鉴于3R原则，作为动物实验替代方案的呼吸系统模型正在不断发展。特别是对于呼吸性物质的风险评估，目前尚缺乏合适的检测方法。本文介绍了利用人源性精准切割肺组织切片评估空气传播物质的方法。
方法文章
人源肺组织精准切割切片中物质细胞毒性和免疫调节效应的评估
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
呼吸系统疾病种类繁多，需要合适的模型系统来理解其潜在机制，并推动新疗法的开发。此外，新物质的注册需要通过适当的测试系统进行充分的风险评估，以避免个体在工作环境等场景中受到伤害。此类风险评估通常通过动物实验进行。鉴于“3R原则”以及公众对动物实验的质疑，人类替代方法（如精准切割肺组织片，PCLS）正在不断发展。本文介绍了一种用于研究小分子物质（如六氯铂酸铵，HClPt）免疫调节潜力的人源PCLS离体（ex vivo）技术。检测指标包括组织活性以及以细胞因子和趋化因子分泌改变为标志的局部呼吸道炎症反应。在暴露于亚毒性浓度的HClPt后，人源PCLS中促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1α（IL-1α）水平显著升高。尽管PCLS技术在过去几十年中已得到显著优化，但其在免疫调节测试中的应用仍处于发展阶段。因此，尽管本文结果展示了人源PCLS作为呼吸系统研究有力工具的潜力，但这些结果仍属初步。
引言
过敏性哮喘、职业性哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺气肿以及上下呼吸道感染等呼吸系统疾病的发病率不断上升，已成为全球性的健康负担1,2合适的测试系统对于揭示这些疾病背后的一些基本机制，以及相关物质的开发与测试至关重要。基础研究和临床前药物开发均以这些研究获得的结果为重点。 体外 或 体内 检测方法。然而，这些检测方法存在其局限性3首先， 体外 实验采用从邻近组织或器官中分离并移除的人类细胞，因此这些细胞无法再与其他细胞相互作用或受到其保护3其次，由于生理学差异和生物化学上的分歧，动物模型往往难以转化为人类应用4为了尽量减少这些局限性，并遵循“3R原则”（替代、优化、减少）5新的替代模型正在不断演变。
类器官等替代性人类三维组织模型（如PCLS）是连接基于人类的体外（in vitro）模型与复杂的动物体内（in vivo）模型之间的桥梁。PCLS能够反映呼吸道中所有相关细胞类型的生理异质性6。此外，PCLS技术具有可重复制备的优点，即从单个动物或人类组织供体中可获得多个厚度精确的薄片，从而可设置内部对照，并用于测试不同浓度或不同药物。
自1994年Fisher首次引入琼脂灌注的人肺组织切片以来 等7 肺组织切片与培养技术已得到显著改进。Christian Martin 等 已改进该技术以拓展其在化学和药理学领域的应用8我们课题组于2007年经Christian Martin介绍接触到该技术。此后，PCLS在研究中的应用范围已从检测功能反应（如气道）等方面逐步拓展9,10 和血管收缩11，到免疫学、药理学12,13，以及毒理学的7 在多个实验室对不同物种进行测试。例如，Schlepütz 等14 研究了不同物种在气道反应上的差异，并比较了小鼠、大鼠、豚鼠、绵羊、狨猴和人类中通过电场刺激（EFS）或辣椒素诱导的外周神经元激活。他们发现各物种在神经介导的支气管收缩方面具有不同且特异的模式，得出结论认为常用实验动物（小鼠和大鼠）并不总能反映人类的反应。对于肺毒性测试以及在此背景下减少动物使用数量，Hess 等15 经预验证的大鼠PCLS作为一种 离体 吸入毒性研究的替代方法。这项多中心预验证研究利用PCLS开发了两种预测模型，结果令人鼓舞。
此外，在基础研究中，PCLS 已被用于阐明钙信号传导16、早期过敏反应17以及病毒感染反应18,19。技术进步正在持续进行，更多改进也正在探索中。例如，该领域正通过冷冻保存和重复利用组织来提高人体组织的使用价值。Rosner et al. 描述了一种冻融小鼠 PCLS 的技术，该技术可保留气道在受到刺激时的收缩能力，从而延长组织保持活性的有限时间窗口，使得对同一供体的组织可在不同时间点进行更多的检测20。除了这些研究进展外，Lauenstein et al.21 最近还利用人源 PCLS 研究了多种可能引起职业性哮喘的潜在致敏化学品的风险评估。
职业性哮喘的症状表现为气流阻塞和气道高反应性，与过敏性哮喘相似，是由工作环境中暴露于高分子量（HMW）22或低分子量（LMW）物质23（例如，铂化合物）所诱发的。低分子量致敏物在形成半抗原并与载体蛋白结合时具有较高的致敏潜力21。对于新注册的高分子量或低分子量化学品，需要进行体外（in vitro）和体内（in vivo）风险评估，以判断其潜在的致敏性（例如，OECD 指南 429）24。然而，目前用于评估潜在致敏性的检测方法最初并非为呼吸道致敏物的风险评估而设计，而是针对接触性致敏物开发的，尽管对少数物质可能存在一定程度的一致性25。Lauenstein 等的研究是欧盟项目Sens-it-iv的一部分，旨在为潜在接触性或肺部致敏物的风险评估开发替代性测试策略21。在本项目中，我们重点关注评估人肺切片（PCLS）作为替代性测试工具的可用性。因此，我们选择了一系列免疫调节终点指标（例如，细胞活力和细胞因子分泌），用于测定化学品（如低分子量铂化合物）的刺激性或炎症潜力。Lauenstein 等并未发现适用于所有呼吸道致敏物的普遍规律；但他们的研究为近期发布的实验方案奠定了基础26。
综上所述，本文所述的人肺组织切片（PCLS）制备及其后续暴露的实验方案，为评估可能参与呼吸系统疾病（如职业性哮喘）发生发展的潜在肺毒性物质和/或免疫调节物质提供了一种有效的方法。
方案
使用人肺组织切片（PCLS）的实验必须按照 《世界医学协会道德规范》 并经当地伦理委员会批准（本文所示的典型PCLS实验已获汉诺威医学院当地伦理委员会批准；编号2701-2015）。所有供体患者或其直系亲属须签署关于使用人肺组织材料的书面知情同意书。本研究中描述的结果所使用的组织切片来自不同年龄、性别、病史及切除原因的供体，但所获组织主要来自肺癌患者。实验仅使用无肿瘤的组织。
1. 人肺组织精准切片的常规制备及后续化学物质暴露
注意：填充一个肺需要两人操作。建议操作人员具备最新的甲型和乙型肝炎疫苗接种记录。患者在肺移植前会常规接受丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）的筛查。若诊断或怀疑存在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的活动性感染，则应弃用该肺。然而，所有新鲜的人肺组织及其衍生样本均须视为可能具有传染性，并须采取相应的防护措施（如颗粒物过滤口罩（FFP2）、护目镜、手套），以确保工作人员的职业安全。该操作过程耗时60至90分钟。
- 确认人肺叶的完整性。
注意：胸膜破裂会导致组织充填不均匀。本方案所用的人肺组织必须为手术切除当天获取。在冰上进行琼脂糖充填前，组织于室温（RT）下保存约2小时是可接受的。本方案使用的组织来源于接受肺切除术的患者，而非来自已故捐献者。若组织曾保存于冰上，充填前需先预热至室温，否则琼脂糖会立即聚合，无法实现均匀充填。
注意：所有接触人源组织的人员必须穿戴防护服，包括实验服、两副手套、帽子、口罩和一副护目镜。人源组织可能具有感染性。 - 称取7.5 g低熔点琼脂糖，加入250 mL重蒸水中。将琼脂糖在微波炉中加热至完全溶解。冷却至约40 °C，具体取决于琼脂糖的熔点和凝胶化点。
注意：根据肺叶大小，需要若干个烧瓶。 - 预热并保持培养基（材料表) 在 37 °C.
