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方法文章

百里香精油在肉类干燥过程中对微生物负荷的影响

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DOI：

10.3791/57054

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2018年3月14日

 ,  ,  , 
1Department of Sustainable Technologies, Faculty of Tropical AgriSciences, Czech University of Life Sciences Prague, 2Department of Quality of Agricultural Products, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Czech University of Life Sciences Prague

本文内容

摘要

污染肉类产品的微生物（如Escherichia coli）可导致食源性疾病。在肉类干燥过程中使用精油的方法尚未得到深入研究。本文提出一种在干燥过程中将百里香精油应用于肉类的新方法，以降低干制肉类中的微生物负荷。

摘要

肉类是一种富含蛋白质的食物，常用于制作肉干，而肉干是一种广受欢迎的食品零食，其保存和安全性至关重要。为了确保食品安全并延长肉类及其制品的保质期，通常采用合成或天然防腐剂来控制和消除食源性细菌。近年来，人们对天然食品添加剂在肉类中应用的兴趣日益增加。某些微生物（如大肠杆菌 Escherichia coli）会污染肉类及肉制品，引发食源性疾病。因此，有必要改进肉类的保藏工艺。然而，精油在肉类干燥过程中的应用尚未得到深入研究。在此背景下，通过在干燥过程中施加精油，有望提升干制肉类的附加值并降低食源性疾病的风险。本实验方案介绍了一种在肉类干燥过程中应用百里香精油（TEO）的新方法，具体是在干燥室中以蒸汽形式直接施加。为评估效果，我们采用最小抑菌浓度（MIC）检测经处理样品与未处理样品中致病菌的数量。初步结果表明，该方法是一种可行的、可替代合成防腐剂的方案，能显著降低干制肉类中的微生物负荷。

引言

干燥作为一种传统的食品保存方法，自古以来就被使用。如今，人们对干燥作为有效的食品保存方法的兴趣日益增长1,2,3。该方法被用于制作多种特殊加工的肉类食品，其中最著名的是肉干。

肉干是肉类保存的最古老方法之一，其原理是通过腌制和干燥来降低水分活度，从而延长保质期4。如今，作为一类腌制保存的肉制品，肉干仍然广受欢迎，食品安全、风味和质地至关重要。几乎所有类型的肉类都可用于制作肉干，包括牛肉、猪肉、禽肉或野味5，其制作过程需要将瘦肉切成条状并进行干燥。通常还会结合腌渍液浸泡或烟熏处理，以赋予肉干特有的风味6。

尽管干燥在真正实现食品保藏方面受到广泛关注，但因肉品干燥不充分而导致的产志贺毒素大肠杆菌（E. coli）食源性疾病暴发风险极为严重，亟需加以控制。已有若干研究报道了与E. coli O157:H7相关的食源性胃肠炎暴发事件，其原因在于家庭自制肉干过程中热处理不充分。类似案例甚至出现在商业加工的肉干产品中7,8,9。Levine et al.10 提出，食源性微生物可在商业肉干生产所采用的中等干燥条件（约60 °C）下存活。E. coli O157:H7引发的食源性疾病暴发事件在20世纪90年代中期曾多次发生，其源头被归因于干燥的绞碎肉制品6,11。值得注意的是，在以往所有案例中，主要风险来源于被认定为“可存活但不可培养”（viable but non-culturable, VBNC）状态的细菌性病原体。在温度变化或营养缺乏等多种胁迫条件下，E. coli 细胞可能进入一种被称为VBNC的状态12,13。VBNC状态的细胞在适宜条件下可被复苏为可培养状态，从而因食品污染对人类健康构成威胁14,15。这意味着，若肉品在干燥后立即食用，则是安全的；然而，若储存不当（如湿度升高），则病原体存在高度再激活风险，并可能导致微生物增殖。

除了干燥和腌制方法外，消费者对使用天然产品替代添加剂以提高食品质量的需求日益增长16,17。近年来，人们尤其关注将天然食品添加剂应用于肉类，以替代传统的合成防腐剂18,19,20,21。尽管在肉类干燥过程中使用精油尚缺乏足够的实验依据，但该领域的早期研究已显示出积极的结果22,23。

