 | 用于固定类器官的溶液 |
| O.C.T. 包埋剂 | Thermo Fisher Scientific | 4583S | 用于类器官的包埋 |
| 5 mL Falcon 聚苯乙烯管 | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon 管 | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II 摇床 | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus 倒置显微镜 CK30 | Olympus | CK30 | 用于扫描和计数隐窝 |
| Zeiss Axiovert 200 倒置荧光显微镜 | Nikon | Axiovert 200 | 用于观察隐窝中的荧光 |
| Amicon Ultra-15 离心过滤装置（含 Ultracel-100 膜） | Millipore Sigma | UFC910024 | 用于浓缩病毒 |
| pluriStrainer 20 µm（细胞筛） | pluriSelect | SKU 43-50020 | 用于制备类器官片段 |
| Falcon 细胞筛 | Fisher Scientific | 352340 | 用于隐窝分离后制备大小均一的隐窝 |
| Greiner CELLSTAR 多孔培养板 48 孔（带盖，组织培养处理） | Millipore Sigma | M8937-100EA | 用于 D2:D37+D16:D37g 类器官片段 |
| 动物品系：C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | 用于类器官培养 |
参考文献
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment an....
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