注意：如果琼脂糖温度过高，培养基中的维生素将失活，细胞也会受损。若培养基/琼脂糖溶液的温度低于37 °C时，凝胶过程将开始，影响肺组织的均匀灌注。仅在37℃的温度范围内 °C 到 39 °建议使用 C。 - 开始操作前将所有所需材料置于触手可及的位置：5 - 10 个夹子、长约 1 m 的柔性导管、合适的注射器（例如，50 mL）以适配导管连接，以及装有冰块的冰盒。
- 通过插入硅胶管至气管/主支气管进行插管，并使用与硅胶管平行放置的夹子固定，使夹子沿硅胶管方向压紧组织，但不夹闭硅胶管。确认硅胶管已牢固固定于内部，在灌注过程中不会滑脱。使用夹子封闭所有其他支气管、血管及损伤部位，防止灌注过程中琼脂糖泄漏。
- 在烧杯中将等体积的3%低凝胶琼脂糖与培养基混合。使用50 mL注射器将混合液注入肺组织。在重新向注射器中添加培养基前，用手指或止血夹夹闭导管，以避免产生气泡和琼脂糖反流。充填肺叶直至完全膨胀。轻轻触碰肺脏一侧的胸膜，胸膜应平整且坚实。
注意：根据肺叶的大小，可能需要多达2至3升的琼脂糖/培养基溶液。 - 若单个标本中包含多个支气管，则对每个支气管重复步骤 1.5 - 1.6。
- 将肺置于冰上，使灌注的琼脂糖凝胶化，时间根据琼脂糖用量而定，为20–40分钟。从多个位置轻轻触碰胸膜，检查其是否变硬且冰凉，若如此则表明聚合已完成；否则需继续等待。由病理学家将肺组织切成片状，取样后将肺组织材料置于冰上保存，用于运输。
- 用锋利的刀片将人肺组织切成 3 - 5 cm 的组织块。
注意：每次使用新的刀片切割肺组织，以确保锋利度。 - 将400 mL冰冷的Earle's平衡盐溶液（EBSS）加入组织切片机中。立即使用半自动螺丝刀配合所需直径的取芯工具，从肺组织块中切取圆柱形组织芯。例如，8 mm；10 mm
注意：此直径必须与机器内组织固定装置的直径相同。 - 将肺组织切片的厚度调整至所需的厚度值。
注意：厚度约为 250 µm 常用于 PCLS 实验中。组织切片机制造商建议使用其组织切片厚度规来验证切片厚度。或者，也可采用整体染色结合共聚焦显微镜的方法测定切片厚度，具体方法如 Brismar 所述。 等27 - 将组织芯转移至组织切片机的组织架中。将重物（组织架的部件）置于组织芯上方。将组织切片机的臂速和刀速均设置为6。开始将组织芯切割成精密切片肺组织（PCLS）。
- 将500 mL市售的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）：营养混合物F-12 DMEM/F12（1:1）补充5 mL青霉素（10,000单位/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）。将培养基在无菌条件下于冰箱中保存数天。仅预热所需体积的培养基。
注意：青霉素在37℃下保存时会失活 °C 条件下培养更长时间。使用无血清且无染料的培养基，因为血清成分在不同批次间存在差异，而染料（如酚红）可能干扰检测。 - 将25 mL冰冻培养基加入一个培养皿（100 × 15 mm）中。通过打开玻璃圆筒上的夹子，将组织切片机中的培养基排入烧杯。使用涂布棒将切片从烧杯转移至含有培养基的培养皿中例如，接种环）。将培养皿放入培养箱（37 °℃, 5% CO₂2，100% 湿度）。在洗涤步骤前使培养基预热。
注意：所有后续步骤均在无菌条件下进行。 - 将细胞筛置于培养皿中用于清洗PCLS。使用10 mL移液管通过细胞筛完全移除培养基，并加入25 mL 37 °C 预热的新鲜培养基。每30分钟重复此步骤3至4次。
注意：细胞滤网可防止切片被吸入移液器中，从而避免切片受损。 - 将肺组织切片小心转移至24孔培养板中，每孔加入不少于500 µ每孔两片肺组织，加入 L 培养基。将肺组织暴露于待测物质中（见步骤 3.1 - 3.4）。 例如，37℃孵育24小时 °C，5% CO₂2.
