血管血管和血管生成的动力学分析体外

摘要

在这里, 我们提出了一个时间推移成像和分析血管在体外使用相衬显微镜结合开放源码软件, 动力学分析的血管。本协议可用于定量评估多种细胞类型的血管电位或模型血管疾病的实验条件。

摘要

血管是一个复杂的过程, 其中内皮干细胞和祖细胞接受从头血管形成。对血管的定量评估已成为内皮祖细胞功能的中心读数, 因此, 已经作出了一些尝试, 以改善在体外和在体内血管模型。但是, 标准方法的范围有限, 静态测量无法捕捉到这个高度动态过程的许多方面。因此, 制定这项新的协议的目标是评估的动力学的体外血管, 以定量率的网络形成和稳定, 以及提供洞察潜在的机制的基础血管功能.该协议的应用表明, 使用胎儿血管内皮细胞集落 ECFCs 暴露于母体糖尿病。胎儿 ECFCs 来源于脐带血, 出生后, 培养, 并在含有基底膜基质的幻灯片中, 他们接受血管。整个幻灯片井的图像获得了使用时间推移相差显微镜超过15小时。利用血管 (KAV) 动力学分析软件对定量数据进行分析, 对图像进行了分析。KAV 利用图像分割后的骨架, 从多时间点相位对比图的堆栈中分析网络组件, 得出十参数 (9 测量, 1 计算) 的网络结构, 包括: 封闭网络, 网络区域,节点、分支、总分支长度、平均分支长度、三分支节点、四分支节点、网络结构和分支到节点的比率。该协议的应用确定了血管在妊娠合并糖尿病患者 ECFCs 中的改变率。但是, 这项技术在此处所报告的范围之外具有广泛的含义。这种方法的实施将加强机械评估和改善血管和其他生物重要的分支过程在许多细胞类型或疾病状态的功能读数。

引言

内皮祖细胞接受血管的能力, 或从头血管的形成, 对于在发育过程中建立胚胎血管是至关重要的¹。此外, 进一步的血管形成和成熟的前现有的血管, 这被称为血管生成, 也是一个关键的过程, 在发展和产后生活中, 以保持血液流动和稳态的整个身体²。人体内的每个器官都依赖于血管系统来输送氧气和养分, 并用于清除废物³。如果血管内稳态不被维持, 这样血管的形成和修复要么不足, 要么过量, 心血管疾病会导致⁴。因此, 血管形成和适应被普遍研究, 因为它们是必不可少的维护器官健康和参与发展的许多病理状态。

由于对血管系统参与发展, 以及疾病表现和进展的认识的增加, 已经开发出了对血管和血管生成进行模型化的方法体外和体内^{5 ,6,7}。模型容器的形成涉及电镀血管细胞, 如内皮细胞, 在基底膜基质中, 促进细胞组织和血管网络的形成^8,9,10。通常情况下, 在夜间孵化后, 将在单个时间点捕获单元网络的图像, 从而导致少量图像用于分析^11、12、13。因此, 分析方法已在很大程度上被开发和优化的单一时间点评估^10,14。然而, 静态分析根本不足以捕捉血管形成的动态过程, 并对所涉及的潜在机制提供有限的洞察力。虽然增加成像频率可能提供必要的数据, 以确定形成动力学, 应用以前开发的分析的多时间点成像方法将是低效和劳动密集型¹⁴。此外, 尽管开发了商业上可用的分析, 但按图像付费的收费方式使得这一选择成本高昂, 因为在动态研究中生成了数以千计的图像¹⁵。因此, 在这一领域需要有一个精简和有效的方法来捕获和量化血管体外, 包括能够分析由延时活细胞显微镜产生的大图像集。

为了克服这些局限性, 开发了一种新的方法, 目的是扩展单点成像, 使血管的动态评估能够获得每15分钟¹⁶的图像。通过在几个小时内捕获多个时间点, 此方法提供了对血管过程的更详细的描述, 以及对有助于形成和维护容器网络的潜在机制的洞察力。除了提高图像获取的频率和质量外, 此方法还将新的软件以开源插件的形式包含在¹⁷中。该软件称为血管 (KAV) 的动力学分析, 是一个简化的应用程序, 它将图像处理和分析专门用于从多时间点获取产生的大型图像集。KAV 通过图像分割分析相位对比度图像, 然后骨架¹⁸。十网络结构参数由 KAV 量化, 包括: 分支、闭合网络、节点、网络区域、网络结构、三分支节点、四分支节点、总分支长度、平均分支长度和分支到节点比率 (见示意图图 1)¹⁶。KAV 方法的应用包括一个新的, 计算表型的体外血管, 称为分支到节点比。我们最近的工作表明, 这一比例是网络连通性的指示, 可能与其他涉及网络形成的细胞过程有关, 如运动¹⁶。

虽然在这些研究中评估了胎儿血管内皮细胞 (ECFC) 血管, 但这种图像采集和分析方法可以很容易地用于评估任何血管或血管生成的细胞类型。此外, 这一方法可以用来确定变化的血管功能产生的各种病理状态, 如妊娠糖尿病, 如这些研究所示。此外, 这种方法可以用来评估网络的形成和分支, 这对于其他生物学相关的过程非常重要。因此, 将这一新方法应用于独特的生物系统的潜在影响尚待确定。

