本实验方案的目的是利用高分辨率呼吸测定法，在天然化合物存在的条件下，测量葡萄糖介导的线粒体呼吸变化对完整832/13 β细胞的影响。
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本文内容
摘要
摘要
高分辨率呼吸测定法可用于测量分离的线粒体、细胞和组织的耗氧量。β细胞通过响应升高的葡萄糖浓度而分泌胰岛素，从而在体内发挥调控血糖水平的关键作用。胰岛素的分泌受葡萄糖代谢和线粒体呼吸的调控。因此，测量完整β细胞的呼吸功能对于改善β细胞功能以治疗糖尿病具有重要意义。利用完整的832/13 INS-1衍生β细胞，我们可以测定葡萄糖浓度升高对细胞呼吸的影响。本实验方案使我们能够在有或无各种化合物的条件下测量β细胞的呼吸，从而确定特定化合物对完整细胞呼吸的影响。本文展示了两种天然存在的化合物——单体表儿茶素和姜黄素——在低葡萄糖（2.5 mM）或高葡萄糖（16.7 mM）条件下对β细胞呼吸的影响。该技术可用于研究不同葡萄糖浓度存在时，各种化合物对完整β细胞呼吸的影响。
引言
胰腺β细胞的主要功能是通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌来维持机体的正常血糖水平。β细胞对循环中葡萄糖的生理变化的感知主要依赖于低亲和力、高容量的葡萄糖转运蛋白GLUT2（葡萄糖转运蛋白2，Km 16.7 mM）1。当循环中的葡萄糖水平升高时，这种高容量低亲和力的转运蛋白促使β细胞内葡萄糖浓度呈比例增加。葡萄糖通过糖酵解、三羧酸循环（TCA循环）和线粒体呼吸进行代谢，导致细胞内ATP（三磷酸腺苷）水平升高。升高的ATP浓度会阻断ATP敏感性K+通道，引起细胞膜去极化。膜去极化导致电压门控Ca2+通道开放，进而释放囊泡结合的胰岛素颗粒2。β细胞功能障碍是2型糖尿病（T2D）的典型特征，会导致胰岛素分泌减少且调控不良，最终引发β细胞死亡3。能够维持或改善β细胞功能的机制可被开发为T2D的治疗手段。
研究表明，天然存在的植物性化合物对胰腺β细胞具有有益作用4。这些化合物可能通过促进β细胞增殖、提高其存活率或增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌而发挥作用。例如，近期研究发现，单体表儿茶素可通过增强线粒体呼吸作用和提高细胞内ATP水平，从而促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌5。因此，阐明这些化合物如何增加功能性....
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方案
1. 细胞培养
- 在 RPMI 1640 培养基中培养源自 INS-1 的 832/13 胰岛β细胞，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素、10 mM HEPES、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和 0.05 mM 2-巯基乙醇9,10,11,12,13。
- 使用 2 mL 0.25% 胰蛋白酶从 T75 培养瓶中消化 832/13 细胞，在 37 °C 下孵育 10 分钟。加入 8 mL 完全 RPMI 1640 培养基以中和胰蛋白酶活性。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将步骤 1.2 中获得的细胞悬液取 100 µL 与 900 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）混合稀释。
- 以 2 × 106 个细胞/mL 的密度将 832/13 细胞接种至 6 孔板中。
- 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中培养 48 小时，然后开始呼吸实验。
2. 高分辨率呼吸测定法....
