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方法文章

高分辨率呼吸测定法测量天然化合物存在下完整β细胞的线粒体功能

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DOI：

10.3791/57053

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2018年1月23日

 ,  ,  , 
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

本文内容

摘要

本实验方案的目的是利用高分辨率呼吸测定法，在天然化合物存在的条件下，测量葡萄糖介导的线粒体呼吸变化对完整832/13 β细胞的影响。

摘要

高分辨率呼吸测定法可用于测量分离的线粒体、细胞和组织的耗氧量。β细胞通过响应升高的葡萄糖浓度而分泌胰岛素，从而在体内发挥调控血糖水平的关键作用。胰岛素的分泌受葡萄糖代谢和线粒体呼吸的调控。因此，测量完整β细胞的呼吸功能对于改善β细胞功能以治疗糖尿病具有重要意义。利用完整的832/13 INS-1衍生β细胞，我们可以测定葡萄糖浓度升高对细胞呼吸的影响。本实验方案使我们能够在有或无各种化合物的条件下测量β细胞的呼吸，从而确定特定化合物对完整细胞呼吸的影响。本文展示了两种天然存在的化合物——单体表儿茶素和姜黄素——在低葡萄糖（2.5 mM）或高葡萄糖（16.7 mM）条件下对β细胞呼吸的影响。该技术可用于研究不同葡萄糖浓度存在时，各种化合物对完整β细胞呼吸的影响。

引言

胰腺β细胞的主要功能是通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌来维持机体的正常血糖水平。β细胞对循环中葡萄糖的生理变化的感知主要依赖于低亲和力、高容量的葡萄糖转运蛋白GLUT2（葡萄糖转运蛋白2，Km 16.7 mM）1。当循环中的葡萄糖水平升高时，这种高容量低亲和力的转运蛋白促使β细胞内葡萄糖浓度呈比例增加。葡萄糖通过糖酵解、三羧酸循环（TCA循环）和线粒体呼吸进行代谢，导致细胞内ATP（三磷酸腺苷）水平升高。升高的ATP浓度会阻断ATP敏感性K+通道，引起细胞膜去极化。膜去极化导致电压门控Ca2+通道开放，进而释放囊泡结合的胰岛素颗粒2。β细胞功能障碍是2型糖尿病（T2D）的典型特征，会导致胰岛素分泌减少且调控不良，最终引发β细胞死亡3。能够维持或改善β细胞功能的机制可被开发为T2D的治疗手段。

研究表明，天然存在的植物性化合物对胰腺β细胞具有有益作用4。这些化合物可能通过促进β细胞增殖、提高其存活率或增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌而发挥作用。例如，近期研究发现，单体表儿茶素可通过增强线粒体呼吸作用和提高细胞内ATP水平，从而促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌5。因此，阐明这些化合物如何增加功能性β细胞质量，对于将其开发为潜在治疗药物具有重要意义。

细胞呼吸可通过多种工具进行测量。使用高分辨率呼吸测量仪可对透化或完整细胞群体进行化学调节剂的滴定6。该工具允许添加不同浓度的多种化合物，从而提供大量信息。

鉴于葡萄糖代谢与β细胞功能之间存在密切关联，细胞呼吸的测定至关重要。细胞呼吸的测定可采用透化或完整β细胞进行，两种方法各有其优势与局限性7,8。虽然β细胞透化法能够用于检测电子传递链的不同组分，但无法反映β细胞中诱导呼吸的机制，如葡萄糖的摄取与代谢过程。因此，采用非透化β细胞进行呼吸测定是一种非常有用的技术，可通过氧消耗量作为读数，评估β细胞对不同葡萄糖浓度的反应。