方案

1. 准备工作

1. 培养内皮细胞集落胞 (ECFCs)
   注意: 这些实验中使用的胎儿 ECFC 样本是从人类脐带血中分离出来的, 并由印第安纳大学医学院的血管造影 BioCore (ABC) 进行培养, 如前所述⁶。常规质量控制分在 ABC 内进行, 以确认内皮抗原的表达, 如先前所描述的^19,20,21。实验中使用的样品传代最小 (2-3 次)。所有组织培养工作都是在组织培养罩中进行的。所有的试剂, 包括组织培养皿和溶液, 都是无菌的。
   1. 在实验前两天, 将100毫米圆形组织培养皿涂上6毫升0.05 毫克/毫升1型胶原蛋白, 在37° c 过夜孵育。
      注: 1 型胶原被稀释在含有 20 nM 乙酸的双蒸馏水中, 其工作浓度为0.05 毫克/毫升。
   2. 在实验前的前一天, 处理和 replate ECFCs 对1型胶原涂层板进行1.1.1。(见附注 1.1)。
   3. 处理 ECFCs, 从镀膜细胞中吸取培养基, 用7毫升 PBS 冲洗。吸 PBS, 然后加入2-3 毫升0.5% 胰蛋白酶和孵育细胞2-5 分钟在37° c。
   4. 紧接孵化后与胰蛋白酶, 添加3毫升的 EGM2 和吸管向上和向下, 以驱逐所有黏附细胞。将电池悬浮在15毫升的锥形管上。
   5. 离心机所有样品在 500 x g 在室温下5分钟。
   6. 在1-2 毫升的 EGM2 中吸取上清和再悬浮细胞小球。将细胞悬浮液彻底混合, 取出小分 (20-40 μ l) 进行计数。
   7. 在细胞分和吸管10µL 上加入等量的台盼蓝到例。计算例的四主象限中的单元格数。
      注意: 使用例的两边都可以提高精确度。
   8. 清洗胶原涂层组织培养板, 这是准备在步骤 1.1.1, 两次与7毫升的 PBS。在第二次 PBS 洗涤后, 添加10毫升的内皮生长培养基 2 (EGM2) 培养基补充10% 胎牛血清的板块。
   9. 使用在步骤1.1.7 中获得的单元计数, 计算板 4 x 10⁵单元所需的单元悬浮量。板 4 x 10⁵ ECFCs 在步骤1.1.8 中制备的组织培养板上, 在一夜之间在37° c 和5% 二氧化碳 (CO₂) 上孵育。
2. 在实验之前, 将耗材存储在 4 °C 过夜
   1. 存储一个 3 "x 2" 金属板, 幻灯片 (保存在包中, 直到打开在遮光罩), 一盒无菌20升 (μ l) 提示, 和基底膜矩阵 (矩阵)。
      注: 该基质保存在-80 ° c, 用于长期贮存;总是在4° c 过夜或在使用前几个小时解冻。
3. 确认计算机硬盘驱动器上的图像是否有足够的空间。
   注意: 使用本协议中概述的配置, 每个实验需要大约 60 gb 的空间 (4 gb/好)。但是, 空间估计是基于硬件配置的, 需要对每个系统都进行确定。

2. 协议 1: 实验设置: 准备幻灯片

1. 收集和准备用品
   1. 在实验的当天, 收集在幻灯片上的电镀细胞的供应, 包括一桶冰, 一个小容器的干冰, 一对剪刀, 和一个20μ l 吸管。喷雾所有项目与70% 乙醇, 擦干与纸巾, 并放置在一个无菌组织文化罩项目。
   2. 收集所有储存在4° c (见步骤 1.2) 的物品, 包括金属板、小贴士、滑梯和基体。用70% 乙醇喷雾盒, 把盒子放在干冰容器里。
      注: 从4° c 的冰箱中取出矩阵, 只有当准备使用, 并始终保持在冰上的矩阵。
   3. 用70% 乙醇喷涂金属板, 并将其嵌入冰桶中的冰中。打开包含幻灯片的包, 将幻灯片放在金属板上, 使其保持冷。
2. 将矩阵加载到幻灯片上
   1. 将吸管设置为10μ l, 然后用吸管将刀尖从冷端盒中取出。用剪刀将刀尖末端的大约1厘米切掉。
      注: 垂直于尖端, 以减少矩阵中的气泡。吸管可以设置为一个体积略大于10μ l, 以解释矩阵粘在内侧的尖端。
   2. 慢慢地把母体拉进吸管尖端。立即将吸管尖放在井的中心。轻轻地触摸吸管尖端到井底, 慢慢地推动矩阵出来。
      注: 不要超过吸管, 因为这将导致气泡形成。如果一个气泡形成, 弹出它立即使用一个小提示。
   3. 该幻灯片包含15个单独的井。对每个井重复前面的步骤。使用一个新的吸管尖端为每一个井保持一致性和减少基体凝固内的尖端。
   4. 一旦幻灯片装载了所有的井包含矩阵, 推动盖子所有的方式到幻灯片, 并孵育在37° c 30-60 分钟, 直到矩阵固化。
      注意: 不要让基体干燥。在孵化箱靠近滑梯的50毫升锥形管的盖子上加入一小卷 (2-3 毫升) PBS, 以降低基质干燥的风险。