注意：转移时最好使用接种环，让组织切片自然漂浮到环上，以防止组织损伤。无需进一步分离切片，因为只有新鲜培养基供应不足才会导致组织切片中的细胞死亡。切片在孔中可以相互重叠或接触，这不会影响组织的活性。 - 将所有剩余的人体组织放入装有固定剂的塑料烧瓶中（例如，10% 缓冲甲醛）至少固定 24 小时，并在处理过程中焚烧。
注意：甲醛具有毒性，应在通风橱中进行此步骤。
2. PCLS的组织学分析
- 用浸有固定液的两块泡沫垫准备好活检盒（例如，4% 缓冲甲醛）。将 PCLS 置于活检盒中的泡沫垫之间，并立即将组织转移至固定液中。在 4% 缓冲甲醛中固定组织过夜。
- 按照标准组织病理学方案，将组织经乙醇（70%、90%、100%、100%、100%、100%）逐级脱水，每级1小时，随后用二甲苯洗涤（3次，每次1小时），再用液体石蜡处理（3次，每次1小时），进行石蜡包埋。
- 将PCLS转移至包埋模具中，使用接种环操作。将PCLS组织包埋于液态石蜡中。在包埋石蜡块时，确保组织在模具中分布均匀。
- 用旋转式切片机将含有PCLS的组织块切至表面平整均匀。随后切取所需厚度的连续切片（例如., 4 µm），将其逐一放置于连续编号的包被玻片上（通常可制备25至30个切片），直至完成整个PCLS的切片处理。
- 对单个玻璃载玻片（每8-10个切片）进行苏木精-伊红染色（H&E) 进行定位。根据定位切片选择用于实验的切片区域（通常前8个和后8个切片不完整）。
注意：（可选）如需长期保存，可将载玻片浸入液体石蜡中以进行保存。
3. 物质溶液的制备
注意：工作溶液和对照品需在使用前立即配制。
注意：应根据安全说明操作物质；若安全信息未知，则视为可能有害物质，并遵循常规安全预防措施。
- 将水溶性物质直接溶解于培养基中。对于不溶或难溶的化学物质，应根据其溶解性，先将其溶解于适当的溶剂中。水溶性有限（<0.1 mg/mL）的物质可例如溶解于DMSO或乙醇中。非毒性溶剂浓度应事先通过滴定确定。确保物质在稀释至培养基后不会析出沉淀。
注：HClPt和月桂醇聚醚硫酸钠（SLS）溶液已配制。 - 在培养基或溶剂中配制浓度为所需最高浓度100倍的物质储备液。称取12.5 mg HClPt和34.4 mg SLS，并将这些化学品溶于1 mL培养基中以制备储备液。
注：这些化学品无需使用溶剂。 - 用预热的培养基进行1:100的最终稀释。若此前使用了溶剂，此方法可确保所有物质浓度下的最终溶剂浓度一致。
- 使用最终溶剂浓度（例如，如步骤3.3所述的1%）对PCLS进行对照处理。结果部分提及的化学品无需设置溶剂对照。
4. 细胞毒性检测的阳性和阴性对照
- 进行所有活力检测时，需准备以下阳性和阴性对照：
- 组织对照：将PCLS仅在培养基中孵育，作为未处理PCLS的参照，于细胞培养条件下（37 °C、5% CO2、100%湿度）孵育24小时。
- 溶剂对照（如需要）：将PCLS与最终溶剂浓度共同孵育，作为仅用溶剂处理的PCLS参照（见步骤3.4），于细胞培养条件下（37 °C、5% CO2、100%湿度）孵育24小时。
- 阳性对照：将PCLS在缓冲液中与1%去垢剂于4 °C孵育1小时。
注：若PCLS变为无色，则表明组织已死亡。上清液中总L-乳酸脱氢酶（LDH）的吸光度约为1.9 - 2.3（见步骤6.1 - 6.4）。该组织用于WST-1检测（见步骤5.1 - 5.5），其吸光度约为0。
5. 通过WST-1法测定化学物诱导的人源PCLS细胞毒性
注意：WST-1 检测在24孔板中进行，每孔放置两个PCLS。建议每个参数设置重复孔，并在检测后合并这些重复孔的结果。
- 在开始前立即用培养基稀释WST-1试剂，配制工作液。每孔所需工作液体积为24孔板每孔250 µL。因此，每孔取25 µL试剂与225 µL培养基混合。
- 完成步骤1.16中PCLS的孵育后，弃去或收集上清液用于细胞因子检测或其他检测（如LDH检测）。剩余组织用于下一步操作。
- 每孔加入250 µL WST-1工作液，将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。确保孵育期间PCLS完全被WST-1试剂覆盖。
- 将培养板置于轨道摇床上（200 rpm），轻轻振荡30秒，以确保WST-1试剂充分混匀。取一个新的平底96孔板，从24孔板各孔的上清液中分别吸取100 µL，每样本设两个复孔。
- 使用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度（参考波长：630 nm），并用450 nm吸光度减去630 nm吸光度。这些数值将用于步骤5.6的计算。
注意：仅当组织具有活性时，才能获得可靠的细胞毒性评估数据。因此，每次实验均应满足Hess et al.15公布的这些可接受标准。若未达到标准，应重复实验。 - 未处理的培养基对照组吸光度应高于0.6，否则应重复实验。若数据满足该要求，则将组织对照组的吸光度设为100%，并据此计算处理样本相对于组织对照组的WST-1还原率。
6. 乳酸脱氢酶（LDH）检测
注意：乳酸脱氢酶（LDH）检测在孵育后阶段结束时进行，总体积为100 µL培养上清液，使用96孔板。
- 在将PCLS与测试试剂共同孵育或不孵育后，取50 µ取步骤1.16中的上清液L，分装至新的96孔板中，每份设两个复孔。由此可使24孔板中每个处理孔均产生两个复孔。
- 在检测前立即配制LDH试剂的工作液。工作液由制造商提供的催化剂溶液（将冻干粉溶于1 mL双蒸水中）和染料溶液组成。对于一块96孔板，充分混合125 µL 催化剂溶液与 6.25 mL 染料溶液混合。
注意：请勿将溶液暴露于直射光下。 - 移液50 µ工作溶液 50 微升加入已含有 50 微升的各孔中 µ加入上清液至终体积为 L，于室温避光孵育 20 分钟。无需进一步混匀。
- 使用酶标仪在492 nm波长处测定各孔的吸光度（参考波长：630 nm）。从492 nm吸光度值中减去630 nm吸光度值。这些数值将用于步骤6.5的计算。
注意：仅从存活的组织中才能获得用于评估细胞毒性的可靠数据。经去污剂处理的对照组吸光度应高于1。 - 分析时，将步骤4.1中阳性对照的吸光值设为100%，并据此计算处理样本相对于阳性对照的乳酸脱氢酶（LDH）释放量（即最大LDH释放量）
7. 使用共聚焦激光扫描显微镜（cLSM）进行显微存活率检测
注意：对于显微镜下的活力检测，将两个正常的250 µm厚PCLS样本置于24孔板中，每孔加入250 µL染色液。由于每个切片均单独成像，无需进一步设置重复样本。
- 将PCLS与测试物质共同孵育后（无论是否添加测试物质），弃去上清液，或将其用于细胞因子检测或其他检测（如LDH检测）。剩余组织用于本方案所述步骤。
- 用4 μM的工作浓度，将钙黄绿素-AM（calcein-AM）和乙啶同源二聚体1（EthD-1）配制成工作液 µM，加入1 µL 的钙黄绿素-AM（4 mM）和 2 µL 的 EthD-1（2 mM）加入至 997 µL 培养基。此体积用于染色4个孔，每孔含2个PCLS。