该技术的目的是测量完整的INS-1来源的832/13胰岛β细胞中的氧气消耗。该技术使我们能够确定β细胞在非刺激性葡萄糖条件（2.5 mM葡萄糖）以及刺激性葡萄糖条件（16.7 mM葡萄糖）下的反应。尽管未透化的细胞不允许我们单独检测电子传递链中的复合物I、II或III，但该技术可用于测量复合物IV抑制（寡霉素A）、解偶联呼吸（FCCP-羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙）以及完全抑制呼吸（抗霉素A）相关指标。本研究展示了在完整的未透化胰岛β细胞中测量呼吸作用的有效性，以及两种天然存在的化合物——单体表儿茶素和姜黄素——对β细胞呼吸的影响。

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方案

1. 细胞培养

  1. 在 RPMI 1640 培养基中培养源自 INS-1 的 832/13 胰岛β细胞，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素、10 mM HEPES、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和 0.05 mM 2-巯基乙醇9,10,11,12,13。
  2. 使用 2 mL 0.25% 胰蛋白酶从 T75 培养瓶中消化 832/13 细胞，在 37 °C 下孵育 10 分钟。加入 8 mL 完全 RPMI 1640 培养基以中和胰蛋白酶活性。
  3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将步骤 1.2 中获得的细胞悬液取 100 µL 与 900 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）混合稀释。
  4. 以 2 × 106 个细胞/mL 的密度将 832/13 细胞接种至 6 孔板中。
  5. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中培养 48 小时，然后开始呼吸实验。

2. 高分辨率呼吸测定法所需细胞的制备

  1. 用可可来源的表儿茶素单体处理832/13细胞。
    1. 将832/13细胞接种后，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养24小时。
    2. 接种24小时后更换培养基，用溶剂对照（3孔）或100 nM可可单体（3孔）处理832/13细胞，随后在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续培养24小时（总计48小时）。
    3. 用1x低葡萄糖分泌检测缓冲液（SAB）洗涤832/13细胞5分钟。吸除缓冲液后，将832/13细胞在1x低葡萄糖SAB中孵育3小时，每小时更换一次1x低葡萄糖SAB。
      1. 使用33.32 g NaCl、1.73 g KCl、0.82 g KH2PO4、0.7 g MgSO4，加H2O至终体积500 mL，配制10x SAB。将最终溶液经无菌滤膜过滤。
      2. 取10 mL 10x SAB、100 µL 45%葡萄糖、2 mL 1 M HEPES、1 mL 0.25 M CaCl2、0.57 mL 35% BSA溶液、0.21 g NaHCO3，加H2O至终体积100 mL，配制1x低葡萄糖SAB。将最终溶液经无菌滤膜过滤。
  2. 用姜黄素处理832/13细胞。
    1. 将832/13细胞接种后，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养48小时。
    2. 用1x低葡萄糖SAB洗涤832/13细胞5分钟。吸除缓冲液后，将832/13细胞在1x低葡萄糖SAB中孵育3小时，每小时更换一次1x低葡萄糖SAB。
    3. 在1x低葡萄糖SAB中孵育2.5小时后，吸除缓冲液，将细胞在含溶剂对照或40 µM姜黄素的1x低葡萄糖SAB中继续孵育30分钟。孵育结束后吸除缓冲液。
  3. 用胰酶消化收获细胞用于高分辨率呼吸测定
    1. 在1x低葡萄糖SAB中孵育3小时后，每孔加入250 µL 0.25%胰酶，从培养板上消化细胞。
    2. 将经溶剂对照或待测化合物处理的3孔细胞与胰酶混合液转移至15 mL锥形管中，加入4 mL SAB混匀。
    3. 使用血细胞计数板计数细胞，并将步骤2.3.2中细胞悬液取100 µL稀释于900 µL PBS中。
    4. 将适量数量的细胞用1x低葡萄糖SAB稀释，使每个检测腔室加入3 mL适当浓度的细胞悬液。实验数据显示，1 × 106 个细胞/mL的浓度最为有效。
  4. 通过机械解离法收获细胞用于高分辨率呼吸测定
    1. 在1x低葡萄糖SAB中孵育3小时后，每孔加入1 mL 1x低葡萄糖SAB，使用1000 µL移液枪头通过反复吹打进行机械解离，使细胞从培养板上脱落。
    2. 将经溶剂对照或待测化合物处理的3孔细胞合并至15 mL锥形管中，总体积为3 mL SAB，用于后续呼吸测定。