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结果
按照本方案所述方法制备和收获的 INS-1 832/13 胰岛β细胞，将表现出因不同化学干预而产生的氧消耗变化（图 1A）。当葡萄糖浓度升高至 16.7 mM 时，可观察到呼吸作用增强（图 1B）。当完整细胞经寡霉素 A（Oligomycin A）处理后，呼吸作用将下降。此呼吸状态称为“质子漏呼吸”（LEAK），定义为基础的、非磷酸化的呼吸状态。当β细胞经解偶联剂 FCCP 处理时，将达到最大呼吸速率，此状态称为 ETS 呼吸（电子传递系统呼吸）。最后，当细胞经抗霉素 A（Antimycin A）处理后，呼吸作用将降至零，此阶段标记为 ROX（残余氧消耗），代表非呼吸性细胞耗氧。
细胞数量的差异会显著影响该技术所获得数据的质量。在 0.5、1 和 2 × 106 个细胞/mL 条件下测量了葡萄糖诱导的呼吸作用（图 2A–2C）。通过细胞计数和 BCA.......
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讨论
本实验方案的目的是利用高分辨率测氧法测定完整胰岛β细胞的呼吸速率。该方法可用于测量β细胞对葡萄糖浓度升高的反应。本方案还允许在实验前使用多种不同化合物进行预处理，例如本方案中所展示的天然单体表儿茶素或姜黄素4,5。此外，也可在本方案基础上稍作调整，用于其他化合物的处理，既可采用预处理方式（如本文所示），也可直接在呼吸室中加入化合物进行处理。
该方法可通过多种方式进行修改。可使用其他β细胞系；然而，细胞数量和SAB洗涤时间需通过实验确定。也可使用原代啮齿类动物和人胰岛；但是，细胞数量或胰岛当量也需通过实验确定。至少有一项研究采用高分辨率呼吸测定法测量了胰岛的耗氧量15。该研究每个反应需要400个胰岛，但未检测葡萄糖诱导的呼吸变化。鉴于原代组织常与高分辨率呼吸测定仪联合使用
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Tessem实验室和Hancock实验室成员提供的协助与科学讨论。作者感谢弗吉尼亚理工大学的Andrew Neilson博士提供可可来源的表儿茶素单体组分。本研究得到了糖尿病行动研究与教育基金会向JST提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| O2k 核心设备：Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | 用于高分辨率呼吸测定的仪器 |
| DatLab 6 程序 | Oroboros Instruments | 27141-01 | 用于分析高分辨率呼吸测定数据的计算机程序 |
| INS-1 832/13 细胞系 | Duke University Medical Center | NONE | β细胞系，由 Christopher Newgard 博士惠赠 |
| 姜黄素 | Sigma | C7727 | β细胞预处理 |
| 可可表儿茶素单体 | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | β细胞预处理，由 Andrew Neilson 博士惠赠 |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4049 | 用于细胞培养 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 β细胞培养基 |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 β细胞培养基组分 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4458 | 832/13 β细胞培养基组分 |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 β细胞培养基组分 / 1x SAB 缓冲液 |
| 谷氨酰胺 | Caisson | GLL01 | 832/13 β细胞培养基组分 |
| 丙酮酸钠 | Sigma | S8636 | 832/13 β细胞培养基组分 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | 832/13 β细胞培养基组分 |
| NaCl | Fisher | S271 | 10x SAB 缓冲液组分 |
| KCl | Sigma | P9541 | 10x SAB 缓冲液组分 |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | 10x SAB 缓冲液组分 |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | 10x SAB 缓冲液组分 |
| D-(+)-葡萄糖溶液 | Sigma | G8769 | 1x SAB 缓冲液组分，呼吸测定用化学试剂 |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | 1x SAB 缓冲液组分 |
| 35% BSA 溶液 | Sigma | A7979 | 1x SAB 缓冲液组分 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1x SAB 缓冲液组分 |
| 200 证明乙醇 | Sigma | 459844 | 清洗 Oxygraph O2k 检测室 |
| 寡霉素 A | Sigma | O4876 | 呼吸测定用化学试剂 |
| FCCP | Sigma | C2920 | 呼吸测定用化学试剂 |
| 抗霉素 A | Sigma | A8674 | 呼吸测定用化学试剂 |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 | 用于测定蛋白浓度 |
参考文献
- Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
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