注意：避免试剂接触直射光。 - 移液250 µ每孔加入工作稀释液1 mL，将24孔板置于室温避光孵育45分钟。孵育期间将板置于150 rpm的水平摇床，以确保组织与染色液充分接触。
- 孵育45分钟后，弃去染色液，加入1 mL缓冲液，在室温避光条件下以150 rpm振荡洗涤3–5分钟。重复此步骤两次。
- 加入500 µ向每孔含有染色后PCLS的缓冲液中加入L，以避免培养基产生自发荧光。进行显微镜观察时，使用共聚焦激光扫描显微镜（cLSM）至少采集两个随机分布的z轴层扫图像。
- 单击“Ocular”选项卡，选择10X/0.3物镜，并单击“Online”以将共聚焦激光扫描显微镜（cLSM）用作标准光学显微镜，从而定位PCLS的表面。单击“Offline”退出目镜设置。
- 单击采集选项卡，开启对应荧光染料的激光器。
注意：我们使用波长为488 nm的氩离子激光器检测带负电的染料钙黄绿素（激发波长495 nm），使用波长为543 nm的氦氖激光器检测EthD-1/DNA复合物（激发波长533 nm）。通常，氩离子激光器的工作电流应设置为最大电流的30%–50%，以实现约5.7 A的管电流，这可显著延长激光器的使用寿命。 - 点击 光路 在……的条件下 获取 选项卡并为实验设置必要的滤光片和反射镜。
注意：在本研究中，使用了基于滤光片的系统，配备一个主分色镜（例如．，HFT 488/543）分离激发光和发射光。通过反射镜，该光线被引导至二级二向色分光镜（例如，NFT 545）将样品发射的光进一步分为两个通道。 - 设置带通滤波器（例如，钙黄绿素信号使用505-530 nm带通滤光片，EthD-1/DNA复合物信号使用560-615 nm带通滤光片，仅允许特定波长范围通过，并将钙黄绿素信号分配至通道2，EthD-1/DNA复合物信号分配至通道3。
- 勾选Z-Stacks选项以设置显微镜成像体积的上下限。点击Live按钮，在屏幕上实时查看相应层面的图像。上下调节焦距，找到PCLS表面信号清晰的焦平面。
- 单击“通道”子部分并选中复选框 显示全部按下实时图像下方相应通道的按钮以锁定该通道，并激活通道颜色。
注意：活体图像中的蓝色表示无信号，高信号显示为白色，过曝信号显示为红色。 - 将红色EthD-1通道的针孔设为1个艾里单位，以在光收集效率和光学切片效果之间取得最佳平衡，并相应调整钙黄绿素通道。增加增益以提高检测信号，使其在激活通道颜色锁定表的活体图像中呈现白色而非红色。
注意：总增益不应超过600单位。 - 增加或减少数字偏移，以调整背景，使其在激活通道颜色锁定表的实时图像中呈现蓝色。
- 在多维采集下点击Z轴层叠（Z-Stack）选项卡，并使用对焦功能切换至感兴趣的Z层面。按下 设置第一步 以保存此位置供后续采集。缓慢上下调节焦距，直至达到30的范围 µm 已达到并按压 设置最后 保存。
- 点击 活体 再次点击以停用实时图像并按下 开始实验 开始成像。
注：通过阴离子染料钙黄绿素的荧光检测活体组织；死细胞则通过EthD-1与核酸形成的复合物加以区分。
8. 图像渲染
注意：必须考虑图像渲染软件对计算机的配置要求，因为该程序需要相应的硬件支持。
- 将从PCLS显微活力染色（见第7节）获得的LSM文件载入图像渲染软件中。在继续操作前，先将其保存为.ims文件。所有参数均需基于组织对照进行设置，并应用于所有图像，此后不得再做任何更改。
- 使用“Volume”按钮对活体组织（钙黄绿素染色）进行表面重建（补充图1A），使用“Spots”按钮识别死细胞核（补充图1H）。在渲染某一通道时，应在显示调节窗口中关闭另一通道。
- 首先开始渲染活体组织体积：设置表面所在通道，处理整幅图像，将平滑因子设为0.5 µm，并使用绝对强度进行阈值设定（补充图1B, C）。点击蓝色前进箭头。
- 调整重建体积的绝对强度阈值，应扣除噪声和背景信号。表面叠加显示为灰色，需检查表面覆盖的准确性（补充图1D）。完成调整后，点击蓝色前进箭头。此步骤通常用于计算参数设置。若软件无法计算体积，可适当提高平滑因子。
- 最后一步选择滤波器。使用球形度滤波器（直径约10 µm）进行表面渲染，以滤除肺泡腔内的巨噬细胞（补充图1E）。点击绿色前进按钮。
- 对输出图像进行视觉优化，并将统计结果导出为.xls文件。总组织体积（总和）将用于后续分析（补充图1F, G）。保存当前设置，并在同一天使用相同共聚焦激光扫描显微镜（cLSM）参数获取的所有z-stack图像分析中沿用该设置（补充图1I）。
- 对红色通道（点状信号）进行死细胞核的重建。在surpass窗口中随机测量点的大小（以µm为单位），点的直径约为5 µm。勾选“Enable”并设定点的大小。检查是否所有点均被标记，且每个点仅被计数一次。如有需要，手动修正（补充图1B, H, J）。点击蓝色前进箭头。
- 点击绿色前进按钮，使程序根据设定参数计算/计数总点数，并将结果导出为.xls文件（补充图1K, L, M）。在对图像进行图形化或统计分析时，应将计算得到的死细胞核数量与活体组织体积的比值作为分析指标。
9. 人肺组织切片中细胞因子和趋化因子的测定
注意：细胞因子和趋化因子的免疫反应可在孵育后从培养上清液中测定细胞外水平，或从组织裂解液中测定细胞内水平。ELISA 在96孔板中进行，每孔100 µL，设两个复孔。
- 通过将5 mL去垢剂与495 mL缓冲液混合，配制1%的去垢剂溶液。该溶液可在室温下保存数月。
- 将1%的去垢剂溶液与蛋白酶抑制剂（PI）按1:500的比例混合。所需体积取决于培养板的规格；例如，使用500 µ每24孔板每孔加入L。对于一孔，混合1 µL of PI 与 499 µL 的洗涤剂溶液。
- 准备含有1的试管 µL 的 PI 溶液并收集 500 µL 培养上清液于这些试管中。立即用 500 µL 含 PI 的洗涤剂溶液（按步骤 9.2 制备）。将 24 孔板置于 4 ℃，裂解组织 1 小时 °C. 将组织裂解液移取至新管中，并将这些管子在 -80 ℃ 保存 °C，直至进一步分析。
注意：ELISA 方案高度依赖于生产商，应遵循生产商提供的说明书。以下描述的是一个标准的 ELISA 方案。 - 根据制造商说明书，采用ELISA法检测上清液或裂解液中的细胞因子水平。检测IL-1α 和 TNF-α，用移液器向96孔板中加入100 µL 捕获抗体（稀释比例请参照生产商说明书），于室温孵育过夜。
- 通过将1片洗涤缓冲液片剂溶解于1 L双蒸水中来配制洗涤缓冲液。移除捕获抗体，加入400 μL洗涤缓冲液 µ将1毫升洗涤缓冲液加入每个孔中，重复更换该体积三次。通过加入封闭液进行封闭例如，按说明书在缓冲液中加入1% BSA。室温孵育1小时。
注意：标准的市售ELISA试剂盒需要 2 x 100 µL 组织上清液或裂解液。样品应在使用前仅解冻一次。根据检测方法的灵敏度和所释放的细胞因子，样品在检测前需进行稀释。因此，使用检测试剂盒提供的试剂对样品进行稀释。 - 除去封闭液，加入用于标准曲线的稀释样本（稀释方法按照试剂盒说明书操作）以及100 µL 组织上清液或 100 µ步骤9.3中收集的组织裂解液各1 L，设两个重复，室温孵育2小时。
