此处，我们介绍一种用于血管发生的时间推移成像与分析的实验方案 体外 使用相差显微镜结合开源软件“血管发生动力学分析”（Kinetic Analysis of Vasculogenesis）。该方案可用于定量评估多种细胞类型或模拟血管疾病的各种实验条件下血管生成潜能。
本文内容
摘要
摘要
血管发生是一个复杂的过程，其间内皮干细胞和祖细胞进行从头血管形成。de novo 血管发生的定量评估已成为内皮祖细胞功能的核心检测指标，因此，已有多种尝试致力于改进体外（in vitro）和体内（in vivo）的血管发生模型。然而，传统方法的应用范围有限，静态测量无法捕捉这一高度动态过程的诸多方面。因此，本项新实验方案的建立旨在评估体外（in vitro）血管发生的动力学过程，以定量分析血管网络的形成与稳定速率，并为潜在的血管功能障碍机制提供见解。本方案的应用以暴露于母体糖尿病环境下的胎儿内皮集落形成细胞（ECFCs）为例进行演示。胎儿ECFCs来源于出生后的脐带血，经培养后接种于含有基底膜基质的载玻片上，使其发生血管发生过程。通过15小时的延时相差显微镜成像，获取整个载玻片孔位的图像序列。利用一种名为血管发生动力学分析（Kinetic Analysis of Vasculogenesis, KAV）的分析软件对图像进行处理，以获得定量数据。KAV通过图像分割和骨架化分析，从多时间点相差图像序列中提取网络结构的十个参数（9个直接测量参数，1个计算参数），包括：闭合网络、网络面积、节点、分支、总分支长度、平均分支长度、三叉分支节点、四叉分支节点、网络结构以及分支与节点的比值。应用本方案发现，来自合并糖尿病妊娠的ECFCs其血管发生速率发生改变。然而，该技术的意义远超本研究报道的范围。该方法的推广应用将增强对血管发生及其他多种细胞类型或疾病状态下重要生物学分支过程的机制性评估，并提升其功能性检测的准确性。
引言
内皮祖细胞进行血管发生的能力，或 从头合成 血管形成在胚胎发育过程中对建立胚胎血管系统至关重要1此外，新血管的形成以及已有血管的成熟，即所谓的血管生成，在发育过程及出生后的生命阶段中也是维持全身血流和稳态的关键过程。2人体每个器官都依赖血管系统来输送氧气和营养物质，并清除代谢废物3如果血管稳态无法维持，导致血管生成和修复不足或过度，就可能引发血管疾病。4因此，血管的形成与适应常被研究，因为它们对维持器官健康至关重要，并与多种病理状态的发生发展相关。
由于对血管系统在发育以及疾病发生和进展中作用的认识不断加深，已开发出用于模拟血管生成和血管形成的各种检测方法 体外 和 体内5,6,7. 血管形成建模涉及将血管细胞（如内皮细胞）接种于基底膜基质中，以促进细胞有序排列及血管网络的形成8,9,10通常，在过夜孵育后，仅在单个时间点采集细胞网络的图像，导致可用于分析的图像数量较少。11,12,13因此，分析方法在很大程度上是针对单时间点评估而开发和优化的10,14然而，静态分析在捕捉血管形成动态过程方面显然不足，且难以深入揭示其中潜在的作用机制。尽管提高成像频率可能获得识别形成动力学所需的足够数据，但将先前开发的分析方法应用于多时间点成像策略，效率低下且耗费大量人力。14此外，尽管已有商业化的分析方法，但按图像收费的模式使得该选项在需要生成数千张图像的动力学研究中成本过高，难以承受。15因此，该领域迫切需要一种简化且高效的方法来捕获和量化血管发生过程 体外包括分析延时活细胞显微镜生成的大规模图像集的能力。
为克服这些局限性，开发了一种新方法，旨在将单时间点成像扩展为可对血管发生进行动态评估，每15分钟获取一次图像16通过在数小时内捕捉多个时间点，该方法能够更详细地描绘血管发生过程，并有助于深入了解血管网络形成与维持的潜在机制。除了提高图像采集的频率和质量外，该方法还引入了一种新型软件，即一种开源插件。17该软件名为血管生成动力学分析工具（Kinetic Analysis of Vasculogenesis，KAV），是一款专为多时间点采集所产生的大规模图像集设计的简化应用程序，集成了图像处理与分析功能。KAV 通过对相位对比图像进行图像分割，继而实施骨架化，实现图像分析。18KAV 量化了网络结构的十个参数，包括：分支、闭合网络、节点、网络面积、网络结构、三叉分支节点、四叉分支节点、总分支长度、平均分支长度以及分支与节点之比（参见示意图 图1)16KAV 方法的应用包括一种新颖的、通过计算得出的表型 体外 血管发生，即分支与节点的比率。我们近期的研究表明，该比率可反映网络的连通性，并可能与其他参与网络形成的细胞过程（如细胞运动性）相关联16.
