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方法文章

使用全身麻醉的小鼠程序中系统性评估其健康状况

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DOI：

10.3791/57046

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2018年3月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 2Institute of Pharmacology and Toxicology, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), 4Unit of Physiology, Pathophysiology and Experimental Endocrinology, Department of Biomedical Sciences, University of Veterinary Medicine

本文内容

摘要

我们开发了一种评估小鼠在全身麻醉过程中福利状况的方案。该方案分析了一系列反映福利水平的行为学参数以及糖皮质激素代谢物。本方案可作为一种通用工具，以科学且以动物为中心的方式评估实验操作的严重程度。

摘要

根据 Russel 和 Burch 提出的“3R 原则”（替代、减少、优化），科学研究应尽可能使用动物实验的替代方法。当无法避免动物实验时，应使用获取有价值数据所需的最少数量的实验动物。此外，应采取适当的优化措施，以尽量减少实验过程伴随的疼痛、痛苦和应激。用于分类疼痛、痛苦和应激程度的类别包括：无恢复、轻度、中度或重度（欧盟指令 2010/63）。要确定个别情况下适用的类别，关键在于使用科学可靠的评估工具。

本文介绍的健康评估方案适用于使用全身麻醉的操作过程。该方案重点关注笼内活动、小鼠面部表情评分（Mouse Grimace Scale）以及挖掘和筑巢等奢侈行为作为健康状况的指标。同时采用自由探索范式评估与特质焦虑相关的行为。在麻醉后24小时期间，通过检测粪便中皮质酮代谢物来评估急性应激反应。

该方案为小鼠在全身麻醉后的健康状况提供了科学可靠的依据。由于其操作简便，该方案可轻松地被修改并整合到预设的研究中。尽管该方案并未提供依据欧盟指令2010/63对痛苦程度进行分类的分级标准，但其可帮助研究人员利用科学可靠的数据来评估实验操作的严重程度。该方案为以科学、动物为中心的方式改进健康状况评估提供了一种有效途径。

引言

欧盟指令2010/631规定，每当必须进行动物实验时，都应遵循Russel和Burch2提出的3R原则（替代、减少、优化）。该指令的最终目标是逐步淘汰所有动物实验；但指令也承认，目前仍需开展部分动物实验，以推进保护人类和动物健康的研究。因此，若动物实验无法被任何替代方法所取代，则应使用最少数量的实验动物以获得可靠结果。此外，应通过适当的优化措施，尽可能减少实验操作带来的疼痛、痛苦和应激。欧盟指令2010/63规定，必须前瞻性地将实验操作的严重程度分类为“无恢复期”、“轻度”、“中度”或“重度”1。由于严重程度的分类需基于个案评估，因此拥有科学可靠的工具来评估特定操作的严重程度显得尤为重要。

Morton 和 Griffith3 提出的评分表是检测动物状态是否偏离正常的重要工具，包括对动物福利产生负面影响的评估4。评分表用于回顾性地确定实验所引起的疼痛、痛苦和 distress，并重点关注个体动物身体状态的可见变化（例如，体重、毛发、步态）。尽管欧盟指令 2010/63 的附件 VIII 提供了每种严重程度类别的示例，研究人员仍然缺乏基于科学数据来评估特定实验操作严重程度的工具。

判断动物状态的依据不仅包括缺乏负面福利的指标，还包括存在积极福利的指标，后者同样重要5,6,7,8。例如，只有在所有基本需求得到满足时，动物才会表现出挖掘和筑巢等奢侈行为。当福利状况下降时，这些奢侈行为会最先减少5,7。用于评估动物福利的方案应包含反映动物身体、生理/生化及心理状态的指标，以实现对动物福利的全面、细致评价9。