自中世纪以来，人们已认识到精油化合物（EOCs）具有抗菌、杀虫和抗寄生虫的特性24,25,26。如今，EOCs已成为最重要的一类生物活性天然化合物。在众多不同的EOCs中，百里香酚是最广为人知的一种，其在百里香精油（TEO）中的含量超过85%23。当添加到食品中时，这种酚类物质可防止微生物和化学性腐败。此外，其抗菌性能与其他天然防腐剂联合使用时可能得到增强2,27,28,29,30。目前，百里香（Thymus vulgaris）作为一种属于Lamiaceae科的香草，已被公认为一种调味剂以及高效的肉类防腐剂31。García-Díez et al.30对肉制品开展的一项研究发现，与其他精油相比，TEO对食源性病原体表现出更广泛的抑制作用。因此，在肉品干燥过程中应用精油，有望提升干肉的附加值，并降低食源性疾病的风险。

在本实验方案中，我们介绍了一种在肉类干燥过程中应用百里香精油（TEO）的新方法，即直接以蒸气形式将其引入干燥室。为评估该方法的效果，我们采用最小抑菌浓度（MIC）来检测经处理样品与未处理样品中致病菌的存在情况。初步结果表明，该方法是一种高效的合成防腐剂替代方案，可显著降低干制肉类中的微生物负荷。

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方案

1. 肉类制备

  1. 从当地肉店获取一块牛短腰肉（来自biceps femoris的新鲜牛肉），并将其转移至实验室。
    注意：建议将牛腰肉在密闭袋中于常温（20 - 25 °C）下运输，时间不超过20分钟。
  2. 在超净安全柜中，为对牛肉肌肉外表面进行消毒，使用500 mL挤压瓶喷洒70%（v/v）乙醇处理10秒。每1 cm2肌肉表面积使用0.025 g乙醇。
  3. 用刀无菌地去除肉的外层表面，以避免乙醇残留在肌肉内部。去除约3 mm深的肌肉内部组织，以保持肌肉表面的均匀性。
  4. 将肌肉装入塑料密封袋中，并转移至冷冻柜。
  5. 在-18 °C下储存肌肉1天。随后，在4 °C下解冻6小时。
    注意：建议将肌肉从冷冻柜转移至冰箱中进行解冻。
  6. 在超净安全柜中，使用切肉机将每块肌肉切成厚度为0.5 cm的片状，然后用刀将其进一步切割成5 × 2.5 cm2的小矩形样品。
  7. 将矩形肉样装入塑料袋中密封，并在-18 °C下储存于冷冻柜中，以备后续使用。

2. 在层流安全柜中制备标准化接种物及接种操作

  1. 制备标准化接种物（1.5 × 108 CFU/mL）的 E. coli ATCC 25922 接种肉样。
    1. 用于制备储备菌液时，首先将冻干细菌培养物（由供应商提供）加入预先装有10 mL无菌缓冲 Mueller Hinton 肉汤（BMHB）的15 mL无菌试管中。将该悬浮液在37°C下培养24 h 37 °C.
      1. 制备菌种储备液操作如下：取约0.1–0.2 mL细菌悬液，加入预先装有15 mL无菌BMHB培养基、并用带铝盖的橡胶塞密封的20 mL小瓶中进行稀释。将该悬液在37 °C下培养24 h 37 °C.
      2. 存放在冰箱内 4 °C 用于制备标准化接种物。
    2. 来自储备液（见步骤 2.1.1）的 大肠杆菌 取约 0.1 - 0.2 mL 细菌悬液，加入预先装有 10 mL 无菌缓冲 Mueller Hinton 肉汤（BMHB）的 15 mL 塑料无菌管中进行稀释。将该管置于 37 °C 24 小时。
    3. 用于制备标准化接种物（1.5 × 108 CFU/mL），将少量该悬液加入已预先装有10 mL无菌BMHB的15 mL无菌试管中。
    4. 充分涡旋混合物，使用密度计在 600 nm 处测量光密度（OD）32.
    5. 重复步骤 2.1.3 - 2.1.4，直至 OD 以 McFarland 值表示时比无菌 BMHB 的数值增加 0.5。
  2. 接种操作步骤中，将矩形肉样分别置于两张不同的铝箔纸（20 cm × 30 cm）中，一张用于对照肉样，另一张用于接种肉样。
    1. 在第二层铝箔上，对接种生肉矩形样品 800 µL 选定菌株的细菌悬液（相当于 1.2 × 108 每份肉样中的菌落形成单位（CFU）通过将接种物均匀分布在表面实现。
      1. 移液器 400 µL 在样品的一侧接种，用无菌涂布棒在表面轻轻涂布均匀，室温静置干燥10分钟。在样品的另一侧，对剩余菌液重复相同操作。