3. 高分辨率呼吸测定法

  1. 高分辨率呼吸测定仪的制备
    1. 打开高分辨率呼吸测定仪，并通过启动呼吸测定仪分析程序将其连接至桌面计算机。
    2. 吸出两个腔室中的70%乙醇。将这些腔室浸泡在70%乙醇中至少45分钟。
    3. 用70%乙醇清洗腔室两次，每次清洗后抽吸除去乙醇。
    4. 用ddH₂O洗涤小室三次2每次操作后进行吸液。
    5. 用ddH₂O冲洗腔室柱塞2O. 此步骤可清除活塞和钛端口上残留的乙醇。
  2. 极谱法氧气传感器的校准
    1. 向每个氧电极室中加入 2.4 mL 1x 低葡萄糖 SAB 缓冲液，在室中使用磁力搅拌子以 750 rpm 转速持续搅拌，温度维持在 37 °C，通过按下 F7 按钮并打开标有相应标签的选项卡，设置数据记录间隔为 2.0 s "系统"将活塞完全推入，然后回撤至扳手通气位置。让仪器至少平衡1小时，直至获得稳定的氧气通量。
    2. 将仪器在整个实验过程中设定为 37 °C。将极化电压设为 800 mV，通过按下 F7 按钮并将标有相应标签的选项卡打开，增益设为 2。 "氧气，O2"将SAB缓冲液的氧浓度平衡至少30分钟，直至氧浓度变化稳定（小于2 pmol/(s*mL)）。
    3. 在氧浓度稳定后，选择氧浓度变化稳定的区域，以建立氧浓度变化的背景测量值。
      1. 按住 Shift 键，同时用鼠标左键点击并拖动以选择区域。点击所选区域对应的字母并进行更改 "R1" 每条轨迹对应两个腔室中的每一个。
      2. 双击 "O2 校准" 屏幕左下角和右下角的方框，单击 "选择标记" 按钮用于 "空气校准" 作为R1，然后选择 "校准并复制到剪贴板" 两个腔室均需如此。
  3. 评估在步骤 2.1.5 或 2.2.5 中制备的 832/13 胰岛β细胞的呼吸功能
    1. 在每个腔室中加入2.4 mL样品（一个腔室加入经对照载体处理的细胞，另一个腔室加入经化合物处理的细胞），培养基于1x低糖SAB中。若采用机械解离法，需保留0.5 mL细胞样品用于BCA（双辛可宁酸）法蛋白定量（可于-20 °C冷冻保存，后续检测）。
      1. 将活塞完全推入并吸取残留体积。在整个实验过程中，以750 rpm、37 °C持续搅拌细胞，后续所有步骤均需保持此条件。通过点击F4并标记为 "细胞" 当样品上样时。
      2. 测量样品30分钟。信号稳定后，选择氧浓度变化的区域，对应于低葡萄糖条件（2.5 mM葡萄糖），具体方法如3.2.3所述。
    2. 信号稳定后，使用注射器通过钛加载端口向每个腔室加入12.5 µL无菌45%葡萄糖溶液（终浓度为16.7 mM）。标记测量值 "葡萄糖" 如3.3.1节所述添加处理因素后，待信号稳定，记录细胞呼吸直至获得稳定的氧通量。选择氧浓度变化的这一区域，具体方法见3.2.3节。此即16.7 mM葡萄糖读数，对应于刺激条件7.
    3. 信号稳定后，通过加样孔向每个腔室加入1 µL 5 mM 寡霉素A（终浓度为2.5 µM）。做好标记并测量 "OligoA" 如3.3.1节所述加入处理因素后，待信号稳定，持续记录细胞呼吸，直至获得稳定的氧通量。按照3.2.3节所述方法选择曲线的该区域。寡霉素A可抑制ATP合酶，因此此时的氧通量仅来源于电子泄漏，而非氧化磷酸化。7.