在优化的背景下，本研究制定了一项满足上述要求的实验方案，用于评估涉及全身麻醉的操作对小鼠健康状况的影响10。同时，该方案旨在尽量减少额外的应激，以便于将其轻松整合到特定实验中。该方案涵盖掘穴行为、笼内行为（如活动性、摄食量和筑巢行为）以及与特质性焦虑相关的行为。此外，还包括小鼠面部表情评分（Mouse Grimace Scale, MGS）以及粪便中皮质酮代谢物的非侵入性分析。该方案的设计旨在以科学且以动物为中心的方式促进对健康状况的评估，并提供有助于判定实验严重程度分级的信息。除了评分表外，该方案还可为操作的严重程度分类提供有用的信息。由于该方案易于实施且无需复杂的设备，因此可在不影响研究结果的前提下整合到正在进行的实验中。需要注意的是，所有涉及动物实验的研究均应遵循《动物研究：体内实验报告指南》（Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments, ARRIVE）11，以提升实验设计、分析和报告的质量。

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方案

本研究遵循德国动物福利法规定的指南进行，并已获得柏林州当局（"Landesamt für Gesundheit und Soziales"，许可编号：G0053/15）的批准。

注意：本方案的主要目的是研究重复麻醉对糖皮质激素代谢物的影响。已进行样本量计算以确定所需使用的动物数量：n ≥ 2 × (s/µ1- µ2)2 × (zα + zβ)2。其中，µ1- µ2 表示进行功效与样本量计算时设定的总体均值差异（α = 5%，β = 80%）；zα = 1.96 和 zβ = 0.84 为标准正态分布的分位数。图1 展示了本方案的时间线。若方案中的某项参数与对照水平出现差异，应对动物进行密切监测，并在适当时间间隔后重新测量该参数。例如，若与特质焦虑相关的行为增加，则应在一周后再次测试该行为，以帮助确定完全恢复所需的时间。本方案中定义的时间点和时间段可根据其他实验程序进行调整。在更改时间点时，应按照本方案所述保留适应期。为减少可能影响小鼠行为的因素，应将需要较多操作的测试安排在不干扰小鼠正常行为的测试之后进行。图2 使用汇总评分表对本方案中的所有测试进行了总结。图3 提供了简化的健康状况评分等级，有助于整体解读测试结果。

1. 使小鼠适应实验人员的抓取操作

  1. 从其他机构或供应商处获得小鼠后，需让小鼠在动物设施中适应至少2周时间。
  2. 将小鼠群养，并在标准条件下饲养（室温22 ± 2 °C；相对湿度55 ± 10%），光照周期为12小时光照:12小时黑暗。
  3. 为所有组别提供隧道和棉质筑巢垫料作为常规环境丰富化措施，并自由供应食物和饮水ad libitum。
  4. 在测试前至少一周，使所有小鼠适应隧道和/或杯式抓取操作12。
    注意：通过尾巴抓取小鼠可能引发应激或焦虑反应，这不仅影响动物福利，还会对本实验方案的结果产生影响12。

2. 准备行为测试房间和仪器

注意：请提供一个独立的测试房间，最好靠近动物饲养的房间。在实验开始前至少60分钟，将小鼠连同其家笼一起转运至测试房间。如果条件允许，本方案中的所有测试均应在与实验操作相同的测试房间内进行。

  1. 准备观察笼以测试掘穴行为8 并拍摄照片用于MGS13 (图4).
    1. 使用一个底面积约为 220 mm × 290 mm、高度为 390 mm 的玻璃箱。
    2. 用约0.5 cm厚的垫料覆盖该盒子的底部。
    3. 在新垫料上撒少量来自原饲养笼的使用过的垫料，以减轻因新环境造成的应激。
    4. 提供食物（与日常饮食相同种类）和水。
      注意：如果可能，应使用饮水瓶，因为小鼠可能会将垫料填入饮水碗中。
  2. 准备一个III型笼具（420 mm × 260 mm × 150 mm），用于24小时观察期，期间小鼠单独饲养（图5).
    注意：为了尽量缩短单独饲养的时间，在此期间收集筑巢行为、家笼活动、食物摄入量和粪便皮质酮代谢物（FCM）的数据。
    1. 在笼子中放入新的垫料（约0.5 cm厚），并在新垫料上撒入一小把来自原笼、不含粪便的使用过的垫料，以减少动物的应激反应。
    2. 提供一个规定重量的标准化方形棉质筑巢材料，仅作为环境丰富化材料（参见 材料表)14.
      注意：商用巢材的重量可能有所不同。因此，我们对Deacon描述的巢材重量进行了调整，使用2.0 g而非2.7 g。14.
    3. 将红外传感器安装在笼子顶部，当使用红外传感器测量家笼活动时（参见 材料表).
    4. 提供食物（与日常饮食相同种类）和水 随意摄取.