尽管这些研究评估了胎儿内皮集落形成细胞（ECFC）的血管发生，但该图像采集与分析方法可轻松应用于评估任何经历血管发生或血管生成的细胞类型。此外，该方法还可用于识别由多种病理状态（如妊娠期糖尿病）引起的血管功能异常，正如本研究中所示。进一步地，该方法也可被改进用于评估网络形成和分支情况，这些特征对于其他具有生物学意义的过程至关重要。因此，将这一新颖方法应用于独特生物系统的潜在影响仍有待确定。
方案
1. 准备工作
- 培养内皮集落形成细胞（ECFCs）
注：本实验所用的胎儿 ECFC 样本系自人脐带血中分离，并由印第安纳大学医学院血管生物核心实验室（Angio BioCore, ABC）按先前所述方法进行培养6。ABC 内部常规进行质量控制性表型分析，以确认内皮抗原的表达，方法如前所述19,20,21。实验所用样本传代次数最少（2–3 次）。所有组织培养操作均在组织培养超净台中进行。所有试剂，包括组织培养板和溶液，均为无菌状态。- 实验前两天，用 6 mL 浓度为 0.05 mg/mL 的 I 型胶原对 100 mm 圆形组织培养板进行包被，并于 37 °C 过夜孵育。
注：I 型胶原用含 20 nM 乙酸的双蒸水稀释至工作浓度 0.05 mg/mL。 - 实验前一天，用胰蛋白酶消化并重新接种 ECFCs 至 1.1.1 步骤中制备的 I 型胶原包被板中。（参见 1.1 下的注释）。
- 消化 ECFCs 时，吸除培养板中培养基，用 7 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，吸除 PBS 后加入 2–3 mL 0.5% 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 2–5 分钟。
- 胰蛋白酶孵育后立即加入 3 mL EGM2 培养基，反复吹打以完全脱离贴壁细胞，将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
- 所有样品在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀用 1–2 mL EGM2 重悬。充分混匀细胞悬液，并取少量等分试样（20–40 μL）用于计数。
- 向细胞等分试样中加入等体积台盼蓝，取 10 µL 滴加至血细胞计数板，计数血细胞计数板四个主象限中的细胞数量。
注：为提高准确性，所有样本计数均应使用血细胞计数板两侧进行。 - 用 7 mL PBS 对步骤 1.1.1 中制备的胶原包被组织培养板洗涤两次。吸除第二次 PBS 洗涤液后，向培养板中加入 10 mL 添加 10% 胎牛血清的内皮细胞生长培养基 2（EGM2）。
- 根据步骤 1.1.7 获得的细胞计数结果，计算接种 4 × 105 个细胞所需的细胞悬液体积。将 4 × 105 个 ECFCs 接种至步骤 1.1.8 中制备的组织培养板中，于 37 °C 及 5% 二氧化碳（CO2）条件下过夜孵育。
- 实验前两天，用 6 mL 浓度为 0.05 mg/mL 的 I 型胶原对 100 mm 圆形组织培养板进行包被，并于 37 °C 过夜孵育。
- 实验前一晚将所需耗材置于 4 °C 保存
- 将一块 3" × 2" 金属板、载玻片（保持密封直至在超净台内打开）、一盒无菌 20 微升（μL）枪头以及基底膜基质（matrix）置于 4 °C 保存。
注：基质长期储存于 -80 °C；使用前务必在 4 °C 过夜或数小时内解冻。
- 将一块 3" × 2" 金属板、载玻片（保持密封直至在超净台内打开）、一盒无菌 20 微升（μL）枪头以及基底膜基质（matrix）置于 4 °C 保存。
- 确认计算机硬盘上有足够的空间存储图像。
注：根据本方案所述配置，每次实验约需 60 吉字节（GB）存储空间（每孔 4 GB）。然而，具体空间需求取决于硬件配置，需根据各系统实际情况确定。
2. 方案1：实验设置：准备载玻片
- 收集并准备器材
- 实验当天，收集用于在载玻片上铺细胞的器材，包括一个装有冰的桶、一个小容器的干冰、一把剪刀和一支20 μL移液器。用70%乙醇喷洒所有物品，用纸巾擦干后放入无菌细胞培养超净台中。
- 收集所有存放在4 °C的器材（见步骤1.2），包括金属板、盒装枪头、载玻片和基质。用70%乙醇喷洒枪头盒，并将枪头盒放入干冰容器中。
注意：仅在准备使用时才从4 °C冰箱中取出基质，且始终将基质置于冰上。 - 用70%乙醇喷洒金属板，并将其嵌入冰桶中的冰内。打开载玻片包装，将载玻片放置在金属板上以保持低温。
- 将基质加载到载玻片上
- 将移液器设定为10 μL，并用移液器从低温枪头盒中取出枪头。用剪刀剪去枪头末端约1 cm。
注意：应垂直于枪头方向剪切，以减少基质中气泡的产生。可将移液器设定体积略大于10 μL，以补偿基质粘附在枪头内壁造成的损失。 - 缓慢将基质吸入移液器枪头中。立即将枪头置于孔的中央位置，轻轻接触孔底，并缓慢推出基质。
注意：不要过度移液，否则会产生气泡。若出现气泡，应立即用细小枪头将其戳破。 - 载玻片包含15个独立孔。对每个孔重复上述步骤。每个孔使用新的枪头，以保证一致性并减少基质在枪头内固化。
- 当所有孔均加载基质后，将盖子完全推到载玻片上，并在37 °C孵育30–60分钟，直至基质完全固化。
注意：切勿让基质干燥。可在孵育器内靠近载玻片的位置，于50 mL锥形管盖中加入少量（2–3 mL）PBS，以降低基质干燥的风险。