3. 协议 2: 矩阵上的电镀 ECFCs

1. 从组织培养皿中去除附着 ECFCs 并在悬浮液中收集
   1. 获得组织培养板包含 ECFCs 电镀前一天 (见第 1.1.9)。吸 EGM2 培养基和洗涤粘附 ECFCs 一次与7毫升 PBS。
   2. 吸入 PBS, 加入2-3 毫升的胰蛋白酶, 并孵育附着细胞2-5 分钟在37° c。
   3. 紧接着孵化, 添加3毫升的 EGM2 和吸管向上和向下, 以驱逐所有黏附细胞。将电池悬浮在15毫升的锥形管上。
   4. 重复步骤 3.1. 1-3. 1.3 为其余的三 ECFC 样品, 直到所有四细胞样品被收集在悬浮。
2. 准备主混合
   1. 离心机所有样品在 500 x g 在室温下5分钟。
   2. 在1-2 毫升的 EGM2 中吸取上清和再悬浮细胞小球。
   3. 将细胞悬浮液彻底混合, 取出小分 (20-40 μ l) 进行计数。
   4. 在细胞分和吸管10μ l 上加入相等的部分台盼蓝到例。计算例的四主象限中的单元格数。
      注意: 使用例的两边都可以提高精确度。
   5. 使用上面的单元格计数, 计算包含 1.4x10⁴单元格的每个单元格示例的卷。将所有细胞悬浮液彻底混合, 分 1.4 x 10⁴细胞放入一个新鲜的试管中, 为每个实验条件准备一个主组合。添加 EGM2 介质, 使每个主组合的最终音量为175μ l。
   6. 混合每个主混合, 轻轻移和分50μ l 的主混合到个别井的幻灯片。
      注: 所有样品均为三份, 主混合料为3.5 口井, 以确保3口井有足够的容积。
3. 孵化滑梯
   1. 在37° c 下孵化, 直到它可以被移动到显微镜室进行成像。
      注: 电镀和成像之间的时间应尽可能简短, 以限制在血管早期阶段的数据丢失。

4. 协议 3: 显微镜设置和图像采集

注: 对于我们的研究, 协议2和3是由不同的个人同时进行的。如果协议2和3必须由同一个人完成, 则应在上述协议4.2 之前完成协议3步骤4.1 和2。

1. 打开显微镜和电脑
   1. 在开始实验前大约一到两个小时, 打开并预热舞台顶部孵化器至37° c, 将 CO₂设置为 5%, 并将湿度设置为85%。填充恒温箱, 如果为空。
   2. 放置一个空的腔幻灯片在两个开放的位置之一, 并填写蒸馏水。安全的反馈温度计的房间温度控制, 如果可用。
      注意: 如果反馈温度计是可用的, 使用这种 "孵化温度" 来验证房间是否有平衡。
   3. 打开一个二次鼓风机设置为39-42 ° c 加热幻灯片从下面和最小化冷凝。
   4. 将第二张幻灯片添加为空白, 直到可以添加实验幻灯片。此幻灯片用作配置在安装过程中单个井的图像采集设置的位置占位符。
   5. 在第二张幻灯片的井周围的水库加水, 模拟成像实验中的条件。水井周围的水可以在显微镜设置和预热过程中对湿度进行评估。
      注意: 前级孵化器和二级鼓风机的预平衡对于维持稳定的培养环境至关重要。大多数活细胞室控制器提供温度实时反馈, CO₂和湿度来评估系统的准备情况。在继续之前, 检查滑块上的湿度积聚和4.1.5 中填满的水库的过度干燥。如果室内有过多的干燥或冷凝, 可能需要调整湿度。为增加湿度, 添加湿巾和蒸馏水。为了减少冷凝, 无论是减少湿度设置4.1.1 调整, 或作为冷凝可能是低温的标志, 检查房间温度设置和二次鼓风机的位置。
2. 在平衡期间配置基本的图像采集设置。
   注意: 图像采集是通过控制舞台、快门和摄像头的软件进行配置的。多维设置工具是配置软件的最简单方法。此外, 该软件将需要有自动对焦例程, 以确保重点控制在实验的持续时间。
   1. 使用该软件为每个井设置多个舞台位置。对于本协议, 选择井中心。
   2. 配置图像采集, 以便在每个阶段的位置, 整个井是成像。例如, 使用具有10-20% 图像重叠和大约 5 x 5 字段的 tilescan, 具体取决于相机和最终放大倍数。
   3. 每15分钟配置一次成像的时间间隔。
      注意: 使用本协议中概述的配置, 幻灯片的所有15口井都在15分钟间隔内进行成像。
3. 加载实验幻灯片
   1. 在孵化室的平衡之后, 用实验幻灯片代替空白幻灯片。
      注: 一个平衡室将有稳定的温度, CO₂, 和湿度至少20分钟。一旦实验幻灯片准备就绪, 就必须迅速完成步骤, 以尽量减少电镀与显微镜捕捉到的初始时间点之间的 "死时间"。此外, 为了便于比较成像实验, 这一次应该是一致的。在这些实验中, 协议3节4.3 中概述的所有步骤都需要大约30分钟才能完成。
   2. 移除滑动盖, 并将水添加到幻灯片上的油井周围的蓄水池中。
      注: 在成像实验期间, 盖子被移除。
4. 配置最终图像获取设置
   1. 放置 CFI 计划氟 DL 10X 目标位置并选择冷凝器上的 Ph1 相环。以第一井为焦点, 调整 diascopic 光路为霍斯特·科勒照明和配置相位光学通过检查相环在冷凝器与目标相掩模的对准。
   2. 配置曝光时间并调整相位对比度的灯强度, 通常小于500毫秒。
   3. 循环通过在4.2.1 中设置的每个阶段位置, 并确认井的中心被选中, 并在必要时对其进行调整。
   4. 在每个阶段的位置, 关注的细胞镀在井中, 并设置舞台位置的 z 位置用于成像在软件。
   5. 测试显微镜的自动对焦机制。如果自动对焦是基于硬件的, 请确保它在所有舞台位置上都处于正确位置。
      注意: 由于试样和阶段在实验过程中会垂直漂移, 因此软件必须在每个阶段的位置和每一个时间点检查自动对焦, 以确保在时间过程中的可靠成像。如果可能, 在前一个时间点确定的自动对焦位置应该被用作随后的自聚焦例程的起始点。这样, 就可以轻松地调整正在进行的漂移。
   6. 减少或熄灭显微镜室的灯光, 开始成像实验。