3. 小鼠面部表情评分法

注意：MGS 的照片在观察笼中于三个时间点拍摄：（i）手术前 2 天，以记录 MGS 基线水平；（ii）手术后 30 分钟；（iii）手术后 150 分钟。当动物福利受损时，MGS 评分会上升。如果在手术后 150 分钟仍观察到 MGS 评分升高，应在更晚的时间点追加拍摄照片。

  1. 使用高清相机进行摄影。
  2. 轻柔地将小鼠转移至观察笼中，并让其在新环境中适应至少 30 分钟。
  3. 在 1 至 2 分钟内，为每个时间点连续拍摄约 30 至 40 张照片。
  4. 通过选择清晰的正面或侧面照片，并剔除模糊或非正面/侧面视角的小鼠面部照片，对所有照片进行筛选。
  5. 为每只小鼠从每个时间点（即 手术前 2 天、手术后 30 分钟和手术后 150 分钟）随机选取一张照片。
  6. 裁剪照片，仅显示小鼠头部，使身体位置不可见13。
  7. 创建一个电子表格文件，每张照片对应一个工作表，并在每个工作表中添加包含小鼠面部表情评分量表（MGS）五个面部动作单元的表格。
    注：该文件包含术前基线照片以及术后照片。
  8. 将工作表的顺序随机化。
  9. 在计算机屏幕上向三位经过培训、能够使用 Langford et al. 开发的 MGS 方法的独立评分者展示该文件，要求他们使用 3 分制量表（0 = 不存在，1 = 中等程度存在，2 = 明显存在）对各面部动作单元进行评分。
    注：评分依据以下参数13：眼眶收缩（"眼眶区域变窄，眼睑紧闭或眼睛挤压"）；鼻部隆起（"鼻梁处皮肤出现圆形凸起"）；颊部隆起（"颊肌呈现凸出外观"）；耳位变化（"耳朵从基线位置向后外侧拉伸，或因耳尖向后牵拉而形成垂直皱褶"）；胡须改变（"胡须从基线位置向后紧贴面部，或向前竖立；胡须也可能成簇聚集"）。
  10. 按以下方式分析评分结果（改编自 Langford et al.13）：
    1. 对每张照片的所有面部动作单元评分取平均值，得到该照片的 MGS 评分。
      注：若某一面部动作单元无法评分，则对剩余的面部动作单元评分取平均值。
    2. 用术后照片评分的均值减去基线照片评分的均值，得到每只小鼠的 MGS 差值评分。
    3. 采用非参数相关样本检验方法，检测不同评分者之间的 MGS 差值评分是否存在差异。
      注：若存在显著差异（p < 0.05），需判断是所有照片的评分还是仅少数照片的评分在评分者间存在差异。若为后者，则重新对这些照片进行评分；否则，评分者应重新接受 MGS 培训后再重新评分。
    4. 若各评分者的结果无显著差异，则对每只小鼠来自不同评分者的 MGS 差值评分取平均值。
    5. 采用非参数统计检验方法，比较各研究组之间的平均 MGS 差值评分。