- 将移液器设定为10 μL，并用移液器从低温枪头盒中取出枪头。用剪刀剪去枪头末端约1 cm。
3. 实验方案2：在基质上接种内皮集落形成细胞（ECFCs）
- 从组织培养板中去除贴壁的ECFCs并收集至悬浮液中
- 获取前一天接种有ECFCs的组织培养板（参见第1.1.9节）。吸除EGM2培养基，并用7 mL PBS洗涤贴壁的ECFCs一次。
- 吸除PBS，加入2–3 mL胰蛋白酶，于37 °C孵育贴壁细胞2–5分钟。
- 孵育结束后立即加入3 mL EGM2，反复吹打以充分解离所有贴壁细胞。将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
- 对剩余的三个ECFC样本重复步骤3.1.1–3.1.3，直至四个细胞样本均被收集为悬浮液。
- 配制主混合液
- 将所有样本在室温下以500 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1–2 mL EGM2中。
- 充分混匀细胞悬液，取出少量等分试样（20–40 μL）用于细胞计数。
- 向细胞等分试样中加入等体积的台盼蓝，吹打混匀后取10 μL滴加至血细胞计数板。计数血细胞计数板四个主要象限中的细胞数量。
注意：为提高准确性，所有样本计数均应使用血细胞计数板的两侧。 - 根据上述细胞计数结果，计算每个细胞样本中含有1.4×104个细胞所需的体积。充分混匀所有细胞悬液，并将1.4×104个细胞分装至新管中，为每种实验条件配制主混合液。加入EGM2培养基，使每份主混合液的终体积为175 μL。
- 通过轻柔吹打混匀每份主混合液，然后将50 μL主混合液分别加入载玻片上的各个孔中。
注意：所有样本均设三个重复孔，主混合液按3.5个孔的量计算，以确保三个孔有足够的体积。
- 孵育载玻片
- 将载玻片于37 °C孵育，直至可转移至显微镜腔室进行成像。
注意：接种与成像之间的时间应尽可能短，以减少血管发生早期阶段的数据丢失。
- 将载玻片于37 °C孵育，直至可转移至显微镜腔室进行成像。
4. 方案3：显微镜设置与图像采集
注意：在我们的研究中，方案2和方案3由不同人员同时进行。如果方案2和方案3必须由同一人完成，则应先完成下方方案3的步骤4.1和4.2，再开始上述方案2。
- 打开显微镜和计算机
- 在开始实验前约一至两小时，打开并预热载物台培养箱至 37 °C，将 CO2 设定为 5%，湿度设定为 85%。若培养箱的湿度储水槽为空，请加水填满。
- 在两个开放位置之一放置一个空的腔室载玻片，并加入蒸馏水。如有可用，固定用于腔室温度控制的反馈式温度计。
注意：如果配备了反馈式温度计，请使用该"培养箱温度"来确认腔室是否已达到平衡状态。 - 开启设定为 39–42 °C 的辅助吹风机，从下方加热载玻片，以最大限度减少冷凝现象。
- 在实验载玻片尚未加入前，先添加第二个空白载玻片作为占位。该载玻片在设置过程中用于配置各个孔的图像采集参数时作为位置占位符。
- 在第二个载玻片的孔周围储水槽中加水，以模拟成像实验期间的条件。孔周围的水可用于评估显微镜设置和预热期间的湿度情况。
注意：载物台培养箱和辅助吹风机的预平衡对于维持稳定的细胞培养环境至关重要。大多数活细胞培养腔控制器可实时反馈温度、CO2 和湿度，以评估系统是否准备就绪。在继续操作前，请检查载玻片上是否有湿度积聚，以及第 4.1.5 步中填充的储水槽是否过度干燥。若腔室内出现过度干燥或冷凝，可能需要调整湿度。为提高湿度，可添加用蒸馏水浸湿的擦拭纸；为减少冷凝，可降低第 4.1.1 步中设定的湿度值，或检查腔室温度设置及辅助吹风机的位置，因为冷凝可能是温度过低的征兆。
- 在平衡期间配置基本图像采集参数
注意：图像采集通过控制载物台、快门和相机的软件进行配置。使用多维设置工具是配置软件最简便的方法。此外，软件需要具备自动对焦程序，以确保在整个实验过程中保持对焦控制。- 使用软件为每个孔设置多个载物台位置。本方案中，选择孔的中心位置。
- 配置图像采集参数，使在每个载物台位置均能完整成像整个孔。例如，使用具有 10–20% 图像重叠的拼图扫描（tilescan），并根据相机和最终放大倍数设置约 5 × 5 个视野。
- 设置时间间隔为每 15 分钟成像一次。
注意：按照本方案所述的配置，可在 15 分钟内完成载玻片上全部 15 个孔的成像。
- 加载实验载玻片
- 在培养腔完成平衡后，将空白载玻片替换为实验载玻片。
注意：平衡后的培养腔应至少保持 20 分钟的稳定温度、CO2 和湿度。一旦实验载玻片准备就绪，必须迅速完成操作，以最大限度减少从接种到显微镜捕获首个时间点之间的"死区时间"。此外，为便于不同成像实验之间的比较，该时间应保持一致。在本实验中，第 3 部分 4.3 节所述的所有步骤约需 30 分钟完成。 - 移除载玻片盖板，并在载玻片孔周围的储水槽中加水。
注意：在成像实验期间，盖板将保持移除状态。
- 在培养腔完成平衡后，将空白载玻片替换为实验载玻片。
- 配置最终图像采集参数
- 将 CFI Plan Fluor DL 10X 物镜就位，并在聚光镜上选择 Ph1 相位环。当第一个孔处于对焦状态时，调节透射光路以实现科勒照明，并通过检查聚光镜中的相位环与物镜相位掩模的对齐情况来配置相差光学系统。
- 设置曝光时间，并调节相差成像的光源强度，通常小于 500 ms。
- 依次检查 4.2.1 步中设定的每个载物台位置，确认已选择孔的中心位置，必要时进行调整。