5. 协议 4: 血管 (KAV) 的图像处理和动力学分析

1. 将图像从单个时间点保存为每个井的图像堆栈
   注意: 大多数图像捕获软件都可以导出时间序列的多页 tiff (堆栈). KAV 设计用于处理可能包括多个时间点的数据集。因此, 对给定阶段位置的整个图像堆栈进行分析。如果需要, 图像处理软件可以从每个时间点导入单个图像, 以重建图像堆栈。
2. 打开计算机上的图像处理软件
3. 将 KAV 添加到图像处理软件
   1. 将 KAV 文件从文件夹拖到软件窗口底部的灰色栏中。单击 "保存" 将软件添加到列表中。
4. 打开要分析的图像堆栈
   1. 单击图像处理软件中的下拉菜单中的 "文件" 然后 "打开", 或将图像文件拖动到灰色条中, 如步骤5.3.1 中所示。
   2. 通过单击 "图像"、"类型"、"8 位", 将图像转换为8位。
5. 创建感兴趣的区域 (ROI)
   1. 通过单击工具栏中的 "分析" 打开 ROI 管理器。然后选择 "工具", 然后是 "ROI 管理器"。
   2. 通过单击工具栏中的 "圆形" 或 "矩形" 选择工具, 并在图像上绘制所需的选择区域来创建新的 ROI。单击 "ROI 管理器" 窗口中的 "添加" 以保存该形状。
      注意: 通过将保存的 roi (zip 文件夹) 拖到 "拖放" 栏中以在 Manager 中打开, 可以打开以前创建的 ROI。
   3. 单击 roi 管理器中列出的 roi 标签以在图像上查看它。
      注意: 如果图像上不显示 roi, 则创建第二个 roi (任何大小/形状) 并将其添加到经理。一旦两个 roi 出现在列表中, 在两个之间单击来回, 所需的 ROI 将出现在图像上。
   4. 根据需要调整 ROI。一旦 ROI 在所需位置的图像上到位, 请转到菜单, 然后单击 "编辑", 然后 "清除外部"。这将删除堆栈中每个图像的 ROI 之外的图像数据 (对于非矩形形状很有用)。
      注意: 如果您使用的是 rectangularly 形状的 ROI, 您也可以单击 "图像" 和 "裁剪"。
6. 运行 KAV 软件
   1. 单击菜单栏中的 "插件"。
   2. 选择 "分析网络" 插件。这将打开一个带有选项的窗口, 以改变插件中的设置。
   3. 使用下拉箭头更改阈值方法。
   4. 选择所有适当的设置后, 单击 "确定" 以启动软件处理。
      注意: 通过 KAV 生成的骨架和掩码格式的可视化来确定适当的设置, 这表明了软件在相位对比度图像中从背景中识别和辨别单元和网络的精度。
7. 保存 KAV 生成的数据
   1. 一旦插件完成了分析, 两个窗口将弹出在屏幕上, 包括一个数据表的数字值和一堆融合图像描绘骨架和面具格式副本。
   2. 通过导航到数据表的左上角并单击 "编辑" 然后 "复制" 或 "剪切" 将值粘贴到 excel 电子表格中来保存数值。
   3. 点击融合骨架和面具图像。通过单击 "文件"、"另存为" 和 "tiff", 将融合的骨架/蒙版图像堆栈保存为带标记的图像文件格式 (tiff) 文件。
   4. 通过单击 "文件"、"另存为" 和 "TIFF", 保存裁剪的相衬图像堆栈 (使用 ROI 创建)。
   5. 点击 roi 管理器窗口, 选择用于裁剪图像的 roi。单击 "更多", 然后 "保存" 以保存 ROI 以备将来使用。
      注意: 使用相同的 ROI 将有助于在分析中保持一致性。