4. 挖掘行为8,15,16

  1. 通过将通常作为饲料提供的 140 ± 2 g 食物颗粒放入标准不透明塑料水瓶（250 mL，长 150 mm，直径 55 mm，瓶口直径 45 mm）中制备洞穴8。
    注：由于小鼠偏好较宽的管道，可采用直径为 68 mm 的洞穴，如 Deacon 所述16。
  2. 在实验前 5 天将装有食物颗粒的洞穴放入小鼠的饲养笼中以适应环境。
    注：笼内常规的饲料供给装置不应清空，也应保持装有食物颗粒，因为小鼠已习惯这种设置。
  3. 在实验前 2 天进行两次测试（作为基线）；并在实验后 30 分钟再进行一次测试。
    1. 让小鼠在用于拍摄 MGS 照片的行为观察笼中适应至少 30 分钟。
    2. 将装有食物颗粒的塑料水瓶平行放置于行为观察笼的后壁。
    3. 2 小时后称量洞穴中剩余的食物颗粒重量（g）。
  4. 计算小鼠从洞穴中移走的食物颗粒重量占初始重量的百分比（%）。

5. 24小时观察期

注意：小鼠按 2.2 节所述单独饲养（图 5），持续 24 小时，以测量摄食量、家笼活动、筑巢行为及粪便皮质酮代谢物（FCM）水平。24 小时观察进行两次：（i）在操作前 2 天进行，以获取基线水平；（ii）在操作当天进行。

  1. 食物摄入量
    1. 定期称量小鼠体重（例如 麻醉前2天、麻醉前即刻、麻醉后2天以及此后每周一次），以评估体重变化（属于评分表的一部分）。
      注意：需要根据体重计算每克体重的食物摄入量。在24小时观察期内也可同时测量饮水量。若食物摄入量减少，可能提示动物福利状况受损。
    2. 测定笼内食盒中所提供的标准饲料的初始重量（克）（约100 g）。
    3. 测定24小时观察期结束时标准饲料的剩余重量。
    4. 仔细检查食盒下方笼壁是否有饲料洒落，并将发现的任何额外饲料颗粒加入食盒内剩余饲料颗粒的总重量中。
    5. 计算单位体重的食物摄入量。
  2. 家笼活动性
    注意：以下说明基于红外传感器的使用（见材料表），但也可使用其他替代程序评估家笼活动性。家笼活动性偏离对照水平（例如 活动减少、活动过度）可能提示动物福利状况受损。
    1. 启动程序。
    2. 设置采样间隔为1分钟，采集时间为24小时，即每分钟记录一次信号，持续24小时。
      注意：若实验人员在开始记录后多次进入房间，仅使用小鼠未受干扰期间的数据（即 黑暗期的数据）。
    3. 将每10分钟的信号次数进行累加。
    4. 计算时间-信号曲线下面积（信号次数 × 分钟）。
  3. 筑巢行为
    注意：结构复杂且较高的巢可作为动物福利状况良好的指标。
    1. 将一块已知重量的方形棉质筑巢垫料（见材料表）（例如 2.0 g）放置于笼子中央。
    2. 次日清晨（约光照开启后2小时），根据Deacon14的方法，采用5分制对巢进行评分。称量所有未撕碎的垫料碎片重量，仅计入重量不低于初始垫料重量5%的部分。巢的评分标准如下14：
      1. 若垫料完整度达90%，评分为"1"。
      2. 若垫料完整度为50–90%，评分为"2"。
      3. 若垫料有50–90%被撕碎，评分为"3"。
      4. 若超过90%的垫料被撕碎但巢较扁平，且其周长中高于蜷缩小鼠体高的部分不足50%，评分为"4"。
      5. 若超过90%的垫料被撕碎且巢较高，其周长中高于蜷缩小鼠体高的部分超过50%，评分为"5"。
  4. 粪便皮质酮代谢物
    注意：麻醉后24小时内，粪便皮质酮代谢物（FCM）浓度高于对照水平提示急性应激水平升高。
    1. 在24小时观察期结束时，使用镊子收集笼内所有干燥的粪便颗粒，并剔除被尿液污染的湿润颗粒。
    2. 按照Palme 等17的方法提取FCM，具体如下：
      1. 将粪便样品在60–70 °C条件下干燥。
      2. 使用研钵均质化粪便样品。
      3. 取0.05 g样品，加入1 mL 80%甲醇，置于离心管中，在多管涡旋振荡器上震荡30分钟。
      4. 在2500 × g条件下离心15分钟。
      5. 用移液器将0.5 mL上清液转移至另一离心管中。
      6. 将粪便样品（及提取物）储存于至少-18 °C条件下。
      7. 使用5α-孕烷-3b,11b,21-三醇-20-酮酶免疫分析法（EIA）18,19或其他完全验证过的EIA方法分析FCM。
    3. 计算FCM浓度相对于基线浓度的百分比变化。