- 在每个载物台位置，对焦于孔中接种的细胞，并在软件中设定该位置用于成像的 z 轴位置。
- 测试显微镜的自动对焦机制。若为硬件自动对焦，确保其已开启并对所有载物台位置正确就位。
注意：由于样品和载物台在实验过程中可能发生垂直漂移，软件在每个载物台位置和每个时间点均需检查自动对焦，以确保时间序列成像的可靠性。如有可能，应使用前一时间点确定的自动对焦位置作为后续自动对焦程序的起始点，从而便于持续调整漂移。 - 降低或关闭显微镜室内的灯光，并启动成像实验。
5. 方案4：血管生成的图像处理与动力学分析（KAV）
- 将每个时间点的图像保存为每个孔的图像堆栈
注意： 大多数图像采集软件均可导出多页 TIFF（堆栈）格式的时间序列图像。KAV 设计用于处理可能包含多个时间点的数据集。因此，分析将在给定成像位置的整个图像堆栈上进行。如有需要，图像处理软件可导入每个时间点的单张图像以重建图像堆栈。 - 在计算机上打开图像处理软件
- 将 KAV 添加到图像处理软件中
- 将 KAV 文件从文件夹拖动到软件窗口底部的灰色栏中。点击“保存”以将该插件添加到列表中。
- 打开待分析的图像堆栈
- 通过图像处理软件的下拉菜单点击“文件”，然后点击“打开”，或按照步骤 5.3.1 的方法将图像文件拖入灰色栏中。
- 点击“图像”、“类型”、“8 位”，将图像转换为 8 位格式。
- 创建感兴趣区域（ROI）
- 在工具栏中点击“分析”，然后选择“工具”，再选择“ROI 管理器”以打开 ROI 管理器。
- 使用工具栏中的圆形或矩形选择工具，在图像上绘制所需的选择区域。在 ROI 管理器窗口中点击“添加”以保存该形状。
注意：可通过将已保存的 ROI（压缩文件夹）拖入“拖放”栏，在管理器中打开先前创建的 ROI。 - 在 ROI 管理器中点击列出的 ROI 标签，以在图像上查看该区域。
注意：如果 ROI 未在图像上显示，可创建第二个 ROI（任意大小/形状）并添加至管理器。当两个 ROI 均出现在列表中后，反复点击这两个 ROI，目标 ROI 将会显示在图像上。 - 如有需要，对 ROI 进行对齐。当 ROI 在图像上处于理想位置后，进入菜单，点击“编辑”，然后点击“清除外部”。此操作将删除堆栈中每幅图像在 ROI 外部的图像数据（对非矩形形状特别有用）。
注意：若使用矩形 ROI，也可点击“图像”和“裁剪”。
- 运行 KAV 软件
- 在菜单栏中点击“插件”。
- 选择“Analyze Network”插件。这将打开一个窗口，允许更改插件中的设置选项。
- 使用下拉箭头更改阈值分割方法。
- 在所有适当设置选定后，点击“确定”以启动软件处理。
注意：适当的设置通过 KAV 生成的骨架图和掩膜图的可视化效果来确定，这些图像反映了软件在相差图像中识别和区分细胞及网络与背景的准确性。
- 保存 KAV 生成的数据
- 插件完成分析后，屏幕上将弹出两个窗口：一个包含数值的数据表，另一个为融合图像堆栈，显示骨架图和掩膜图的呈现结果。
- 前往数据表左上角，点击“编辑”，然后选择“复制”或“剪切”，将数值粘贴至 Excel 电子表格中以保存数值数据。
- 点击融合的骨架图与掩膜图。通过点击“文件”、“另存为”、“TIFF”，将融合的骨架图/掩膜图堆栈保存为标记图像文件格式（TIFF）文件。
- 通过点击“文件”、“另存为”、“TIFF”，保存使用 ROI 裁剪后的相差图像堆栈。
- 点击 ROI 管理器窗口，选择用于裁剪图像的 ROI。点击“更多”，然后点击“保存”，以保存该 ROI 供将来使用。
注意：使用相同的 ROI 有助于保持不同分析之间的一致性。
结果
KAV 可生成网络结构的可视化图像
相位对比图像中 ECFCs 与基质背景之间的对比度使 KAV 能够识别出细胞特异性结构。KAV 识别出的 ECFC 网络以骨架图和掩膜图的形式进行图像化表示，以展示软件用于定量分析的结构（图 2A）。重要的是，对骨架图和掩膜图进行定性评估可快速判断 KAV 的灵敏度和准确性，这有助于确定最佳阈值设置并解读分析结果。当相位对比图像质量较高且获得足够的对比度时，KAV 能够准确识别 ECFC 网络，表现为相位对比图像与 KAV 生成的骨架图和掩膜图之间具有高度相似性（图 2A 和 视频 1）。
或者，如果相差图像对比度较低和/或出现成像伪影（如网格状干扰），则网络检测的准确性会降低，结果变得不明确（图2B）。此外，细胞培养基中气泡的形成也可能影响检测的准确性（图2）。然而，通常可通过选择 KAV 软件中提供的不同阈值分割方法来克服图像质量问题。例如，图2B 中的相差图像在除阈值方法外的其他图像处理参数完全相同的情况下进行分析。从骨架图和掩膜图的呈现结果可以看出，Otsu 阈值法对相差图像中所示的 ECFC 网络实现了更准确的检测（图2B）。因此，图像质量对于本实验获得准确且有意义的结果至关重要。然而，KAV 用户界面中提供的不同阈值分割方法可根据输入图像的质量对图像分析进行相应调整。
延时显微镜揭示宫内妊娠期糖尿病暴露后内皮集落形成细胞血管发生中的定性与定量差异