    4. 信号稳定后，以1 µL为增量逐次加入1 mM FCCP，直至呼吸速率达到最大，此即最大非耦合呼吸。对于INS-1 832/13细胞，通常加入3–4 µL FCCP（终浓度1.5–2.0 µM）即可诱导最大非耦合呼吸。标记为 "FCCP" 如3.3.1所述，在加入处理剂后，待信号稳定，记录细胞呼吸直至获得稳定的氧通量。按照3.2.3所述方法选择曲线的该区域。FCCP是一种解偶联剂，可用于测量解偶联呼吸。7.
    5. 信号稳定后，通过加样孔向每个腔室中加入 1 µL 5 mM 抗霉素 A（终浓度为 2.5 µM）。标记一个标签 "抗A" 如3.3.1所述添加处理后，等待信号稳定，并记录细胞呼吸直至获得稳定的氧通量。按照3.2.3所述方法选择曲线的该区域。
      注意：抗霉素A可结合细胞色素C还原酶，抑制泛醌氧化，并阻断全部呼吸作用。这使我们能够完全终止呼吸。7.
  4. 测量832/13 β细胞的蛋白浓度并用于呼吸作用归一化。
    1. 使用上样时保留的0.5 mL样品，采用BCA法测定蛋白质浓度13.
    2. 每个样本按原液进行三次重复检测，具体操作遵循试剂盒说明书。
  5. 832/13 胰岛β细胞呼吸计算（来自胰蛋白酶消化的细胞）.
    1. 使用呼吸计分析程序时，按下 F3 按钮输入检测所用的每毫升细胞数量。将单位更改为 cells/mL，输入细胞浓度，并将培养基更改为 SAB。
    2. 选择背景读数以标准化数据，方法是选择并输入 O2 校准表单，如3.2.3节所述
    3. 选择 2.5 mM 葡萄糖、16.7 mM 葡萄糖、寡霉素 A（Oligomycin A）、FCCP 和抗霉素 A（Antimycin A）的读数，具体操作如 3.3.1 节所述。
    4. 在呼吸仪分析程序中，输入蛋白质浓度并选择呼吸测量过程中每种处理的相应平均值后，导出每个腔室的读数。此操作通过点击 F2，然后按下 "复制到剪贴板功能"。这将导出数据以供在其他分析程序中使用。使用 "O2 斜率负值" 用于计算的数值。
    5. 汇总3至5次独立实验中经溶剂处理的对照组和天然化合物处理的细胞数据，以确定其对INS-1 832/13 β细胞完整细胞呼吸作用的影响。
  6. 832/13 来自机械分离细胞的β细胞呼吸计算.
    1. 通过按下呼吸计分析程序中的 F3 按钮输入 BCA 测定的蛋白质计算结果。将单位更改为 mg，输入 BCA 浓度，并将培养基更改为 SAB。
    2. 选择背景读数以标准化数据，方法是选择并输入到 O2 校准表单，如3.2.3节所述
    3. 选择 2.5 mM 葡萄糖、16.7 mM 葡萄糖、寡霉素 A、FCCP 和抗霉素 A 的读数，具体操作如 3.3.1 节所述。
    4. 在呼吸仪分析程序中，输入蛋白浓度并选择呼吸测量过程中每种处理的相应平均值后，导出每个腔室的读数。此操作通过点击 F2，然后按下 "复制到剪贴板功能"。这将数据导出以供其他分析程序使用。使用 "O2 斜率负值" 用于计算的数值。
    5. 汇总3至5次独立实验的数据，包括溶剂处理的对照组和天然化合物处理的INS-1 832/13 β细胞，以评估其对细胞完整呼吸功能的影响。

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结果

按照本方案所述方法制备和收获的 INS-1 832/13 胰岛β细胞，将表现出因不同化学干预而产生的氧消耗变化（图 1A）。当葡萄糖浓度升高至 16.7 mM 时，可观察到呼吸作用增强（图 1B）。当完整细胞经寡霉素 A（Oligomycin A）处理后，呼吸作用将下降。此呼吸状态称为“质子漏呼吸”（LEAK），定义为基础的、非磷酸化的呼吸状态。当β细胞经解偶联剂 FCCP 处理时，将达到最大呼吸速率，此状态称为 ETS 呼吸（电子传递系统呼吸）。最后，当细胞经抗霉素 A（Antimycin A）处理后，呼吸作用将降至零，此阶段标记为 ROX（残余氧消耗），代表非呼吸性细胞耗氧。

细胞数量的差异会显著影响该技术所获得数据的质量。在 0.5、1 和 2 × 106 个细胞/mL 条件下测量了葡萄糖诱导的呼吸作用（图 2A–2C）。通过细胞计数和 BCA...

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讨论

本实验方案的目的是利用高分辨率测氧法测定完整胰岛β细胞的呼吸速率。该方法可用于测量β细胞对葡萄糖浓度升高的反应。本方案还允许在实验前使用多种不同化合物进行预处理，例如本方案中所展示的天然单体表儿茶素或姜黄素4,5。此外，也可在本方案基础上稍作调整，用于其他化合物的处理，既可采用预处理方式（如本文所示），也可直接在呼吸室中加入化合物进行处理。

该方法可通过多种方式进行修改。可使用其他β细胞系；然而，细胞数量和SAB洗涤时间需通过实验确定。也可使用原代啮齿类动物和人胰岛；但是，细胞数量或胰岛当量也需通过实验确定。至少有一项研究采用高分辨率呼吸测定法测量了胰岛的耗氧量15。该研究每个反应需要400个胰岛，但未检测葡萄糖诱导的呼吸变化。鉴于原代组织常与高分辨率呼吸测定仪联合使用

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Tessem实验室和Hancock实验室成员提供的协助与科学讨论。作者感谢弗吉尼亚理工大学的Andrew Neilson博士提供可可来源的表儿茶素单体组分。本研究得到了糖尿病行动研究与教育基金会向JST提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
O2k 核心设备：Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02用于高分辨率呼吸测定的仪器
DatLab 6 程序Oroboros Instruments27141-01用于分析高分辨率呼吸测定数据的计算机程序
INS-1 832/13 细胞系Duke University Medical CenterNONEβ细胞系，由 Christopher Newgard 博士惠赠
姜黄素SigmaC7727β细胞预处理
可可表儿茶素单体Virginia Polytechnic Institute and State UniversityNONEβ细胞预处理，由 Andrew Neilson 博士惠赠
胰蛋白酶SigmaT4049用于细胞培养
RPMI-1640SigmaR8758832/13 β细胞培养基
胎牛血清HycloneSH30071.03832/13 β细胞培养基组分
青霉素-链霉素SigmaP4458832/13 β细胞培养基组分
HEPESSigmaH3662832/13 β细胞培养基组分 / 1x SAB 缓冲液
谷氨酰胺CaissonGLL01832/13 β细胞培养基组分
丙酮酸钠SigmaS8636832/13 β细胞培养基组分
2-巯基乙醇SigmaM3148832/13 β细胞培养基组分
NaClFisherS27110x SAB 缓冲液组分
KClSigmaP954110x SAB 缓冲液组分
KH2PO4SigmaP565510x SAB 缓冲液组分
MgSO4SigmaM264310x SAB 缓冲液组分
D-(+)-葡萄糖溶液SigmaG87691x SAB 缓冲液组分，呼吸测定用化学试剂
CaCl2SigmaC56701x SAB 缓冲液组分
35% BSA 溶液SigmaA79791x SAB 缓冲液组分
NaHCO3SigmaS57611x SAB 缓冲液组分
200 证明乙醇Sigma459844清洗 Oxygraph O2k 检测室
寡霉素 ASigmaO4876呼吸测定用化学试剂
FCCPSigmaC2920呼吸测定用化学试剂
抗霉素 ASigmaA8674呼吸测定用化学试剂
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Fisher23225用于测定蛋白浓度

参考文献

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