结果

KAV 产生网络结构的可视化表示
相位对比图中 ECFCs 和矩阵背景的对比使 KAV 能够识别特定于细胞的结构。由 KAV 标识的 ECFC 网络代表图画作为骨架和掩码格式副本来说明软件用于量化的结构 (图 2A)。重要的是, 对骨架和掩码格式的定性评估可以快速识别 KAV 的灵敏度和准确性, 这在确定最佳阈值设置和解释分析结果方面非常有用。当相位对比度图像的质量高, 并且达到足够的对比度时, KAV 准确地识别 ECFC 网络, 如相衬图像与 KAV 生成的骨架和掩码格式副本的相似性所示 (图 2A和视频 1)。

或者, 如果相位对比度图像没有高对比度和/或人工成像 (如网格发生), 网络检测的准确性会降低, 结果会变得模糊 (图 2B)。此外, 在细胞介质中形成气泡也会使检测精度模糊 (图 2)。然而, 通过选择 KAV 软件中所包含的不同阈值方法, 往往可以克服图像质量问题。例如,图 2B中的相位对比度图像是使用相同的图像处理设置 (除了阈值方法) 进行分析的。从骨架和掩码格式副本, 很明显, 大津阈值导致更准确地检测 ECFC 网络中显示的相衬图像 (图 2B)。因此, 图像质量是至关重要的, 以取得准确和有意义的结果, 在这个测试。但是, KAV 用户界面中的不同阈值方法允许基于输入图像质量的图像分析进行调整。

时间推移显微镜鉴别宫内妊娠糖尿病暴露后 ECFC 血管的定性和定量差异
最近, KAV 分析方法被用于评估胎儿 ECFC 功能后暴露于母体2型糖尿病 (T2DM)在子宫内¹⁶。使用 KAV, 改变动力学的血管被确定在胎儿 ECFCs 暴露于 T2DM。然而, 除了 T2DM 暴露, 这在整个妊娠期发生, 妊娠糖尿病 (GDM), 或通常在妊娠晚期葡萄糖不耐受的发展, 也损害了 ECFC 功能¹³。因此, KAV 用于确定 GDM 暴露的 ECFCs 是否也显示 ECFC 网络形成的改变动力学。相位 1 (0-5 h) 和阶段 2 (5 + h) 的评估使用时间推移显微镜结合 KAV 分析 (图 3)。在图像采集开始时 (0.50 h) 和整个时间过程 (5.00 和 10.00 h) 中获得的具有代表性的相位对比度图描述了从单个实验日 (图 3和视频1中测试的四样本中的 ECFC 网络的形成。).尽管在0.50 小时的相位对比图中观察到了等效的细胞负荷, 但在5.00 和10.00 小时的时间点上, 网络结构的质量差异是明显的。ECFCs 从简单的怀孕 (UC) 形成一个复杂和复杂的网络5小时后电镀, 类似于我们以前公布的数据¹⁶。相反, ECFCs 从 GDM 样本 1 (GDM1) 形成的网络结构很少是相互关联的。然而, 这种模式并没有反映在所有的 ECFC 样本从 GDM 怀孕, 表明样品之间的异质性。样本 GDM2 和 GDM3 显示更大的网络形成相比, GDM1, 虽然模式的连接出现变化相比, UC 样本。重要的是, KAV 测量 ECFC 网络的几个结构成分来识别明显的和微妙的表型。

除了生成骨架和掩码的网络结构外, KAV quantitates 十的网络结构指标, 包括单个网络结构的数量、节点、三分支节点、四分支节点、分支、总计分支长度、平均分支长度、分支到节点比率、总关闭网络和网络区域¹⁶。KAV 将每个示例的数据编译为时间过程的所有图像的单个值表。表 1包含来自一个 ECFC 样本的一个成像研究的有代表性的原始数据。将 KAV 测量的网络结构参数组织成列, 并将随时间推移获取的序列图像的数据组织成行。例如, 在我们的研究中, 图像1获得30分钟的后电镀, 随后的图像每15分钟收集一次. KAV 生成的原始值可以用更复杂的统计方法¹⁶进行图表或进一步分析。

五图描述网络结构的平均值从三单独实验显示为一个简单的样品 (UC) 和三 GDM 样品 (图 4)。这些实验中的 uc 样本类似于以前分析的 uc 样本¹⁶。以前, 它被确定 ECFC 血管在体外是双相位的, 由阶段 1 (0-5 h) 和阶段 2 (5-10 h)¹⁶组成。此模式在当前的研究中是一致的, 如描述闭合网络数据的图所示 (图 4)。与所有三的 GDM 样本相比, UC 样本形成了更多的闭合网络。有趣的是, 在四样本中, 有三个出现了与最大数量的闭合网络相似的时间, 这种情况发生在2.5 和3小时之间。然而, GDM2 样品较慢, 达到最大闭合网络, 发生5小时后电镀。并且, 尽管 GDM2 样品形成较少最大的网络与 uc 样品相比, 它形成的网络类似地维护了对 uc 样品随着时间的推移。相反, 与 UC 样本相比, 形成较少网络的 GDM1 和 GDM3 也显示了随着时间的推移网络数量的整体减少。总体而言, 从描述闭合网络数的图中可以明显看出, 所有的 ECFC 样本都显示出了一个网络形成的双相位模式, 但是在不同的样本中, 所实现的网络的形成率和最大数目是各不相同的。