最近，KAV 分析方法被用于评估胎儿内皮集落形成细胞（ECFC）在暴露于母体2型糖尿病（T2DM）后的功能变化。 在子宫内16. 利用KAV技术，发现暴露于2型糖尿病（T2DM）环境的胎儿内皮集落形成细胞（ECFCs）在血管发生过程中表现出动力学改变。然而，除贯穿整个妊娠期的T2DM暴露外，妊娠期糖尿病（GDM）——即妊娠晚期常见的血糖耐受不良状态——同样会损害ECFC功能13因此，应用KAV分析以确定暴露于GDM的ECFCs是否也表现出ECFC网络形成动力学的改变。采用延时显微成像结合KAV分析，对第1阶段（0–5 h）和第2阶段（5+ h）进行评估。图3）。在图像采集开始时（0.50 h）以及时间序列过程中（5.00 h 和 10.00 h）获取的代表性相差显微图像，展示了单次实验日内四个测试样本中内皮集落形成细胞（ECFC）网络的形成情况（图3 和 视频 1）。尽管细胞接种量相同，如0.50小时的相差图像所示，但在5.00和10.00小时时间点，网络结构的定性差异已明显可见。来自无并发症妊娠（UC）的ECFC在接种后5小时形成复杂而精细的网络结构，与我们先前发表的数据相似16相反，来自妊娠期糖尿病样本1（GDM1）的内皮集落形成细胞形成的网络结构极少且互不连接。然而，这种模式并未在所有来自妊娠期糖尿病妊娠的内皮集落形成细胞样本中体现，表明样本间存在异质性。样本GDM2和GDM3相较于GDM1表现出更强的网络形成能力，但其连接模式与脐带血样本（UC）相比仍呈现改变。重要的是，KAV可量化内皮集落形成细胞网络的多种结构组分，从而识别出明显及细微的表型差异。
除了生成网络结构的骨架图和掩膜图外，KAV 还可量化十项网络结构参数，包括独立网络结构数量、节点数量、三叉分支节点数量、四叉分支节点数量、分支数量、总分支长度、平均分支长度、分支与节点比值、闭合网络总数以及网络面积16。KAV 将每个样本的所有时间点图像数据汇总为一个单一的数据表。表1展示了一项成像研究中一个内皮集落形成细胞（ECFC）样本的代表性原始数据。KAV 测量的网络结构参数按列排列，而随时间依次采集的图像数据则按行排列。例如，在我们的研究中，图像1是在接种后30分钟获取的，随后每15分钟采集一次图像。KAV 生成的原始数据可进一步绘制成图表，或采用更复杂的统计方法进行分析16。
五个图表展示了三次独立实验中单个非复杂样本（UC）和三个GDM样本的网络结构平均值图4）。在这些实验中，UC 样本的表现与先前分析的 UC 样本相似16此前已发现，ECFC的血管发生 体外 呈双相性，包括第1相（0 - 5 h）和第2相（5 - 10 h）16这一模式在当前的研究中保持一致，如展示闭合网络数据的图表所示（图4UC样本形成的闭合网络数量多于所有三种GDM样本。有趣的是，四个样本中有三个达到最大闭合网络数量的时间相似，均发生在接种后2.5至3小时之间。然而，GDM2样本达到最大闭合网络的速度较慢，发生在接种后5小时。尽管GDM2样本达到的最大网络数量少于UC样本，但其形成的网络随时间的维持情况与UC样本相似。相反，GDM1和GDM3样本不仅形成的网络数量少于UC样本，而且随时间推移也表现出网络数量的整体下降。总体而言，从闭合网络数量的变化曲线可以看出，所有ECFC样本均呈现出双相性的网络形成模式，但不同样本之间的网络形成速率及达到的最大网络数量存在差异。
网络面积表示内皮集落形成细胞（ECFC）形成的闭合网络内部的平均面积。因此，闭合网络数量越多，网络面积越小。这一规律在网络面积图中有所体现：与三个妊娠期糖尿病（GDM）样本相比，形成闭合网络数量更多的正常对照（UC）样本随时间推移表现出更小的网络面积（图4）。GDM2 样本形成最大数量闭合网络的速度较慢，初始网络面积较大，但随后面积随时间趋于稳定，并在15小时时与UC样本最为接近。随着时间推移，所有样本的平均网络面积均有所增加，反映出网络稳定性的降低。然而，部分样本（如GDM1和GDM3）的网络面积增长更为迅速，提示其稳定性下降程度较其他增长较缓慢的样本更为明显。
暴露于GDM的ECFC表现出网络稳定性降低
分支与节点的比值是一种由KAV计算并在我们先前研究中识别出的新表型，可指示网络连接性16。在本研究中，UC样本的比值较低，代表了较高的网络连接性，并在时间进程中得以维持（图4）。相反，三个GDM样本的分支与节点比值较高，尤其是在网络形成的第二阶段。该观察结果表明网络连接性降低，网络结构稳定性下降。
总体而言，与其它样本相比，GDM1 形成的节点和分支较少，且在整个实验过程中这种减少趋势持续存在。GDM2 和 GDM3 形成并维持的分支数量多于 UC 样本，尤其是在 5–15 小时之间。GDM2 和 GDM3 网络中检测到的节点数量与 UC 样本中的节点数量更为接近，特别是在 10–15 小时之间。分支数量较多但节点数量相似，可能解释了 GDM 样本在后期时间点表现出的分支与节点比值升高现象。重要的是，分支数和节点数的同步变化在单独的图表中可能难以解释。然而，新颖的分支与节点比值提供了一种评估方法，可用于分析分支数和节点数的变化（包括在单个图表中难以察觉的微小变化）如何共同导致网络连接性的改变。
图 1：血管生成动力学分析（KAV）所量化的10个参数的示意图。KAV 可量化网络结构的十个不同参数。所有参数均以颜色编码，并在示意图中以数字（1-10）标出。这些参数包括分支数量（绿色，1）、闭合网络（蓝色，2）和节点（红色，3）、平均网络面积（橙色，4）、网络结构数量（黑色，5）、三叉节点（黄色，6）和四叉节点（紫色，7），以及总分支长度（9）和平均分支长度（10），还有分支数量与节点数量的比值（10）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：血管发生动力学分析（KAV）对网络结构进行定量。 (A) KAV利用相差图像识别出的网络结构的骨架图与掩膜图，可直观展示KAV所识别和定量的网络结构。比例尺 = 500 µm。(B) 接种后10小时人内皮集落形成细胞（ECFC）网络的代表性相差图像，其对比度较低，且因拼接单幅图像而存在网格痕迹。当相差图像对比度较低或出现网格时，可在KAV插件中选择不同的阈值方法（如均值法或Otsu法），以提高定量准确性。图中展示了采用均值法和Otsu法两种阈值处理后所得的相差图像的骨架图与掩膜图。相差图像使用10X物镜拍摄。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：宫内GDM暴露改变ECFC网络的形成。采用相差显微镜以15分钟间隔连续拍摄ECFC网络形成过程，持续15小时。图中显示了UC组和三个GDM样本在铺板后0.5小时起，每隔5小时的代表性相差显微图像。图像使用10倍物镜拍摄。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：暴露于宫内妊娠期糖尿病（GDM）的内皮集落形成细胞（ECFCs）表现出网络形成动力学的改变。 ECFCs 来源于一次未发生并发症的妊娠（UC，黑色）以及三次由妊娠期糖尿病（GDM 1-3，红色）引起的复杂妊娠。相位差图像以每15分钟一次的频率连续采集15小时。血管生成动力学分析软件（KAV）对闭合网络、网络面积、分支、节点以及分支与节点的比值进行了定量。图中数据表示每种样本三次独立实验的平均值±标准误（SEM）。 请点击此处查看该图的放大版本。
视频 1：宫内GDM暴露改变ECFC网络形成的动力学特征。采用相差显微镜每15分钟拍摄一次ECFC网络形成图像，持续15小时。图中展示了脐带血（UC）和三个GDM样本在15小时内从0.5小时开始的相差图像。比例尺为500 µm。 请点击此处观看该视频。（右键可下载。）
| 图像 | 总分支网络数 | 节点 | 三叉点 | 四叉点 | 分支 | 总分支长度* | 平均分支长度* | 分支与节点比值 | 闭合网络 | 网络面积** |
| 1 | 382 | 290 | 278 | 11 | 943 | 47210 | 124 | 3.25 | 9 | 480214 |
| 2 | 284 | 345 | 337 | 8 | 940 | 50699 | 179 | 2.72 | 16 | 264469 |
| 3 | 205 | 376 | 366 | 9 | 910 | 55728 | 272 | 2.42 | 27 | 150621 |
| 4 | 162 | 422 | 407 | 15 | 947 | 59692 | 368 | 2.24 | 40 | 98713 |
| 5 | 132 | 454 | 441 | 12 | 967 | 61923 | 469 | 2.13 | 53 | 72951 |
| 6 | 122 | 435 | 419 | 14 | 907 | 62587 | 513 | 2.09 | 68 | 56948 |
| 7 | 88 | 429 | 411 | 17 | 852 | 63983 | 727 | 1.99 | 74 | 51429 |
| 8 | 68 | 451 | 437 | 13 | 874 | 63960 | 941 | 1.94 | 74 | 51780 |
| 9 | 93 | 437 | 417 | 18 | 905 | 60901 | 655 | 2.07 | 49 | 82919 |
| 10 | 126 | 511 | 487 | 24 | 1075 | 61981 | 492 | 2.1 | 37 | 116857 |
| 11 | 49 | 397 | 384 | 12 | 737 | 61823 | 1262 | 1.86 | 79 | 48805 |
| 12 | 81 | 376 | 364 | 10 | 751 | 56817 | 701 | 2 | 63 | 64431 |
| 13 | 98 | 509 | 482 | 26 | 1028 | 60799 | 620 | 2.02 | 44 | 98056 |
| 14 | 93 | 449 | 416 | 31 | 909 | 58282 | 627 | 2.02 | 45 | 94081 |
| *四舍五入至最接近的微米，**四舍五入至最接近的平方微米 | ||||||||||
表1： 一个ECFC样本在一次成像研究中的代表性原始数据。
讨论
KAV 能够对具有多个时间点的大型数据集进行评估
传统上，血管发生定量分析 体外 由单个或少数几个时间点的测量构成。这种静态方法在捕捉和量化动态且复杂的过程方面显然不足。因此，本研究开发了一种新颖的方法，以实现对网络形成动力学的高效分析，从而深入了解血管发生动态过程中可能涉及的分子机制。效率与自动化是开发新型技术以生成和分析大量成像数据的重要组成部分。KAV 被专门设计用于分析包含数百幅图像的大规模图像序列，以减少从延时数据集中获得生物学意义结论所需的时间和劳动。重要的是，KAV 对小型图像序列（少于 100 幅图像）可在数秒内完成图像处理与数据生成，对大型图像序列（超过 100 幅图像）则可在数分钟内完成，实现了无与伦比的分析效率。此外，通过将数据按时间和测量参数整理为电子表格，可快速生成图表并进行统计分析。
该方法成功应用中的挑战
尽管本实验方法在图像采集和分析方面均有改进，但仍存在一些可能阻碍成功实施的挑战。主要障碍有四个：湿度稳定性、从铺板到图像采集的时间精确性、软件与硬件的可靠性，以及每个实验所产生的大量数据的管理。长时间（数小时）稳定地进行活细胞成像具有挑战性。具体而言，成像腔室需要适当且稳定的加湿环境。本实验采用血管生成专用载片，这类载片专为并行化基质依赖性血管生成实验设计。由于其体积较小（约 50 µL），在长期培养条件下，蒸发和冷凝问题尤为显著。为应对这一实验难题，必须使用可调节湿度的培养箱。然而，若成像腔室随时间出现过度干燥，可能还需额外增强湿度控制。我们发现，提高湿度最简单的方法是增加腔室内的水面面积。为实现这一目标，本方案建议采用以下三种水源：另一个装有水的多室载片（该载片所在位置也用于测量培养箱温度）、载片孔周围区域的水，以及浸湿的滤纸或擦拭纸。相反，当室内空气温度使载片底部冷却时，腔室内的湿气会在载片及孔壁上发生冷凝。这种现象可能导致细胞培养基被稀释，并产生透镜效应，干扰相差成像。在本研究中，通过向载片底部吹送热空气（39–42 °C）有效减少了冷凝现象。
对于任何延时研究而言，实验起始与成像之间的一致性是一个关键考虑因素。成像开始的时间对于下游事件的解释至关重要。为了确保本实验的时间精确性，初始接种与首次成像时间点之间的时间间隔应严格控制。在实际操作中，这一"空白时间"可以尽量缩短，但更重要的是保持其一致性，以便对不同日期进行的实验进行比较。例如，在本方案中，我们预期空白时间约为30分钟。实验准备区域与成像设备的临近位置有助于实现这一点。
乍看之下可能显得微不足道的细节，实际上对软件、硬件的稳定性以及数据管理至关重要。软件及其相关硬件驱动程序、网络环境和自动软件更新都会影响软件的稳定性。建议在正式实验前进行一次"预演"，以识别图像采集过程中可能出现的瓶颈和潜在问题；例如，检查活细胞成像系统的稳定性、载物台、快门和相机的可靠性，以及机构信息技术部门关于操作系统和软件自动更新的相关政策。
数据管理是任何产生数百至数千张图像的成像实验持续面临的问题。幸运的是，商业软件通常会在启动成像实验前检查可用存储空间。然而，该实验还包括捕获后的图像处理与分析，若可用空间有限，这些操作可能进一步增加硬盘空间负担，并干扰后续的成像实验。此外，即使采用磁盘阵列等硬件解决方案，计算机的安全性与稳定性也无法完全保证。因此，必须制定数据管理策略，确保计算机硬盘为正在进行的实验保留足够的空间，并建立可靠的远程归档机制，例如利用机构提供的归档资源。
提高图像质量的策略
尽管 KAV 准确区分 ECFC 与基质背景的能力较强，但该检测方法的灵敏度依赖于图像质量。例如，如果图像对比度较低，软件检测细胞网络的准确性将下降（图 2B）。相差成像的质量受多种因素影响，包括图像采集所用显微镜的设置、实验准备过程中基质和细胞悬液的加样情况，以及成像期间孔内培养基液面的稳定性。为优化这些实验的相差成像效果，需对显微镜的相差环进行微调以提高对比度。此外，通过严格测试样品制备流程，确保培养基加样量均一且一致。如果加入孔内的基质和/或培养基体积低于或高于最佳范围，可能形成弯月面，从而改变相差效果。最后，由于孔内液体体积较小，如上所述，必须尽量减少蒸发和冷凝，以维持稳定的液面水平。总体而言，实验优化对于获得高质量、高对比度的图像以供分析至关重要。
除了相差质量外，其他因素也可能影响实验结果，包括培养基污染、基质缺陷以及基质或培养基中的颗粒或碎片。由于该实验涉及在显微镜腔室内进行数小时的活细胞成像，污染是实验中的一项风险。为降低污染风险，基质和细胞悬液需在无菌操作台中接种到载玻片上。此外，每个样本通常在实验中设置重复或三复孔，以尽量减少因意外问题（如颗粒或碎片干扰分析）导致的数据丢失风险。
样本异质性推动了对更高检测灵敏度的需求
既往研究已观察并报道了暴露于妊娠期糖尿病（GDM）环境下的晚期内皮祖细胞（ECFCs）存在异质性13观察到这些样本中细胞功能存在高度异质性，推测其可能归因于多种因素，包括母体疾病的严重程度、病程持续时间以及用于调控血糖水平的管理方式。重要的是，这种分析方法能够捕捉内皮集落形成细胞（ECFC）血管发生能力的动态范围，从而可行地识别出因妊娠期糖尿病（GDM）妊娠样本中功能异质性所致的表型差异。总体而言，使用原代患者样本（如本研究所用样本）相比细胞系可能引入更大的变异性。随着转化研究越来越重视涉及多个具有功能变异性的原代动物或人类样本的研究，检测的灵敏度对于获得具有生物学意义的测量结果和结论至关重要。因此，开发诸如KAV之类的方法将有助于提升所生成数据的数量与质量 体外 通过血管生成和血管形成实验，实现更可靠的观察与结论。此外，这些数据将有助于未来进一步研究宫内妊娠期糖尿病暴露后导致ECFC血管生成改变的潜在分子机制。
该方法的未来应用前景