- 移除样本，并用移液器加入 400 µ将100 μL洗涤缓冲液加入每个孔中，重复更换此体积三次。用移液器加入100 μL µL 生物素化检测抗体（稀释比例请参照生产商说明书），室温孵育 2 小时。
- 移除抗体并用移液器加入400 µ将100 μL洗涤缓冲液加入每个孔中，重复更换此体积三次。加入100 μL µ每孔加入 HRP 标记的链霉亲和素（稀释比例请参照生产商说明书），室温孵育 20 分钟（请查阅生产商说明书）。
- 去除链霉亲和素，用移液器加入400 µ每孔加入 L 洗涤缓冲液，更换此液体三次。
- 加入100 µ底物溶液 L（按制造商推荐），避光孵育 20 分钟（请查阅制造商说明书）。
注意：此步骤对光敏感。应避免底物和培养板暴露于光线下。 - 通过加入50终止反应 µL终止溶液（1 M H2SO4使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度（参考波长：570 nm）。用450 nm处的吸光度减去570 nm处的吸光度。
注意：未处理和/或溶剂对照组织作为阴性对照。为在肺组织中诱导免疫反应，请使用适当的刺激方法例如，以100 ng/mL脂多糖（LPS）作为阳性对照。将两个孔各加入两片PCLS，并加入含100 ng/mL LPS的培养基，例如孵育24 h，随后按照步骤9.3所述收集上清液和组织裂解物。
注意：若最高标准品的吸光度等于或高于1.0，则测量结果可被接受；否则需重复测量。标准曲线应符合S型剂量-反应曲线拟合。 - 通过ELISA在步骤9.11中测定的细胞因子浓度（pg）将根据各样本组织裂解液中测定的总蛋白含量进行标准化（见第10节）。
10. 人肺组织切片中总蛋白含量的测定
注意：需要裂解PCLS以测定总蛋白浓度。此步骤使用第9.3步获得的组织裂解液。在平底96孔板中进行检测，每孔加入25 µL组织裂解液，每个样本设两个复孔。
- 配制含有以下浓度BSA的标准品：2,000 µg/mL、1,500 µg/mL、1,000 µg/mL、750 µg/mL、500 µg/mL、250 µg/mL 和 125 µg/mL，共7个浓度点。每个标准品取25 µL，设两个复孔，同时在96孔板上设置25 µL缓冲液作为空白对照（使用带板盖的96孔板）。
- 用移液器将各孔裂解液（见步骤9.3）各取25 µL，设两个复孔，加入96孔板中。每孔总共需要50 µL。通过将BCA试剂B以1:50的比例稀释于BCA试剂A中，配制BCA工作液。对于一块96孔板，需使用400 µL试剂B和20,000 µL试剂A。
- 小心向每孔加入200 µL工作液，避免产生气泡。将板置于摇床上（150 rpm）振荡30秒，确保裂解液与工作液充分混匀，然后盖上板盖。在37 °C避光孵育30分钟。使用酶标仪在540 – 590 nm波长下测定每孔的吸光度。
注意：若最高浓度BSA标准品的吸光度等于或高于0.8，则测量结果有效；否则需重新测定。标准曲线应符合四参数S型剂量-反应曲线拟合。 - 分析时，先扣除空白值，再使用四参数Marquardt方程计算标准曲线。根据标准曲线拟合结果，计算未知样品的蛋白浓度。
结果
本研究方法中，制备人肺组织切片（PCLS），并将其暴露于五种浓度的工业物质中，以评估化学物质对人肺组织免疫调节效应的影响。肺组织在浸没条件下进行持续培养，暴露时间为24小时。通过检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量、线粒体活性及显微镜下活度染色来评估毒性。此外，还检测了用于归一化的总蛋白含量及促炎性细胞因子水平。在可能的情况下，采用非线性S型曲线拟合计算抑制浓度（IC）75值。每次实验均采用细胞毒性阳性对照物（去污剂）和先天性细胞因子反应阳性对照物（LPS）进行验证。将经对数转换后的IC75 [µM] 值（log IC50）作为后续细胞因子释放检测的“刺激性”浓度使用。
图1 和 图2 展示了填充人肺组织材料的流程以及人肺组织切片（PCLS）的典型H&E染色结果。必须遵循常规卫生操作规程，以避免对健康造成不良影响，并确保处理人肺组织材料的工作人员安全。该技术需要经过人员培训并积累实践经验。需要有经验的病理学家来区分不同区域（上叶/下叶、胸膜下区与更靠近中央的区域）以及病变区域与健康区域，以评估人肺组织材料的病理状态。所制备的人肺组织切片应用于制备H&E染色的薄切片，以便病理学家重新评估。该流程有助于使用者练习并提高区分肺组织内不同病变区域和位置的能力。
图3 展示了人肺切片（PCLS）在含SLS的培养基中孵育24小时后LDH与WST-1活性的检测结果。未处理的空白对照组（不含SLS）显示于 0 µg/mL SLS 是一项重要的质量控制指标。与去垢剂裂解组织相比，LDH 的数值应低于 20%。 >WST-1 检测中为 0.7 吸光度单位。这些质量控制指标也可用于提示组织活力不足。必须将人组织对作为有效毒性物质的洗涤剂溶液的反应性作为阳性对照，其结果应表现为增加 300 - 500%。>2.0 吸光度单位）的LDH，与未经处理的组织相比，其数值 <0.1 个吸光度单位用于 WST-1 检测。SLS 在 WST-1 检测中表现为代谢活性降低，同时 LDH 升高，表明细胞活力呈浓度依赖性下降 >87 µg/mL采用 S 形浓度-反应模型对数据进行拟合，以便计算 IC75 或 IC50 值。这些数值可用于后续选择用于检测细胞因子和趋化因子水平的浓度：在高毒性浓度下，通常无法检测到细胞因子和趋化因子，或其水平显著降低。因此，建议选用无毒或仅轻度毒性的浓度（IC75）。需特别注意的是，细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性的预期升高常受到所用物质的影响21干扰物质常常会影响酶活性，如果仅使用LDH检测作为细胞毒性实验，可能导致结果误读。因此，进行多种细胞毒性检测以获得可靠且有效的结果至关重要。此外，需要指出的是，LDH检测与WST-1检测的敏感性高度相似。
在图4中，肺组织切片（PCLS）的显微存活率图像显示了人肺组织对洗涤剂这一有效毒性物质的反应性。这些结果对于验证其他存活率数据非常有用，但需要额外的设备支持。通过评估钙黄绿素阳性组织与碘化乙啶-1（EthD-1）阳性细胞核的比例，可对毒性效应进行直观判断。通常选择肺实质内随机区域可获得可比数据，而应避免选择气道或血管区域，因为较大的腔隙可能影响结果准确性。根据我们的经验并结合上述显微镜设置，对照组织的平均体积测量值介于1.5 × 106 至 5 × 106 µm3之间。该数值受肺组织材料质量、PCLS质量以及供体肺组织疾病状态的影响。尽管不同供体的人肺组织存活率存在差异，但死亡细胞核数量相对于存活组织的比例不应超过对照组织的15%。然而，若在对照组织中观察到大量死亡细胞核，则应终止该实验。