6. 自由探索范式

  1. 在24小时观察期结束时，将动物笼从笼架中取出，并放置于实验台面上。
  2. 将一个带网格的笼盖（不带食物和水瓶）以45°角斜置于笼子较长边的一侧。
    注意：不要破坏小鼠用作藏身处的窝巢，应将笼盖对角线方向置于窝巢上方。
  3. 从约1.5米的距离处对小鼠进行观察或录像记录，持续10分钟。
    1. 启动计时器。
    2. 记录小鼠攀爬至笼盖上（四只脚均位于笼盖上）或离开笼盖（一只或以上脚接触笼底）的所有时间点。
      注意：部分小鼠可能爬上笼盖后沿笼边行走，或在笼盖上直立探查。此类行为应视为小鼠仍处于笼盖上。
  4. 参照Bert et al.20的方法评估相关参数。
    1. 分析首次探索的潜伏期（单位：秒）。
    2. 分析探索次数。
    3. 分析探索总持续时间（单位：秒）。
      注意：首次探索潜伏期较长、探索次数较少以及探索总持续时间较短，可能提示个体具有较高的特质性焦虑水平。

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结果

该方案最初旨在评估C57BL/6JRj小鼠在接受单次异氟烷麻醉（一次45分钟的麻醉过程，n = 13只雌性）或重复异氟烷麻醉（六次45分钟的麻醉过程，每次麻醉间隔3–4天，n = 13只雌性）后的健康状况，并与未接受麻醉的对照组小鼠（n = 6只雌性）10的健康状况进行比较，对照组小鼠虽未接受麻醉，但接受了相同的检测指标。我们评估了单次和重复异氟烷麻醉对C57BL/6JRj小鼠健康状况的影响，并与未经处理的对照组小鼠进行对比。本文展示了雌性C57BL/6JRj小鼠的代表性结果，其中包括Hohlbaum 等10先前发表的部分数据以及此前未发表的结果。

统计学分析

对每个参数进行探索性数据分...

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讨论

该方案最初旨在评估接受单次麻醉或重复异氟烷麻醉的C57BL/6JRj小鼠的健康状况。结果证实，奢侈行为测试及其他测量指标例如 自由探索范式、MGS、掘穴和摄食量是评估动物福利的敏感方法。重复使用异氟烷麻醉对特质焦虑相关行为、MGS以及掘穴行为产生了短期影响。此外，重复的异氟烷麻醉似乎还会影响摄食量10.

自由探索实验范式表明，与仅接受一次麻醉的小鼠及对照组小鼠相比，反复接受麻醉的小鼠表现出探索行为减少，因而特质性焦虑水平更高。然而，所有组别的小鼠均会探索带网格的笼子顶部10,20。在研究与焦虑相关的行为时，区分特质性焦虑和状态性焦虑非常重要21,22。将小鼠置于陌生环境中会诱发状态性焦虑。相反，自由探索实验范式允许动物停留在其居住的笼子中，从而用于检测特质性焦虑。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Sabine Jacobs协助样本采集，Edith Klobetz-Rassam进行流式细胞术（FCM）分析，PD Dr. med. vet. habil. Roswitha Merle协助统计分析，以及Wiebke Gentner对手稿的校对。本研究是柏林-勃兰登堡研究平台BB3R（www.bb3r.de）的一部分，由德国联邦教育与研究部资助（项目编号：031A262A）（www.bmbf.de/en/index.html）。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH1214
InfraMot - 传感器单元TSE Systems302015-SENS
InfraMot - 控制单元TSE Systems302015-C/16
InfraMot - 软件TSE Systems302015-S
Nestlet NAncare - PlexxNES3600
相机 EOS 350DCanon

参考文献

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