3. 干燥与 TEO 涂布

  1. 将含有矩形肉样的两张铝箔从超净安全柜转移至干燥器中：每张铝箔覆盖一层，然后将样品放入干燥器内。
  2. 在标准实验室干燥器中进行干燥。
    注意：首先将烘箱预热至 55 °C。此过程可持续 20 分钟。
    1. 在 55 °C 下对对照样品干燥 6 小时，干燥空气的相对湿度范围为 30 - 45%。
      注意：干燥空气的相对湿度随时间变化，具体取决于肉中液体蒸发的速率。
  3. 计算所施加 TEO 的体积，并将精油浓度表示为每单位干燥器体积中的 TEO 体积（mL/L 空气）。例如，53 L（干燥器体积）中使用 1.5 mL TEO，相当于浓度为 0.028 mL/L 空气。为测定 TEO 对 E. coli 的最小抑菌浓度（MIC），可使用以下剂量：1.5 mL（0.028 mL/L 空气）、1 mL（0.019 mL/L 空气）和 0.75 mL（0.014 mL/L 空气）。
  4. 在干燥前，为施加 TEO 蒸气（百里香酚为主要成分，占 79%），将一张滤纸（12 cm × 20 cm）浸泡于 1.5 mL 剂量的 TEO 中，并将其置于干燥器内风扇前方。
  5. 采用与对照样品相同的程序（步骤 3.1 和 3.2）对经 TEO 处理的肉样进行干燥。
    注意：干燥过程结束后取出样品后，将烘箱开启 3 小时，温度设为 80 °C，并将空气阀调至 100% 排气，以清除烘箱内残留的精油成分。

4. 微生物分析

  1. 在用细菌接种肉类之前，应检查肉样是否存在任何变质迹象。若出现黏液以及检测到强烈刺鼻的气味，则表明肉类已腐败。如果触感发黏，则表明细菌可能已在肉表面开始增殖。
  2. 为评估接种效率，对原始接种样本进行检测以确定是否存在 E. coli ATCC 25922，并在干燥程序前将其与未接种的对照样本进行比较。为此目的：
    1. 洗涤每个肉样（2个对照样品和2个接种样品）。将每个肉样置于灭菌烧瓶中，按1:10（w/v）的比例加入缓冲蛋白胨水（每升水中含8.5 g NaCl、1 g蛋白胨、5片磷酸盐缓冲液片剂和1 g吐温80），pH范围为7–7.3。在室温下以140 rpm振荡摇床振荡10分钟。
      注意：接种程序完成后立即进行清洗。
    2. 通过陈、Nace 和 Irwin 总结的改良 6 × 6 滴板法评估细菌数量33 在平板计数琼脂（PCA）和麦康凯琼脂（MCA）上
      注意：6 × 6 滴定法采用微量肉汤稀释法，使用多通道移液器对受试样品进行10倍系列稀释，与传统方法相比，该方法更省力且更经济33,34.
    3. 通过6 × 6滴板法培养10倍系列稀释样品，用于评估 E. coli.
      注意：特别是对于6 × 6滴法，培养时使用六个 5 µL- 从待测样本的六个选定稀释度中，使用多通道移液器加样。在适当干燥的培养皿上，液滴可迅速被琼脂吸收，采用此方法接种极为方便且易于操作34.
    4. 将培养皿置于培养箱中孵育 37 °C 培养24 h后，评估菌落数量 E. coli 在培养皿上（CFU/g）-1 如第5节所述的干肉样品
  3. 干燥后，取两个接种过的干燥样品与两个未接种的干燥对照样品进行活菌数比较 E. coli分别。以确定存在或不存在 E. coli 这四个中的 s样品，对每份肉样进行如下预增菌处理：
    1. 将每份肉样置于含缓冲蛋白胨水的无菌烧瓶中（参见 步骤 4.2.1）并在室温下以 140 rpm 的转速于摇床中振荡 10 分钟。随后将每个烧瓶孵育于 37 °C 6 小时以进行预富集。
    2. 细菌的评估与培养，请遵循步骤 4.2.2 - 4.2.4 中所述的相同操作流程。

5. 审查结果

  1. 孵育结束后，从培养箱中取出培养皿，并按以下步骤检查结果：
    1. 为评估菌落总数，需观察PCA平板上嗜温需氧细菌（白色斑点）的存在情况及典型特征 E. coli 在MCA上形成菌落（红色至深粉红色）。如果病原体不存在，两种琼脂上均无生长。
    2. 计数菌落并确定数量 E. coli (CFU/g-1 （干肉中）存在的
      注意：计数菌落数量（N) 在连续两个稀释度中，每个液滴含有30个或更少的菌落（图1）。数量 N CFU/g-1 干肉的测定方法如下35
      静力平衡方程：N=C/ν(n₁+0.1n₂)d，适用于物理学公式研究。
      其中， C 为所有计数液滴上的菌落数之和， v 是每滴样品稀释液所用的体积（此处为 0.05 mL）， n1 是首次稀释时使用的滴数， n2 是第二次稀释时使用的滴数，以及 d 表示首次捕获计数时的稀释倍数。
  2. 为分析微生物学数据，将菌落数量转换为 log CFU g-1 并对其进行方差分析（ANOVA），以检验处理的主效应36.
    1. 进行多重均值比较的Tukey显著性差异检验（Tukey HSD）36 并确定不同处理之间的显著差异。