图5 展示了HClPt和SLS对人肺组织免疫调节作用的代表性数据。促炎性细胞因子IL-1α和TNF-α是炎症的生物标志物，提示在接触刺激物质后炎症过程的启动。这两种细胞因子均通过ELISA进行检测。在人肺组织切片（PCLS）中，细胞外IL-1α通常水平较低，而细胞内IL-1α可达到1,000 pg/mL及以上。细胞内IL-1α的减少提示正在进行的细胞毒性过程，通常在人PCLS暴露于化学物质后观察到。当组织以LPS（一种先天免疫系统的激活剂，作为阳性处理对照）刺激时，诱导产生的大部分IL-1α在24小时后仅能在细胞内检测到。相比之下，由LPS刺激诱导的TNF-α分泌主要可在细胞外检测到。使用适当的阳性对照（如LPS）可验证方法的有效性。在本研究方法中，人PCLS被暴露于三种浓度的HClPt（32、64和 125 µg/mL）或两种浓度的十二烷基硫酸钠（1 和 10 µg/mL) 培养24小时。细胞因子分泌量测定为细胞外和细胞内细胞因子的总和，并归一化至总蛋白浓度，如图所示。 图5值得注意的是，BCA 法通常用于测定总蛋白含量，但也能反映物质诱导的细胞毒性。因此，在高毒性浓度下，总蛋白含量不能用于细胞因子数据的归一化。IL-1α 的分泌量从 263 ± 38 pg/mg 显著增加至 887 ± 216 pg/mg，TNF-α 的分泌量则从 263 ± 38 pg/mg 显著增加至 1,160 ± 286 pg/mg（图5A，B此外，将LPS诱导的IL-1α和TNF-α分泌情况与未刺激的组织对照进行比较。病原体相关分子模式（如LPS）诱导促炎细胞因子的产生，可验证该方法的有效性，因此在利用人肺切片（PCLS）研究免疫调节效应时，强烈推荐采用此策略。有关HClPt和SLS数据的更多细节，请参见Lauenstein的研究。 等21
图1：填充人肺组织材料的操作流程。人肺在切除后应立即进行处理。为确保琼脂糖能够均匀填充并防止填充过程中琼脂糖突然聚合，肺组织应在室温下保存。将肺水平放置，使肺叶充分展开，以便清晰观察主支气管或各支气管（A 和 B 为支气管的放大图）。使用柔软的硅胶管对支气管进行插管，并用夹具固定（C）。完成填充操作并使琼脂糖在组织内聚合后，由经验丰富的病理学家将肺组织切成约 3–5 cm 厚的切片（D）。从这些切片中，使用取芯工具制备圆柱形组织芯（直径 例如，8 mm）（E）。再利用组织切片机将这些组织芯切割成肺切片（PCLS），并立即将其转移至盛有培养基的培养皿中，在标准细胞培养条件下进行孵育（E）。经过多次洗涤步骤后，将PCLS转移至细胞培养板中（例如，24孔板，每孔放置两个PCLS，加入500 µL培养基），以去除残留的细胞碎片和释放的细胞因子（F）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：通过H&E染色评估人源肺组织切片（PCLS）的健康状态。 本图中的PCLS来自一位肺肿瘤供体，显示完整的肺组织结构，包括肺泡实质、外周气道（***）和血管（箭头）的总体观（A）。在更高倍镜下可见具有完整纤毛呼吸上皮的传导性气道（箭头）（B），结构完整的肺泡，其内衬有活性肺泡上皮细胞，并可见含大量红细胞的毛细血管（箭头）（C），肺泡腔内含有肺泡巨噬细胞（CD68免疫组织化学染色）（D），以及具有完整内皮的血管（CD31免疫组织化学染色）（E）。仅使用无肿瘤组织制备PCLS，因此未见肉眼可见的病变区域。与来自其他肺部疾病（如肺气肿或纤维化）供体的PCLS相比，该样本的肺泡结构未受破坏，仅在边缘处略有松散，这很可能归因于制备过程中的操作。比例尺分别表示1,000 µm（A）和50 µm（B-E）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：通过检测酶 LDH 泄漏至培养基（A）以及使用染料 WST-1 评估代谢酶活性的损失（B），测定 SLS 在人源肺切片（PCLS）中诱导的细胞毒性。 人源 PCLS 被暴露于递增浓度的 SLS 中。随后将数据拟合为 S 形浓度-反应模型，以便计算 IC75 或 IC50 值（即细胞活力分别降低 25% 和 50% 时的抑制浓度）（右图）。数据以均值 ± 标准误表示，n = 3 - 5。LDH 检测的吸光度在 492 nm（参考波长 630 nm）处测定，WST-1 检测的吸光度在 450 nm（参考波长 630 nm）处测定。数据经改编和修改自 Lauenstein et al.21 请点击此处查看该图的高清版本。
图4：人源肺切片（PCLS）三维显微染色与图像重建的代表性图像。 通过钙黄绿素AM（黄色）和EthD-1（红色）对人源肺切片（PCLS）染色后，展示活体组织对照以及组织对洗涤剂（作为一种有效毒性物质）的反应性。使用10X物镜采集30 µm厚的图像层叠（A），并进行三维重建（B）。比例尺为100 µm。激发波长分别为488 nm和543 nm，发射滤光片分别为BP 505–550 nm和LP 560 nm。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：人肺切片（PCLS）经氯六氨合铂酸铵（HClPt）处理24小时后IL-1α和TNF-α的分泌情况。 将PCLS暴露于三种浓度的HClPt（32 µg/mL、64 µg/mL和125 µg/mL）以及两种不同浓度的十二烷基硫酸钠（SLS，1 µg/mL和10 µg/mL）。通过ELISA法测定细胞外和细胞内的IL-1α（A）和TNF-α（B），并归一化至总蛋白含量。为验证该方法的有效性，使用先天免疫系统的阳性激活剂脂多糖（LPS）作为参照，分别展示细胞内IL-1α（A）和细胞外TNF-α（B）的释放情况，并归一化至总蛋白含量。数据以均值±标准误表示，*p <0.05，***p <0.001；HClPt和SLS组：n = 9，IL-1αLPS：n = 5，TNF-αLPS：n = 4，均为技术重复（Mann-Whitney检验）。本图经Lauenstein et al.21 修改 请点击此处查看本图的放大版本。
补充图1：利用渲染软件对显微镜下存活率染色图像进行详细计算处理。 上传LSM图像进行钙黄绿素染色活体组织表面渲染的图像分析分步操作流程A-G, I）以及对溴化乙锭同源二聚体染色的细胞核进行点状检测（H, J-M). 请点击此处以查看此图的放大版本。
补充图2：人肺组织显微存活染色的计算图像分析概览。 通过表面渲染分析存活组织（黄色）（B-I），通过斑点检测识别死亡细胞核（红色）（J-P）。图像导出采用快照模式（Q）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
人类肺组织离体切片（PCLS）技术在我们实验室已得到广泛应用。本文详细描述了该技术及其在肺组织中进行物质毒性测试的应用。 离体通常情况下，任何使用该技术的实验室都应建立与检测方法相关的可定量范围定义、变异度估计以及质量控制措施，以确保实验的有效性。可能的标准操作程序包括，例如，对每个终点指标进行重复检测， 例如细胞毒性检测应至少使用三位不同生物供体样本（独立实验）进行，每一样本至少设置两到三个技术重复，并包括阳性和阴性对照。实验室操作人员应接受培训，以提高检测的一致性并尽量减少实验变异。