网络区域代表 ECFCs 所形成的封闭网络中的平均区域。因此, 封闭的网络号越大, 网络区域就越小。此模式反映在网络区域图中, UC 示例 (它形成了更大数量的封闭网络) 与三 GDM 示例 (图 4) 相比, 在一段时间内的网络区域较小。GDM2, 到达最大的闭合的网络更加缓慢地, 最初显示高网络区域, 然而区域稳定随着时间, 并且这是最相似的 UC 样品在15小时。随着时间的推移, 由于网络的稳定, 所有样本中的平均网络面积都增加了。然而, 一些样品, 如 GDM1 和 GDM3, 表现出更迅速的增加网络面积, 这很可能预示着下降的稳定性相比, 其他样品表现出更渐进的增长。

GDM 暴露的 ECFCs 展示降低了网络稳定性
分支与节点的比值是由 KAV 计算出的一种新的表型, 在我们以前的研究中得到了证实, 这表明了网络连接性¹⁶。在当前的研究中, UC 示例的比率很低, 这代表了一段时间内维护的网络连接的高水平 (图 4)。相反, 三 GDM 样本的分支与节点的比率更高, 特别是在网络形成的2阶段。这一观察表明, 网络结构的连通性和消除稳定性降低。

总的来说, 与其他样本相比, GDM1 形成的节点和分支较少, 在实验过程中保持了减少。与 UC 样本相比, GDM2 和 GDM3 形成并维持了更多的分支, 特别是在 5-15 h 之间。在 GDM2 和 GDM3 网络中检测到的节点数量与 UC 样本中的节点数更相似, 特别是在 10-15 h 之间。更多的分支, 但同样数量的节点, 可以解释增加的分支节点比率明显在以后的时间点在 GDM 样本。重要的是, 分支和节点数的同时变化可能很难在单独的图中解释。但是, 新的分支到节点比率提供了一种方法来评估更改的方式, 包括单个图中难以检测到的细微变化 (在分支和节点号中), 从而导致网络连接的改变。

图 1: 示意图概述了由血管 (KAV) 的动力学分析量化的10参数.KAV quantitates 十不同的网络结构参数。所有参数都是彩色编码的, 并在示意图中进行了数值 (1-10)。参数包括分支的数量 (绿色, 1), 闭合的网络 (蓝色, 2), 和节点 (红色, 3), 平均网络区域 (橙色, 4), 网络结构的数量 (黑色, 5), 三分支节点 (黄色, 6) 和四分支节点 (紫色, 7), 以及总 (9) 和平均 (10) 分支长度, 以及分支数与节点数的比值 (10)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 血管 (KAV) quantitates 网络结构的动力学分析.(A) KAV 使用相衬图像识别的网络结构的骨架和掩码格式副本提供了由 KAV 识别和量化的网络结构的可视化表示形式。缩放条 = 500 µm. (B) 一个具有代表性的相位对比度图像 ECFC 网络 10 h 后电镀, 具有低对比度和网格标记的拼接个别图像一起。不同的阈值方法, 如平均或大津, 可以选择在 KAV 插件, 以提高定量的准确性, 如果相衬图像有低对比度或如果网格发生。对平均和大津阈值方法均显示了相衬图像的骨架和掩模格式。使用10X 目标捕获相衬图像。缩放栏 = 500 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: GDM 宫内暴露会改变 ECFC 网络的形成.采用相衬显微镜对 ECFC 网形成的图像进行15小时15分钟的捕捉。在 UC 和三 GDM 样本中, 从电镀 (0.5 h) 开始时, 有代表性的相位对比度图像以5小时的增量显示。使用10X 目标捕获相衬图像。缩放栏 = 500 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: ECFCs 暴露在 GDM 宫腔内的表现改变了网络形成动力学.ECFCs 是从单纯的妊娠 (UC, 黑色) 和三妊娠合并妊娠糖尿病 (GDM 1-3, 红色)。相衬图像被捕获的15分钟间隔为 15 h. 血管 (KAV) 软件的动力学分析定量封闭网络、网络区域、分支、节点和分支与节点的比值。数据说明了平均±标准误差的平均值 (SEM) 的三单独的实验为每个样本。请单击此处查看此图的较大版本.