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结果

我们先前首次采用牛至精油（OEO）开发了该方法，以提高干肉制品的安全性并增加其价值。总体而言，前期实验表明，大肠杆菌（E. coli）在干燥过程中会进入活的非可培养（VBNC）状态，作为一种生存策略。这一点可通过干燥结束后无法培养出细菌来证明22。因此，需要进行6小时的预增菌处理，以便对菌株进行计数。在更短的时间内，生长中的细胞数量仍然非常低。因此，结果均基于预增菌处理后的数据，并排除了原始接种样品（用于指示接种效率的对照，见Table 1）。总体而言，无需测试3 mL（0.057 mL/L 空气）的百里香精油（TEO）剂量，因为在我们之前的研究中22，经OEO处理后已无法检测到大肠杆菌（E. coli），且消费者评价其风味过于强烈。因此，测试了较低浓度的TEO，以确定其对大肠杆菌（E. coli）的最小抑菌浓度（MIC）。

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讨论

既往研究表明，引起食源性疾病的微生物可在干燥条件下存活10。因此，为确保食品安全，有必要在干燥前添加防腐剂。本研究聚焦于使用百里香精油（TEO）。原因有两点：首先，消费者对使用天然产品作为改善食品质量的替代性添加剂的需求日益增加16；其次，先前研究已证实，在肉类干燥过程中使用牛至精油（OEO）可取得良好效果22。因此，将牛至精油应用于肉类干燥的方法被拓展至其他精油的使用，以控制微生物负荷。

在之前的一项研究中，我们已测试使用OEO以提高干肉的食品安全性并增加其价值。我们先前的结果表明 E. coli 在肉制品干燥过程中，使用OEO成功抑制了其生长，因为 E. coli 在55 °C下干燥6小时后，加入1.5 mL（0.028 mL/L空气）OEO，可显著降低活菌数22在本研究中，我们采用TEO方法实施了该技术。结果表明，使用此方法可实现对VBNC的检测、计数...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由捷克生命科学大学热带农学学院内部研究资助项目（项目编号：20175013）和CIGA 20182023 两项资助共同支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
肉类切割机KalorikKP 3530来自美国佛罗里达州迈阿密花园
层流安全柜Faster s.r.l来自意大利
500 mL 挤压瓶Merci632 524 325 025来自捷克
标准实验室干燥器 UFE 400MemmertDE 66812464来自德国
培养箱BT 120N/A来自捷克
冰箱和冷冻柜BoschKGN34VW20G来自德国
密度计Biosan220 000 050 122来自拉脱维亚；供应商 Merci，捷克
Escherichia coli ATCC 25922OxoidCL7050来自捷克
涡旋振荡器Chromservis22008013来自捷克
15 mL 无菌塑料离心管Gama331 000 020 115来自捷克，供应商 Merci
20 mL 注射用小瓶Healthy vialhvft169来自中国
20 mm 无菌丁基橡胶塞Merci22008013来自捷克
20 mm 铝盖Healthy vialN/A来自中国
百里香精油Sigma AldrichW306509来自美国密苏里州圣路易斯
穆勒-欣顿肉汤OxoidCM0337来自捷克
NaClPenta16610-31000来自捷克
蛋白胨OxoidLP0034来自捷克
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP4417来自捷克
聚山梨酯 80（Tween 80）RothT 13502来自德国，供应商 P-lab
摇床 SHO-1DVerkonDH.WSR04020来自捷克，  转速 10 - 300 rpm，350 x 350 mm 平台，适用于烧瓶
70% 乙醇BiofermN/A来自捷克
麦康凯琼脂OxoidCM007来自捷克
平板计数琼脂OxoidCM0325来自捷克
滤纸Merci480 622 080 040来自捷克
250 mL 锥形瓶Simax610 002 122 636来自捷克；供应商 Merci 捷克
多通道移液器SocorexS852820来自瑞士；供应商 P lab，捷克
微量滴定板GammaV400916捷克
100–1000 μL 微量移液器Eppendorf333 120 000 062来自德国；供应商 Merci，捷克

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