常用于评估物质对肺组织免疫调节作用的终点指标包括使用不同检测方法测定的细胞毒性（例如，LDH 检测、WST-1 检测、显微镜染色检测）、细胞因子释放检测，以及通过免疫组织病理学方法分析基因表达谱的变化和细胞群体的表征6。此外，已有技术可用于可视化小鼠PCLS中的细胞（如肺树突状细胞）28，这些技术也可应用于人源PCLS，从而可能在给予潜在细胞毒性物质处理前后，更深入地了解细胞组成的改变。
本制备人肺组织切片的基本方案与技术，与其他文献中已有详尽描述的方法类似29。简而言之，器官组织来源于患有危及生命的慢性疾病（如肺癌）并需接受切除或移植手术的患者。相关研究必须经当地伦理委员会批准，并需获得患者的知情书面同意。建立临床与实验室之间的标准工作流程至关重要，这需要双方在沟通、接口定义及基础设施方面进行协调。人肺组织在切除后必须立即处理，以保持组织的活性。值得注意的是，本文所述的人肺组织切片（PCLS）制备技术适用于年轻和年老的肺组织，也适用于健康和病变的肺组织。例如，在美国，可以从因意外死亡或器官不适用于移植的健康器官捐献者处获取肺组织。
实验方案中的第一个关键步骤是用琼脂糖溶液充胀气道及其周围的肺实质。此步骤对于固化极为柔软的组织以进行后续切片至关重要。人肺组织的质量，尤其是其疾病背景，在此环节尤为关键。只有胸膜完整的肺叶才能成功充胀。靠近支气管的终末期肿瘤有时会阻碍充胀过程。在对人肺组织进行充胀前，必须仔细检查琼脂糖溶液的温度。人肺组织内若含有过多血液（或其他液体、渗出物），会导致琼脂糖被非预期稀释，从而影响其聚合过程。肺组织充胀后置于冰上使琼脂糖凝胶化，随后将肺组织切成200至300 µm厚度的切片。组织的一致性是一个极为关键的问题。若组织过软，则难以切出厚度均一的切片。即使为每位供体设置相同的切片机参数，由于个体差异以及每例肺组织在充胀过程中的变化，不同供体之间的切片厚度仍可能存在差异。组织充胀不均将导致切片厚度不一致。除直接测量并标准化切片厚度外，还可通过测定总蛋白含量间接监测肺切片的厚度。多种终末期肺部疾病会妨碍切片过程。 例如在肺动脉高压中，血管壁会显著增厚，且纤维化组织可能极为僵硬，导致组织圆柱难以切片，需频繁更换切片刀。
在制备人肺组织切片（PCLS）并进行充分的洗涤步骤以去除细胞碎片和释放的酶后，组织切片即可用于实验29。人PCLS在常规细胞培养条件下进行培养，并可暴露于化学物质、药物或脂多糖等刺激物。由于（未知）感染导致的PCLS偶尔污染，是人肺组织材料培养中的一个特殊问题。显示感染迹象的组织培养物必须丢弃，且相关设备必须彻底消毒。将用于制备和培养的实验区域进行空间分离，有助于避免交叉污染。在设备方面，切片机可能泄漏，松动的六角螺丝可能导致电机损坏并使刀片运动停止。并非切片机的所有部件均由不锈钢制成，因此若清洁后未立即干燥，将发生氧化。为应对设备故障问题，建议至少配备一台备用设备。
在以往的文献中，有报道称琼脂糖在制备后的强化洗涤步骤中可被洗脱并去除。事实上，这是不可能的，琼脂糖无法被去除。若要完全去除琼脂糖，需在高温下重新熔化，但这会破坏组织。存在于肺泡和气道中的琼脂糖不会干扰本文所述的检测终点。然而，其他检测终点可能会受到琼脂糖存在的影响（参见局限性部分）。必须强调制备非常新鲜的组织切片的重要性，因为组织活性在培养过程中是一个关键问题。支气管收缩不是一个有效的活性评估参数。我们建议至少使用两种或三种独立的细胞毒性检测方法来评估周围肺实质的活性；每次实验都必须进行此项检查30。细胞毒性检测中的质量控制可作为组织活性不足的指标。因此，建议在所有细胞毒性检测中评估组织对有效毒性物质（例如洗涤剂）的反应性。根据剂量-反应曲线，应为细胞毒性检测设定吸收值的最小值和最大值，并在后续实验中满足这些标准。对本方案的进一步修改主要取决于所用化学物质和关注的检测终点。不溶性或高反应性化学物质的应用受到限制。DMSO的最高溶剂浓度限制为1%。虽然可以使用更高浓度，但可能导致促炎性细胞因子（如IL-8）的显著释放。另一方面，所用刺激物可能相对较弱。在此情况下，可将每孔组织量从两片增加至四片。该方法将组织活性限制在24小时以内。
人源肺组织切片（PCLS）的一个主要局限性在于，在德国只能使用病变的人肺组织来制备。接受手术的患者通常年龄超过50岁，且80%的肺癌患者目前或曾经有吸烟史。患者的用药情况（如糖皮质激素）也可能影响使用人组织进行实验的结果。因此，必须做到以下两点：i) 通过阳性对照验证每次实验，以确认个体组织的活性、功能性和敏感性；ii) 使用来自实验动物的健康、非病变、中年肺组织进行交叉验证（非人灵长类动物如食蟹猴，以及可能情况下使用小鼠、大鼠、豚鼠）。病变组织的病理评分越高，实验结果通常越好。严重病变的组织几乎无法使用，且常常表现出有限的活性、细胞因子水平过低或过高、细菌或真菌感染，以及支气管收缩能力减弱。与实验动物获得的结果相比，供体之间的个体差异更大，这反映了人类个体间的自然变异性。然而，这通常并不构成普遍性限制；如上所述，在其他国家（例如，美国），可以从因不适合移植而被拒绝使用的已故器官捐献者身上获取健康的肺组织。在急性暴露实验中，组织的反应性在最初48小时内已有充分描述。经过多天培养或在-80 °C下储存后，组织的活性和功能性会下降。人肺组织最多可培养约14天。在此期间组织仍保持活性；然而，变异性增加，且组织中多种细胞群体（如巨噬细胞）的功能逐渐丧失，导致对有丝分裂原刺激的细胞因子释放能力受限。对于某些检测终点而言，另一个限制因素是组织中存在琼脂糖，这会阻碍高质量且足量RNA的提取31，或妨碍制备单细胞悬液用于后续的流式细胞术分析和细胞表型鉴定。因此，深入探究单个细胞反应及其功能机制的可能性受到限制。
器官型组织模型（如人肺切片PCLS）在基础研究和非临床研究中具有重要意义。人肺组织具有接近正常器官结构的生物学组成，包含肺泡和支气管上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经纤维以及巨噬细胞等固有细胞类型。该组织具有良好的活性，细胞可对多种刺激产生反应。尽管神经纤维已被切断，但仍可在局部被激活，从而引发末端反射性反应14因此，这 离体 该模型可用于研究细胞的先天免疫反应、防御反应、细胞因子信号传导以及细胞表面标志物的诱导。技术、培养方法和终点验证方面的多项改进，使得人肺组织切片（PCLS）可应用于转化医学研究。未来的研究方向示例包括：i）在人肺组织中验证新靶点；ii）评估暴露于化学物质、药物、纳米颗粒等后的免疫反应。 等等。，iii）向肺组织补充免疫细胞，例如T淋巴细胞，iv）分子模式的鉴定与修饰，例如在接触呼吸道致敏物、致病物质或通路抑制性活性化合物后；此外，v）气道重塑以及vi）神经调节32科学界对PCLS的当前及未来应用方法颇感兴趣。此外，还有多种不同的技术发展将有助于改进PCLS技术，例如冷冻保存20，以及组织拉伸33 以模拟呼吸或机械通气过程中组织的自然运动。