视频 1:宫内 GDM 暴露会改变 ECFC 网络形成的动力学.采用相衬显微镜对 ECFC 网形成的图像进行15小时15分钟的捕捉。相衬图像显示的 UC 和三 GDM 样本超过15小时开始在0.5 小时。刻度栏代表500µm.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

图像	分支网络总数	节点	三	四	分支	总分支长度 *	平均分支长度 *	分支到节点比率	封闭式网络	网络区域 **
1	382	290	278	11	943	47210	124	3.25	9	480214
2	284	345	337	8	940	50699	179	2.72	16	264469
3	205	376	366	9	910	55728	272	2.42	27	150621
4	162	422	407	15	947	59692	368	2.24	40	98713
5	132	454	441	12	967	61923	469	2.13	53	72951
6	122	435	419	14	907	62587	513	2.09	68	56948
7	88	429	411	17	852	63983	727	1.99	74	51429
8	68	451	437	13	874	63960	941	1.94	74	51780
9	93	437	417	18	905	60901	655	2.07	49	82919
10	126	511	487	24	1075	61981	492	2。1	37	116857
11	49	397	384	12	737	61823	1262	1.86	79	48805
12	81	376	364	10	751	56817	701	2	63	64431
13	98	509	18W	26	1028	60799	620	2.02	44	98056
14	93	449	416	31	909	58282	627	2.02	45	94081
* 四舍五入至最近的微米, ** 四舍五入至最近的 micron^2

表 1:代表性原始数据从一个成像研究为一个 ECFC 样品.

讨论

KAV 允许对具有多个时间点的大型数据集进行评估
传统上, 定量的血管体外包括一个单一的, 或一些时间点测量。这种静态方法根本不足以捕获和量化动态和复杂的过程。因此, 这种新的方法被开发, 使有效的分析网络形成动力学, 以了解潜在的分子机制参与血管的动态过程。效率和自动化是开发新的技术来生成和分析大量成像数据的重要组成部分。KAV 是专门为分析由数以百计的图像组成的大图像栈, 以减少时间和劳力所需的从时间推移数据集得出生物学上有意义的结论。重要的是, KAV 进行图像处理和数据生成在几秒钟内的小 (少于100图像) 的图像栈和分钟的大 (大于100图像) 的图像堆栈, 导致无与伦比的效率。此外, 数据组织通过时间和参数测量, 可以快速生成图形表示和统计分析。

成功应用此方法的挑战
虽然这种检测包括对图像采集和分析的改进, 但一些挑战可能会阻碍成功的实施。四主要的障碍包括湿度稳定性、从电镀到图像采集的定时精度、软件和硬件可靠性, 以及为每个实验生成的大型数据集的管理。稳定的活细胞成像超过几个小时可能是挑战。具体地说, 成像室需要适当和一致的加湿。本试验采用血管生成切片, 为并行基质血管生成方法设计。他们的低容量, 大约50µL, 使蒸发和凝聚重要考虑为延长的文化条件。为了应对这一实验问题, 必须使用调节湿度的恒温箱。然而, 如果成像室的过度干燥随着时间的推移而发生, 也可能需要增加这一规定。我们发现, 增加湿度最简单的方法是增加室内的水面面积。为了实现这一目标, 我们的协议提出了以下三水源: 第二个腔的幻灯片充满了水, 这也是恒温器的温度测量, 在幻灯片上的水井周围的水, 和湿滤纸或巾.反之, 冷凝发生在房间里的空气温度冷却幻灯片的底部和室内的湿度凝结在幻灯片和水井。这种并发症会导致细胞介质的稀释, 以及干扰相衬的透镜效应。在这些研究中, 通过将加热的空气 (39-42 ° c) 应用到滑梯的底部来减少冷凝。

任何时间推移研究的关键考虑是实验起始和成像之间的一致性。成像开始的时间对下游事件的解释至关重要。为了保证该方法的定时精度, 应严格控制初始电镀时间与第一个成像时间点之间的距离。在实践中, 这个 "死时间" 可以最小化, 但更重要的是, 它需要保持一致, 让实验在不同的日子进行比较。例如, 在本协议中, 我们预计约30分钟的死亡时间。这可以通过接近实验准备和成像设施来促进。

乍一看, 看似平淡无奇的细节对于软件、硬件稳定性和数据管理都很重要。软件和相关的硬件驱动程序、网络环境和自动化软件更新都将影响软件的稳定性。值得在 "干运行" 中测试此协议, 以识别图像获取中的瓶颈和潜在问题来源;例如, 检查不可靠的实时单元设置、舞台、快门和照相机的可靠性, 以及有关自动化操作系统和软件更新的机构信息技术策略。

数据管理是一个持续关注的任何成像实验, 产生成千上万的图像。幸运的是, 商业软件通常在开始进行成像实验之前检查可用空间。然而, 该方法还包括后捕获图像处理和分析, 可以增加硬盘空间负担和干扰成像实验, 如果可用空间有限。此外, 即使使用硬件解决方案 (如相同磁盘的冗余阵列), 也无法保证计算机的安全性和稳定性。因此, 必须有一个数据管理策略来确保计算机硬盘驱动器上的空间, 以便进行不断的实验和强健的远程存档, 例如使用机构存档资源。