尽管该方法已用于评估胎儿内皮集落形成细胞（ECFC）的血管发生能力 体外 在这些研究中，该方法的潜在应用十分广泛。此技术可轻松用于研究参与血管发生或血管生成过程的任何细胞群体。具体而言，该技术可用于研究单一细胞群体（如本研究所示），也可应用于共培养系统。未来，将该方法从二维体系进一步拓展将具有重要意义。 体外 用于评估三维（3D）模型的检测方法。尽管当前版本的KAV在量化3D成像数据方面尚不足够，但一种类似设计的延时、多参数分析方法可专门针对3D或 体内 模型将说明在二维条件下所做观察结果是否适用 体外 更能代表细胞在生物学上更相关环境中的功能。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢露西·米勒（Lucy Miller）、利安·埃尔南德斯（Leanne Hernandez）、戴维·哈斯博士（Dr. David Haas）、布列塔尼·耶利（Brittany Yeley，印第安纳大学医学院）、凯伦·波洛克博士（Dr. Karen Pollok）、朱莉·蒙德（Julie Mund）、马修·雷帕斯（Matthew Repass）和艾米丽·西姆斯（Emily Sims，印第安纳大学西蒙癌症中心血管生物核心实验室）在获取ECFC样本过程中提供的出色技术支持。作者还感谢莫琳·A·哈林顿博士（Dr. Maureen A. Harrington）、爱德华·F·斯罗尔博士（Dr. Edward F. Srour）、理查德·N·戴博士（Dr. Richard N. Day）、默文·C·约德博士（Dr. Mervin C. Yoder）和马蒂亚斯·A·克劳斯博士（Dr. Matthias A. Clauss，印第安纳大学医学院）在学术讨论方面的贡献，以及珍妮丝·沃尔斯（Janice Walls，印第安纳大学医学院）在行政支持方面的协助。所有成像工作均在印第安纳大学医学院生物显微镜中心完成。本研究由美国国立卫生研究院（R01 HL094725、P30 CA82709 和 U10 HD063094）及莱利儿童基金会资助。此外，本出版物还获得了美国国立卫生研究院下属国家心肺血液研究所资助项目（资助号：T32 HL007910）的部分支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 组织培养板 | Fisher | 353003 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher | 1495949B | |
| 血管生成15孔微孔载玻片 | Ibidi | 81506 | |
| Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
| EGM2 培养基 | Lonza | CC3162 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| PSA 抗肌细胞抗生素 | Fisher | MT30004C1 | 每500 mL EGM2培养基中加入5 mL。 |
| 0.5% 胰蛋白酶/0.53 nM EDTA（溶于HBSS） | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
| Ⅰ型胶原蛋白 | Fisher (Corning) | 354226 | 液体，100 mg，浓度范围为3–4 mg/mL。使用时用含20 nM乙酸的ddH2O稀释至终浓度为0.05 mg/mL。 |
| 冰醋酸 | Fisher | A38-212 | 用于Ⅰ型胶原蛋白溶液，终浓度为20 nM。 |
| Kim Wipes 擦拭纸 | Fisher | 06-666 | |
| 腔室载玻片 | Ibidi | 80296 | 该载玻片可注入蒸馏水，以维持成像腔内的湿度。 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1× 溶液，pH 7.2 |
| 显微镜 | Nikon Instruments | MEA53100 和 MEF55030 | 电动TiE系统，配备用于相差成像的Ph1相差环物镜 |
| 载物台 | Prior Instruments | ProScan II | 也可使用其他与OKOlab和Nikon Elements AR兼容的载物台 |
| 物镜 | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10X |
| 相机 | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
| 载物台吹风装置 | Precision Controls | N/A | 该产品已停产，替代品包括World Precision Instruments公司的Smart Air-Therm加热器（AIRTHERM-SMT-1W） |
| 载物台培养箱 | OKOLabs | H301 | BoldLine系统，包含双位置载玻片支架 |
| 计算机 | Hewlett-Packard | Z620 或同等配置 | 4核Intel Xeon处理器，>32 GB内存，>2 TB RAID 10，nVidia Quadro显卡 |
| Nikon Elements 软件 | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition 是用于配置Elements软件的多维采集设置工具。 |
| FIJI (ImageJ) 软件 | N/A | N/A | 免费开源软件，可从以下网址在线下载：https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| KAV 插件 | N/A | N/A | 免费开源软件，可从以下网址在线下载：https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |
参考文献
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