与其它三维模型相比，人肺组织切片（PCLS）的主要优势在于其含有免疫细胞和神经纤维。实验也可在小鼠、大鼠和非人灵长类动物中进行，这些动物物种目前在药理学和毒理学研究中仍最为常用。人肺组织的复杂性有助于将动物实验结果外推至人体，以及将体外（in vitro）结果转化为体内（in vivo）情况。在现有用于识别呼吸道致敏原的替代检测方法中，人PCLS模型具有高度复杂性，但尚无法提供对单个细胞反应的深入洞察。然而，若结合适当的细胞标志物，例如凋亡、坏死或细胞内标志物，显微镜技术和流式细胞术可能提供有关细胞反应的信息。已有发表的检测方法经过验证并被报道用于呼吸道致敏原的识别。然而，PCLS技术相较于单细胞检测具有诸多优势，其应用进展正作出重要贡献，例如如Watson et al.34所述，该技术可用于高通量筛选。他们开发了一种高通量筛选方法，用于预测小鼠冷冻保存PCLS中的气道毒性。通过微型化的96孔PCLS体系，他们在小鼠灌洗液中检测到类似的结果，表明PCLS是一种可行的高通量检测模型。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。弗劳恩霍夫 ITEM 是一家独立的公立非营利性应用研究机构，代表生物技术、制药、化工和化妆品行业开展合同研究。该机构的资金来源于国家级和国际级公共项目。
致谢
我们感谢Lan Lauenstein在利用人肺切片（PCLS）进行风险评估的替代测试策略方面所做的前期工作。部分研究得到了欧洲委员会第六框架计划项目的资助。th 框架计划SENS-IT-IV“新型测试策略” 体外 过敏原评估
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅胶管 3.0 × 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
| 注射器 | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
| 取芯工具 | 定制 | 定制 | |
| 修整刀片手柄（FEATHER） | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
| 修整刀片（FEATHER） | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
| 切片机：组织切片器 | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck 组织切片器 (MD6000) |
| 切片机刀片 | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
| 组织培养皿 | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
| 细胞筛滤器（100 µm 尼龙） | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
| 接种环 | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
| TPP 组织培养板 24 孔 | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
| 包埋盒 | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
| Nunc MaxiSorp 平底板 | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
| Nunc MicroWell 96 孔板 | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
| 图像渲染软件 | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
| LSM 图像浏览器 | Zeiss (Jena, Germany) | ||
| 多孔板读数仪 | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | 酶标仪 |
| 微孔板振荡器 | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
| BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | 全自动免疫组化/原位杂交染色系统 | |
| 检测试剂盒 | |||
| 细胞增殖试剂 WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
| 细胞毒性检测试剂盒（LDH） | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
| 显微活力染色试剂 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 |
| BCA 蛋白定量测定 | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
| ELISA 检测试剂盒 | R & D systems | 多种，例如 DY210 (TNF-α) 或 DY200 (IL-1α) | DuoSet |
| 试剂 | |||
| 低凝胶温度琼脂糖 | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
| 平衡盐混合物与溶液、细胞培养、经典培养基与盐类、Earle’s 平衡盐溶液（EBSS） | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
| 青霉素和链霉素 | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
| Dulbecco´s 改良 Eagle´s 培养基 F-12 Ham 营养混合物（DMEM F-12） | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | 培养基 |
| Dulbecco´s 磷酸盐缓冲液（含 Ca 和 Mg）（DPBS） | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | 缓冲液 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
| 去垢剂 | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
| 洗涤缓冲液 | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | PBS 中含 0.05% Tween 20 |
参考文献
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