基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

摘要

目前用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒的多重诊断方法需要复杂的样品制备过程和昂贵的仪器设备，难以在资源有限的环境中应用。我们展示了一种基于等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针的诊断方法，可高灵敏度、高特异性地检测并区分这些病毒。

摘要

寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒通过蚊子传播，引起的疾病症状相似。然而，这些病毒在人与人之间的传播潜力不同，且需要截然不同的治疗方法。因此，近期寨卡病毒的暴发迫切需要开发能够快速区分患者及捕获蚊子体内这些病毒的工具，以选择正确的治疗方案，并实时了解和管理其流行病学情况。

遗憾的是，目前的诊断检测方法（包括2016年获得紧急使用授权和快速审批资格的检测）均依赖于通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）来检测病毒RNA，该方法需要专用仪器、经过培训的操作人员以及复杂的样本前处理。因此，这些检测必须送往"经批准"的参考实验室进行，耗时较长。事实上，2016年8月，美国疾病控制与预防中心（CDC）曾要求被蚊子叮咬并出现提示寨卡病毒感染皮疹的孕妇，在无法接受的情况下等待2至4周才能获知是否感染。我们迫切需要能够在现场进行、资源需求少、且可由经过培训但无需持证的专业人员操作的检测方法。

本视频展示了一种符合上述要求的检测方法，可用于尿液或血清（针对患者）以及研磨后的蚊虫尸体（用于环境监测），且无需复杂的样本前处理。蚊虫尸体被截留在含有季铵盐基团的滤纸（Q-纸）上，随后通过氨处理以控制生物危害。处理后的样本无需进行RNA提取，可直接加入含有冻干试剂的检测管中，试剂无需冷链运输和储存。采用一种改良的逆转录环介导等温扩增技术，配合靶标特异性的荧光标记可置换探针，可在30分钟内产生三色荧光信号作为读出结果。信号通过带有橙色滤光片的手持式电池供电设备进行观察。检测过程中采用密封管防止扩增产物的前向污染，同时在扩增体系中加入dUTP和热不稳定的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）以进一步控制污染。

引言

蚊媒病毒性感染，包括登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒，正在不断上升，亟需立即采取管理策略。登革热病毒和基孔肯雅热病毒已在许多热带地区呈地方性流行，而寨卡病毒目前正蔓延至西半球¹。寨卡病毒与登革热病毒同属黄病毒科（Flaviviridae），起源于非洲，包含一个亚洲型和两个非洲型基因谱系²。尽管寨卡病毒早在1947年即被发现，但在随后的半个世纪中，人类感染病例一直呈零星分布，直到近年来在太平洋地区和美洲暴发。首次报告的寨卡热疫情发生于2007年密克罗尼西亚联邦的雅普岛，随后于2013年和2014年在法属波利尼西亚暴发。美洲地区的首次大规模疫情则发生于2015年的巴西。

寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播。然而，寨卡病毒还存在其他间接的人际传播途径，可能通过性接触、母婴垂直传播以及哺乳传播^3,4,5。最初认为寨卡热仅引起轻微病症，但后来发现其与成人吉兰-巴雷综合征、新生儿小头畸形以及可持续数月甚至数年的慢性肌肉骨骼疾病相关。由于寨卡病毒感染的症状与其他蚊媒传播....

方案

注意：蚊子是本研究中唯一直接使用的动物。用于饲养感染蚊子的鸡的管理程序已获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，方案编号为#201507682。病毒扩增和蚊子感染研究在佛罗里达州维罗海滩佛罗里达医学昆虫学实验室的生物安全三级（BSL-3）设施中进行。RT-LAMP实验在佛罗里达州阿拉楚阿由FfAME与Firebird Biomolecular Sciences LLC共享的生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。

1. 引物和链置换探针的设计

1. 从布罗德研究所数据库中提取登革热1型病毒序列²³；寨卡病毒和基孔肯雅病毒的序列来自美国国家过敏与传染病研究所病毒病原体数据库与分析资源²⁴.
   1. 使用软件 MUSCLE v3.8.31 为目标序列创建多序列比对（MSAs）²⁵利用生成的多序列比对结果，在目标序列的保守区域内搜索LAMP引物组，并避免非相关或非特异性目标，例如目标序列不同亚型之间的差异。
2. 遵循在线描述的LAMP引物设计规则（http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/），并在引物中允许使用混合碱基以覆盖病毒的多样性²⁶为避免引物组之间的交叉反应，使用....