提高图像质量的策略
虽然 KAV 的能力, 以准确辨别 ECFCs 从矩阵的背景是稳健的, 灵敏度的检测是取决于图像质量。例如, 如果图像的对比度较低, 则软件将检测精度较低的单元网络 (图 2B)。相位对比度的质量受到多种因素的影响, 包括用于图像采集的显微镜的设置、基质的加载以及在化验准备过程中的细胞悬浮介质, 以及井内介质水平的维护整个成像。为了优化这些测定的相衬度, 在显微镜下对相环对准进行了细微的调整, 以提高对比度。此外, 对样品的准备进行了严格的测试, 以确保相同和一致的介质加载。如果载入井中的基质和/或介质的数量低于或高于最佳范围, 则半月板可以形成导致改变的相衬。最后, 由于油井中的液体体积很小, 因此, 如上文所述, 通过最小化蒸发和冷凝来维持介质的水平是至关重要的。总的来说, 分析优化对于生成高质量的对比度图像是至关重要的。

除了相衬质量之外, 其他因素还可能影响分析结果, 包括介质污染、基质中的缺陷以及基体或介质中的微粒或碎片。污染是这种方法的一个危险, 因为它涉及活细胞成像超过几个小时在显微镜室。为了减少污染的风险, 基质和细胞悬浮物被装在无菌罩的滑梯上。此外, 每个样品通常是重复或一式三份的实验, 以尽量减少由于不可预见的问题, 如碎片或粒子混淆分析的数据丢失的风险。

样品异质性驱动需要提高检测灵敏度
异质性已观察到, 并报告了以前的研究 ECFCs 暴露于 GDM¹³。在这些样本中观察到的细胞功能的高水平的异质性被推测是由于一些因素, 包括母亲疾病的严重性, 疾病的持续时间, 以及用于调节血糖水平的管理方式。重要的是, 这种分析方法捕获了 ECFC 血管的动态范围, 使得在 GDM 怀孕的样本中由于功能异质性而识别表型差异是可行的。总的来说, 使用的主要病人样本, 如这些研究中使用的, 可以引入更大的变异性相比, 细胞系。由于更多的重点放在涉及多种初级动物或人类样本的具有功能变异性的转化研究上, 化验灵敏度是检测和推导具有生物意义的测量和结论的关键。因此, 像 KAV 这样的方法的发展将会提高由体外血管和血管生成检测所产生的数据的数量和质量, 从而能够更有力地观察和结论。此外, 这些数据将有助于未来的基础分子机制的研究, 有助于改变 ECFC 血管后宫内 GDM 暴露。

此方法的未来应用
虽然这种方法用于评估胎儿 ECFC 血管体外在这些研究中, 这种方法的潜在应用是多种多样的。这项技术可以很容易地被实施来研究任何参与血管或血管生成过程的细胞群体。具体来说, 它可以用于研究单个细胞的数量, 如本研究所示, 但也可以应用于共培养系统。在将来, 将这种方法扩展到二维体外分析中将是有益的, 以评估三维 (3D) 模型。虽然当前版本的 KAV 将不足以量化3D 成像数据, 一个类似设计的时间推移, 多参数分析方法专门为3D 或在体内模型将通知, 如果在两个维度的观察体外是代表细胞功能在一个更生物学相关的设置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 组织培养板	Fisher	353003
15 mL 锥形管	Fisher	1495949B
血管生成 15 孔微载玻片	Ibidi	81506
Matrigel	Fisher （Corning）	354234
EGM2 培养基	Lonza	CC3162
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
PSA 抗肌细胞、抗生素	Fisher	MT30004C1	每 500 mL 瓶装 EGM2 培养基添加 5 mL。
Fisher （Corning） 中的	0.5% 胰蛋白酶/0.53 nM	EDTA MT25052CI
1 型胶原蛋白	Fisher （Corning）	354226	100 mg 液体，浓度范围 3-4 mg/mL。在 ddH2O 中用 20 nM 乙酸稀释，最终浓度为 0.05 mg/mL。
冰醋酸	Fisher	A38-212	用于 1 型胶原蛋白溶液，终浓度为 20 nM。
Kim Wipes	Fisher	06-666
腔室载玻片	Ibidi	80296	此载玻片可以装满蒸馏水，以保持成像室中的湿度。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Fisher （Gibco）	20012027	1x 溶液，pH 7.2
显微镜	尼康仪器	MEA53100 和 MEF55030	电动 TiE，包括 Ph1 相环，用于与物镜进行相差
	Prior Instruments	ProScan II	其他 OKOlab 和 Nikon Elements AR 兼容载物台
	Nikon Instruments	93178	CFI Plan Fluor DL 10X
相机	Hamamatsu	C11440-42U	ORCA Flash 4.0LT
舞台鼓风机	精密控制器	N/A	此商品已停产，替代品包括来自世界精密仪器的智能空气热加热器（AIRTHERM-SMT-1W）
舞台顶部培养箱	OKOLabs	H301	BoldLine 包括一个双位置幻灯片支架
计算机	Hewlett-Packard	Z620 或同等产品	4 核 Intel Xeon 处理器，>32 GB RAM，>2 TB RAID 10，nVidia Quadro 显卡
Nikon Elements 软件	Nikon Instruments	AR v 4.20	ND Acquisition 是一个用于配置 Elements 软件的多维设置工具。
斐济 （ImageJ） 软件	N/A	N/A	免费开源软件 在线下载地址如下： https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV 插件	N/A	N/A	免费开源软件 在线下载地址如下： https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis