方法文章

在天然化合物存在下测定完整β细胞线粒体功能的高分辨率呼吸

DOI：

10.3791/57053

⸱

2018年1月23日

 ,  ,  , 
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议的目的是测量葡萄糖介导的变化对线粒体呼吸的影响, 在天然化合物的存在, 在完整的832/13 β细胞使用高分辨率呼吸。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高分辨率呼吸允许测量分离的线粒体、细胞和组织的耗氧量。β细胞通过控制血糖水平, 通过胰岛素分泌来调节血糖浓度, 从而在体内发挥关键作用。胰岛素分泌受葡萄糖代谢和线粒体呼吸的控制。因此, 测量完整的β细胞呼吸是必不可少的, 以提高β细胞功能作为治疗糖尿病。使用完整的 832/13 INS-1 衍生的β细胞, 我们可以测量增加葡萄糖浓度对细胞呼吸的影响。这个协议允许我们测量β细胞呼吸在存在或没有各种各样的化合物, 允许一个确定特定化合物的作用在原封细胞呼吸。在这里, 我们展示了两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素, 对β细胞呼吸在低 (2.5 毫米) 或高糖 (16.7 毫米) 条件下的作用。这种技术可以用来确定不同的化合物对完整的β细胞呼吸在不同的葡萄糖浓度存在的影响。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胰β细胞的主要目的是维持系统血糖通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌。β细胞感觉循环葡萄糖的生理变化主要归结于低亲和力, 高容量葡萄糖转运器 GLUT2 (葡萄糖运输者 2, Km 16.7 毫米)1。随着循环葡萄糖水平的升高, 这种高容量低亲和力转运体促进了β细胞内葡萄糖的比例增加。葡萄糖通过糖酵解、TCA 循环 (三酸循环) 和线粒体呼吸导致细胞 ATP (三磷酸腺苷) 水平的升高而代谢。atp 浓度升高会阻止 atp 敏感的 K+通道, 从而导致膜去极化。膜去极化导致电压门控 Ca 的开放2 +通道和随后释放囊泡胰岛素颗粒2。β细胞功能障碍是2型糖尿病 (T2D) 的标志, 其结果是减少和控制不良的胰岛素分泌和最终的β细胞死亡3。维持或改善β细胞功能的机制可用于治疗 T2D。

研究已经证明了自然发生的植物基化合物对胰腺β细胞4的有益作用。这些化合物可能通过增加β细胞增殖、存活或葡萄糖刺激的胰岛素分泌而产生作用。例如, 最近的研究表明, 单体儿茶通过增加线粒体呼吸和增加细胞 ATP 水平来增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌5。因此, 了解这些化合物如何能增加功能性β细胞质量, 是很重要的利用这些化合物作为潜在的疗法。

细胞呼吸可以通过一些工具来测量。使用高分辨率呼吸允许滴定化学调节剂到化或完整的细胞数量6。该工具允许在不同浓度下添加各种化合物, 从而提供广泛的信息。

鉴于葡萄糖代谢和β细胞功能之间的密切联系, 细胞呼吸的测量是至关重要的。细胞呼吸的测量可以使用化或完整的β细胞进行, 每一个都有自己的优缺点7,8。虽然β细胞的性允许人们测量电子传输链的不同方面, 但它不考虑在β细胞、葡萄糖摄取和新陈代谢中诱导呼吸的机制。因此, 使用 unpermeabilized β细胞呼吸是一种非常有用的技术来确定β细胞对各种葡萄糖水平的反应, 使用氧气消耗量作为读数。

该技术的目的是测量完整的 INS-1 832/13 β细胞的耗氧量。这项技术使我们能够确定β细胞对 unstimulatory 葡萄糖 (2.5 mm 葡萄糖) 的反应以及刺激葡萄糖条件 (16.7 毫米葡萄糖)。虽然 unpermeabilized 细胞不允许我们单独测试电子传输链的复杂 I、II 或 III, 但该技术允许测量复杂的 IV 抑制 (寡 A), 不耦合呼吸 (FCCP-羰基氰化物-4-三氟甲氧基腙), 完全抑制呼吸 (Antimycin A)。这项研究证明了测量呼吸在完整的 unpermeabilized 胰腺β细胞的功效, 以及两种自然发生的化合物, 单体儿茶和姜黄素对β细胞呼吸的影响。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 细胞培养

  1. 培养 INS-1 获得832/13 β细胞在 RPMI 1640 补充与10% 胎牛血清 (FBS), 1% 青霉素-链霉素, 10 毫米 HEPES, 2 毫米谷氨酰胺, 1 毫米钠丙酮酸盐, 和0.05 毫米 2-基9,10,11 ,12,13。
  2. 用2毫升0.25% 的胰蛋白酶从 T75 烧瓶中取出832/13 细胞, 在37° c 下孵育10分钟, 加入8毫升的完整 RPMI 1640 介质。
  3. 计算细胞使用例和稀释100µL 的细胞体积从步骤1.2 在900µL 的 PBS。
  4. 在6井盘中, 在密度为 2 x 106细胞/mL 的情况下, 将832/13 细胞板。
  5. 在开始呼吸实验之前, 在37° c 和 5% CO2的湿恒温箱中培养细胞为 48 h。

2. 高分辨率呼吸细胞的制备

  1. 用可可儿茶单体处理832/13 细胞。
    1. 在37° c 和 5% CO2的湿恒温箱中电镀后培养832/13 细胞24小时。
    2. 改变媒体24小时后电镀, 并处理832/13 细胞与车辆控制 (3 口井) 或100纳米可可单体 (3 口井), 其次是文化的一个额外的 24 h (48 h 共计) 在湿化孵化器在37° c 和 5% CO2。
    3. 在1x 低葡萄糖分泌物检测缓冲液中洗涤832/13 细胞, 在1x 低血糖的5分钟内孵育832/13 细胞, 每小时改变1x 低血糖浓度。
      1. 用33.32 克氯化钠, 1.73 克氯化钾, 0.82 克2PO4, 0.7 克 MgSO4 , 并将 H2O 添加到最终的500毫升。无菌过滤器的最终解决方案。
      2. 用10毫升10x 的低血糖的 1x, 100 µL 45% 葡萄糖, 2 毫升的1米 HEPES, 1 毫升的 0.25M CaCl2, 0.57 毫升的 35% BSA 溶液, 0.21 g 的 NaHCO3 , 并添加 H2O 到最后的体积100毫升。无菌过滤器的最终解决方案。
  2. 用姜黄素治疗832/13 细胞。
    1. 在37° c 和 5% CO2的湿恒温箱中电镀后培养832/13 细胞48小时。
    2. 在1x 低血糖的5分钟内冲洗832/13 细胞, 在1x 的低血糖浓度下孵育832/13 细胞, 每小时更换1x 低血糖。
    3. 在1x 低血糖的 3 h 孵化后 2.5 h, 吸气缓冲和孵育细胞在1x 低血糖审计与车辆控制或40µM 姜黄素30分钟。继孵育后, 吸气缓冲液。
  3. 高分辨率呼吸的胰蛋白酶捕获细胞
    1. 在1x 低血糖的 3 h 孵化后, 从板上取出细胞, 每井250µL 0.25% 胰蛋白酶。
    2. 在15毫升锥形管中, 将胰酶中的细胞与汽车控制或复利的4毫升的3口井结合起来。
    3. 使用例的计数细胞和稀释100µL 的细胞体积从步骤2.3.2 在900µL PBS。
    4. 稀释1x 低血糖局的适当数量的细胞, 使每个腔室的适当浓度为3毫升。数据显示 1 x 106单元/mL 的浓度是最有效的。
  4. 高分辨率呼吸的机械离解收获细胞
    1. 在1x 低血糖的 3 h 孵化后, 增加1毫升的1x 低血糖, 每井, 轻轻地吹离板的细胞与机械离解移与1000µL 吸管尖端。
    2. 将3口井中的细胞与车辆控制或复利结合在一起, 在15毫升的锥形管中进行呼吸, 共3毫升。

3. 高分辨率呼吸

  1. 高分辨率呼吸的制备。
    1. 打开高分辨率呼吸并通过启动呼吸分析程序连接到桌面。
    2. 从两个腔中抽出70% 乙醇。在70% 乙醇中浸泡这些腔至少45分钟。
    3. 用70% 乙醇洗两次腔, 每步吸气。
    4. 洗涤室三次与 ddH2O, 吸气后, 每一步。
    5. 冲洗活塞在 ddH2O 中的腔室。这将清除活塞和钛港残留的乙醇。
  2. 极谱氧传感器的校准。
    1. 在每个 oxygraph 室中加入2.4 毫升的1x 低葡萄糖浓度的缓冲液, 在 750 rpm 和37° c 的情况下, 用磁搅拌棒连续搅动缓冲液, 在2.0 秒内通过推 F7 按钮并打开标签为 "系统" 的选项卡来记录数据间隔。推活塞所有的方式, 然后收回到扳手曝气设置。让机器平衡至少1小时, 直到获得稳定的氧气流量。
    2. 在实验期间, 将机器设置在37° c。将极化电压设置为 800 mV, 通过推 F7 按钮, 并打开标签为 "氧气, O2" 的标签, 增益为2。平衡至少30分钟的氧浓度, 而氧浓度的变化是稳定的 (少于 2 pmol/毫升)。
    3. 在氧浓度稳定后, 选择氧浓度变化稳定的区域, 建立氧浓度变化的背景测量。
      1. 通过推送 shift 键选择一个区域, 单击鼠标左键并在选定区域中拖动鼠标。单击与所选区域关联的字母, 并更改为每个跟踪的 "R1", 对应于两个分庭。
      2. 双击屏幕左下方和右下角的 "O2校准" 框, 单击 "选择标记" 按钮以将 "空气校准" 作为 R1, 然后为两个腔室选择 "校准并复制到剪贴板"。
  3. 2.1.5 或2.2.5 步骤制备的832/13 种β细胞的呼吸评价。
    1. 在每个腔室中加载2.4 毫升的样品 (一个室与控制车辆处理的细胞, 一个室与复合处理的细胞) 在1x 低血糖审计。如果使用机械离解法 (在-20 ° c 下冻结测量), 将0.5 毫升的细胞样本用于蛋白质定量测定 (二辛可宁酸)。
      1. 推动柱塞的所有方式, 并吸取残余量。在所有后续步骤中, 在 750 rpm 和37° c 的整个实验中连续搅拌细胞。在加载示例时, 单击 F4 并将其标记为 "单元格" 以进行标记。
      2. 测量样品30分钟。在信号稳定后, 选择一个区域的氧浓度变化对应的低葡萄糖条件 (2.5 毫米葡萄糖) 描述的3.2.3。
    2. 在信号稳定达到后, 添加12.5 µL 45% 无菌葡萄糖溶液 (16.7 毫米最终浓度) 进入每个房间通过钛装货港使用注射器。在添加治疗时, 用3.3.1 描述的 "葡萄糖" 作标记。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择这个区域的氧气浓度的变化, 如3.2.3 所述。这是 16.7 mM 葡萄糖读数, 并与刺激条件7对应。
    3. 在信号稳定以后被到达增加1µL 5mM 寡 A (2.5 µM 最后的集中) 入每个房间通过装货口岸。在添加治疗时, 用3.3.1 描述的 "OligoA" 作标记。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择曲线的这一区域, 如3.2.3 中所述。寡抑制 ATP 合成酶, 因此唯一的氧气通量发生是通过电子泄漏和不氧化磷酸化7。
    4. 在信号稳定被到达之后增加1毫米 FCCP 在1µL 增量直到最大呼吸率建立。这代表最大的不耦合呼吸作用。3-4 µL FCCP 是足够的 (1.5-2.0 µM 最终浓度), 以诱导最大的非耦合呼吸 INS-1 832/13 细胞。在添加治疗时, 将标记标记为 "FCCP", 如3.3.1 所述。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择曲线的这一区域, 如3.2.3 中所述。FCCP 是一个解耦代理。这使我们可以测量不耦合呼吸7。
    5. 在信号稳定以后被到达增加1µL 5 毫米 Antimycin A (2.5 µM 最后的集中) 入每个房间通过装货口岸。在添加治疗时, 将标记标记为 "AntiA", 如3.3.1 所述。让信号稳定并记录细胞呼吸, 直到达到稳定的氧气流量。选择曲线的这一区域, 如3.2.3 中所述。
      注: Antimycin A 结合细胞色素 C 还原酶, 抑制泛氧化, 并阻断所有呼吸。这使我们能够完全停止呼吸7。
  4. 测量832/13 β细胞的蛋白质浓度和呼吸正常化。
    1. 使用0.5 毫升样本保留在装货, 测量蛋白质样本使用的评估方法13。
    2. 按照制造商的指示, 在不稀释的情况下, 每三份样品运行一次。
  5. 832/13 β细胞呼吸计算从 trypsinized 细胞。
    1. 通过推呼吸分析程序的 F3 按钮, 在检测中输入每毫升使用的细胞数。将单位改为细胞/毫升, 进入细胞浓度, 并改变介质到审计。
    2. 选择背景读数以使数据正常化, 方法是选择并输入 O2校准表单, 如3.2.3 中所述。
    3. 从2.5 毫米葡萄糖, 16.7 毫米葡萄糖, 寡 a, FCCP 和 Antimycin a 的读数进行选择, 如3.3.1 所述。
    4. 在呼吸分析程序中, 在进入蛋白质浓度后, 为每个腔室输出读数, 并在呼吸测量期间选择适当的平均值。这是通过单击 F2, 然后推动 "复制到剪贴板功能" 完成的。这将导出要在其他分析程序中使用的数据。使用 "O2斜率为负值" 进行计算。
    5. 为3-5 独立运行的车辆处理控制和天然化合物处理细胞的数据, 以确定对 INS-1 832/13 β细胞的完整细胞呼吸的影响。
  6. 832/13 β细胞呼吸计算从机械上离解的细胞。
    1. 通过推呼吸分析程序的 F3 按钮, 从该方法中输入蛋白质计算。将单位改为 mg, 进入其浓度, 并将培养基转变为审计组。
    2. 选择背景读数以使数据正常化, 方法是选择并输入 O2校准表单, 如3.2.3 中所述。
    3. 从2.5 毫米葡萄糖, 16.7 毫米葡萄糖, 寡 a, FCCP 和 Antimycin a 的读数进行选择, 如3.3.1 所述。
    4. 在呼吸分析程序中, 在进入蛋白质浓度后, 为每个腔室输出读数, 并在呼吸测量期间选择适当的平均值。这是通过单击 F2, 然后推动 "复制到剪贴板功能" 完成的。这将导出要在其他分析程序中使用的数据。使用 "O2斜率为负值" 进行计算。
    5. 为3-5 独立运行的车辆处理控制和天然化合物处理细胞的数据, 以确定对 INS-1 832/13 β细胞的完整细胞呼吸的影响。

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结果

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INS-1 832/13 β细胞的准备和收获的协议中所描述的, 将显示在氧气消耗的基础上的各种化学干预 (图 1A)。当葡萄糖浓度增加到16.7 毫米葡萄糖 (图 1B) 时, 将观察到呼吸的增加。当完整的细胞被寡处理后, 呼吸会减少。这种呼吸称为渗漏, 它被定义为基底, nonphosphorylating 呼吸状态。当β细胞被解偶联剂 FCCP, 即 ETS 呼吸或电子传输系统呼吸时, 将达到最大呼吸。最后, 呼吸将降到零, 当治疗与 Antimycin A, 标记为火箭 (残余氧气消耗量) 提到非呼吸的细胞氧气消耗量。

在细胞数量上的差异将会显著改变从该技术获得的数据的质量。葡萄糖诱导呼吸测量在 0.5, 1 和 2 x 106细胞/毫升 (图 2A-2C)。利用细胞计数和蛋白质检测, 计算出与三测试细胞浓度对应的蛋白质浓度 (

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本议定书的目的是使用高分辨率呼吸测量完整的胰β细胞的呼吸速率。这种方法允许测量β细胞的反应, 以增加葡萄糖水平。该协议还允许对各种化合物进行预处理, 如本协议所示, 与自然发生的单体儿茶或姜黄素4,5。与其他各种化合物的治疗可以用于本议定书, 与预处理 (如此处所示), 或通过对基本协议的最小修改在呼吸室内治疗。

可以通过多种方法修改此方法。可使用其他β细胞系;然而, 需要通过实验来确定细胞数和洗净时间。也可以使用主要的啮齿动物和人类胰岛;然而, 细胞数量或胰岛当量也需要通过实验来确定。至少有一项研究使用高分辨率呼吸15测量了胰岛的耗氧量。这项研究要求每反应400胰岛, 但没有测量葡萄糖诱发的呼吸变化。鉴于主要组织经常使用高分辨率 respirometers

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者要感谢 Tessem 和汉考克实验室的成员们进行了辅助和科学的讨论。作者感谢安德鲁尼尔逊博士 (弗吉尼亚理工学院) 提供可可衍生的儿茶单体分数。这项研究得到了来自糖尿病行动研究和教育基金会对 JST 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
O2k 核心：Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02高分辨率呼吸测定仪
DatLab 6 程序Oroboros Instruments27141-01用于分析高分辨率呼吸测定的计算机程序
INS-1 832/13 细胞系杜克大学医学中心无β 细胞系，Christopher Newgard 姜
黄素博士的礼物SigmaC7727β 细胞预处理
可可表儿茶素单体弗吉尼亚理工学院和州立大学无β 细胞预处理，Andrew Neilson 博士赠送
胰蛋白酶SigmaT4049用于细胞培养
RPMI-1640SigmaR8758832/13 β 细胞培养基
胎牛血清HycloneSH30071.03832/13 β 细胞培养基成分
青霉素-链霉素SigmaP4458832/13 β 细胞培养基成分
HEPESSigmaH3662832/13 β 细胞培养基成分/ 1x SAB 缓冲液
谷氨酰胺沉箱GLL01832/13 β 细胞培养基成分
丙酮酸钠SigmaS8636832/13 β 细胞培养基成分
2-巯基乙醇SigmaM3148832/13 β 细胞培养基成分
NaClFisherS27110x SAB 缓冲液的成分
KClSigmaP954110x SAB 缓冲液的成分
KH2PO4>SigmaP565510x SAB 缓冲液的成分
MgSO4SigmaM264310x SAB 缓冲液的组分
D-（+）-葡萄糖溶液SigmaG87691x SAB 缓冲液的组分，用于呼吸测定的化学品
CaCl2SigmaC56701x SAB 缓冲液的组分
35% BSA 溶液SigmaA79791x SAB 缓冲液的组分
NaHCO3SigmaS57611x SAB 缓冲液的组成部分
200 防Sigma459844洗涤 氧迹仪 O2k 室
寡霉素 ASigmaO4876用于呼吸测定的化学品
FCCPSigmaC2920用于呼吸测定的化学品
Anitmycin ASigmaA8674用于呼吸测定的化学品
BCA 蛋白质试剂盒Thermo Fisher23225用于测定蛋白质浓度
乙醇

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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