结果

最初，对每对RT-LAMP引物的性能进行评估 （表1） 及其相应的病毒RNA底物以及阴性对照通过凝胶电泳进行评估。RT-LAMP引物设计用于靶向寨卡病毒和登革病毒1型的NS5区域（RNA依赖性RNA聚合酶）以及基孔肯雅病毒的nsP2区域（非结构蛋白P2）。模板为从在非洲绿猴肾（Vero）细胞中培养的病毒储备液中提取的总RNA。在某一情况下，从一名感染基孔肯雅病毒的女性体内提取了总核酸（DNA和RNA） 埃及伊蚊 （表2）.

图 2A 展示了使用这些样本进行 RT-LAMP 所得的一些代表性结果。在单重和多重（三重）反应中，RT-LAMP 产物在琼脂糖凝胶电泳中均呈现为串联重复片段组成的梯状条带。以水作为样本的阴性对照仅出现引物自身形成的条带，其中包括非特异性靶标对照，该对照以未感染的埃及伊蚊（Ae. .......

讨论

包括寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒在内的蚊媒病毒对公共卫生构成威胁，近期寨卡病毒的暴发凸显了开发低成本即时检测方法的迫切需求，不仅用于患者诊断，也用于蚊媒监测。等温扩增技术被开发为比基于PCR的系统更经济的替代方案。特别是基于逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）的平台已被应用于检测多种病原体。然而，等温扩增平台的应用主要局限于单一目标检测。本文报道的方法采用一种改良的RT-LAMP技术，可在单个反应体系中同时检测三个不同的目标，反应在中等温度范围（65–68 °C）下进行，该温度条件已被证明特别有利，因为高于60 °C的温度可使寨卡病毒及其他病毒失去感染性^30,35。

此外，本文提供的数据显示，RT-LAMP 能够耐受可能存在于各种生物液体中的抑制性物质¹⁵。这使得病毒RNA无需经过额外的RNA纯化步骤，可直接将样本加入反应体系中进行扩增。根据样本类型的不同，需确定允许添加的最大样本体积，以避免抑制反应或引起背景荧.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SafeBlue 照明仪/电泳系统，MBE-150-PLUS	Major Science	MBE-150	凝胶电泳
G:BOX F3	Syngene	G:BOX F3	凝胶成像
LightCycler 480 仪器 II，96 孔	Roche Applied Science	05 015 278 001	实时 PCR
Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元，含 Ultracel-10 膜	Millipore Sigma	UFC501096	透析用超滤膜
Eppendorf 5417C 离心机	Marshall Scientific	EP-5417C	离心机
Myblock Mini Drybath	Benchmark Scientific	BSH200	干浴器
FreeZone Plus 6 升级联控制台冷冻干燥系统	Labconco	7934020	冻干机
所有引物和探针	IDT	定制	RT-LAMP 引物和探针
dNTP 混合物	Bioline	BIO-39049
脱氧尿苷三磷酸（dUTP）	Promega	U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0538L	酶
WarmStart RTx 逆转录酶	New England Biolabs	M0380L	酶
鼠源 RNase 抑制剂	New England Biolabs	M0314L	酶
南极热不稳定 UDG	New England Biolabs	M0372L	酶
50 bp DNA 阶梯标记物	Promega	G4521	标记物
LightCycler 480 96 孔白色多孔板	Roche Applied Science	4729692001	实时 RT-LAMP 分析