通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

摘要

本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。

摘要

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，当中枢神经系统发生炎症或损伤时，它们是首先响应的细胞。近期研究表明，小胶质细胞具有高度动态性，能够呈现促炎性和抗炎性两种表型。在围产期脑损伤等神经炎症条件下，M1（促炎性）和M2（促修复性）表型均发挥重要作用，并在特定环境刺激下表现出不同的功能。研究发现，调控小胶质细胞的活化状态可产生神经保护作用，提示小胶质细胞在脑损伤治疗中具有潜在应用价值。然而，仍需进一步研究以更深入理解小胶质细胞在疾病中的作用，本实验方案为此提供了支持。以下所述方案结合了密度梯度离心法以减少细胞碎片，以及磁性分选技术，可获得高纯度的原代小胶质细胞样本，用于 体外 实验无需2-3周的培养即可进行。此外，表征步骤可提供关于小胶质细胞的可靠功能数据，有助于深入理解这些细胞的极化与启动状态，对再生医学领域具有重要意义。

引言

围产期因炎症、缺氧缺血和出血所导致的损伤可能引发多种长期后遗症。围产期脑损伤复杂的病理生理过程被认为涉及炎症和缺血，进而导致神经元和轴突死亡¹。先天免疫反应在导致损伤的一系列事件中起着重要作用²。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）内的常驻免疫细胞，是损伤后最先响应的细胞³。小胶质细胞具有可塑性，其功能既可以是保护性的，也可能是毒性的，具体取决于所处的环境⁴。它们参与趋化作用、吞噬作用、抗原呈递以及细胞因子和活性氧物质的产生^4,5。静息状态的小胶质细胞持续监测周围环境，并在遇到外来或有害物质时被激活⁴。激活后会引发促炎反应，这对中枢神经系统的保护至关重要⁴。这类M1型"促炎性"表型小胶质细胞主要参与抗原呈递和病原体清除⁴。尽管炎症反应在神经保护中具有关键作用，但不受控制或持续过久的炎症可能有害，并导致神经元损伤⁴。然而，在某些环境刺激作用下，小胶质细胞也可表现出抗炎表....

方案

以下实验程序已获得莫纳什大学动物伦理委员会的批准。实验使用健康、未经处理的新生C57Bl6/J品系P3-6小鼠以获得代表性结果。

1. 酶消化

注意：在分离和培养原代细胞时，必须考虑无菌条件。尽管应尽可能确保环境无菌，小鼠脑组织的初始解剖和收获步骤可在超净工作台外完成，但后续所有操作均须在超净工作台内进行。

1. 使用无菌器械通过颈椎脱位法处死小鼠，将动物断头后用100%乙醇冲洗。用小型无菌剪刀沿头部左右两侧做小切口。在此年龄段，皮肤易于剥离。用弯头镊尖端轻轻将组织向吻端滑动，暴露颅骨，包括前囟（Bregma）。
2. 将剪刀尖端插入脊髓管开口处，向耳道方向做侧向切口。沿矢状缝切至前囟（Bregma），操作时轻轻将剪刀尖向上翘起，以避免损伤脑组织。将剪刀尖置于前囟处，沿冠状缝向头部左右两侧做侧向切口。
3. 用镊子轻轻剥离颅骨以暴露脑组织。操作时夹住侧向切口暴露出的颅骨边缘，轻柔地将颅骨向一侧拉起，颅骨应可轻松剥离。使用弯头镊子轻轻从脑组织下方插入，将脑组织完整取出。
4. 将脑组织放入一个5 mL无菌容器中，用冰浴预冷的洗涤液（低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加1%青霉素-链霉素）清洗2–3次，每次约5 mL，以去除血液。
5. 在超净工作台中，将5 mL容器中的内容物转移至一个置于冰上的小培养皿（35 mm）。使用无菌手....

结果

使用此处所述方法，可分离出纯化的 microglia 群体，并可用于后续表征分析 体外 以及流式细胞术分析。首先，每次处死最多可使用18只动物，预计可获得约450,000至600,000个小胶质细胞。至关重要的是，需首先确认所分离细胞的纯度，为此通过CD45和CD11b两种标记物染色进行流式细胞术分析。小胶质细胞的鉴定可能较为困难，因为小胶质细胞表达的许多标记物也同时表达于巨噬细胞；而使用这两种标记物可实现准确且可靠的定量。具体而言，与中枢神经系统及外周巨噬细胞中高表达的CD45相比，小胶质细胞CD45表达水平较低，且对CD11b呈阳性图1）。从此次特定分离中，报告的纯度为89.3%。在对CD11b染色后，我们注意到，我们的原代小胶质细胞具有相似的形态学特征，形态范围从明显非分枝状（具有较大球形胞体，突起极少或无）到更多分枝状（胞体较小、更呈椭圆形，通常具有至二级分支的突起），这与预期的多种活化状态相对应 体内 (图2.......

讨论

小胶质细胞具有促炎和抗炎双重潜能，其功能状态可受环境刺激的影响而发生改变。既往研究表明，调控小胶质细胞的活化状态可产生神经保护作用。小胶质细胞具备保护神经元和修复损伤的能力，因此有必要开展更多研究以深入理解这些复杂细胞的功能机制。因此，高纯度原代小胶质细胞的分离是一项重要且实用的技术。该方法可相对快速地获得高纯度的原代小胶质细胞，适用于后续实验 体外 2天内进行实验。

文献中描述了多种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的方案。主要挑战在于高效地获得足够数量、高活力和高纯度的样本。本方案的主要优势在于无需进行长时间的培养即可获得高纯度的细胞样本，从而将实验周期从两周缩短至两天，显著加快了研究进程。后续的表征步骤可提供关于小胶质细胞的可靠功能数据，有助于加深对这些复杂细胞当前的理解。该方案结合了两种现有方法——密度梯度离心和磁珠分选。磁珠分选在文献中已被广泛验证，相较于其他分离技术，能够以相对温和的方式分离小胶质细胞^14,15,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM，低糖，含丙酮酸钠	Gibco	11885084
抗生素-抗真菌素（100倍浓度）	Gibco	15240062
牛胰 DNase I，II 型	Sigma-Aldrich	10104159001
木瓜蛋白酶，来自木瓜乳胶，缓冲水溶液	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
胎牛血清，经鉴定合格，热灭活	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Hank's 平衡盐溶液（1倍浓度）	Gibco	14175-103
Hank's 平衡盐溶液（10倍浓度）	Gibco	14185052
EasySep 小鼠 CD11b 阳性选择试剂盒	StemCell Technologies	18770	EasySep 磁力架型号
EasySep 磁力架	StemCell Technologies	18000
EasySep 缓冲液	StemCell Technologies	20144
Dulbecco's 磷酸盐缓冲液	Gibco	14040182
胰蛋白酶（2.5%）（10倍浓度）	Gibco	15090-046
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（Mouse BD Fc Block™）	BD Biosciences	553141
Falcon 5 mL 圆底高透明度聚丙烯试管，带卡扣盖，无菌	Corning	352063
175 cm² 倾斜颈细胞培养瓶，带通气盖	Corning	431080
大肠杆菌 O127:B8 来源脂多糖	Sigma-Aldrich	L5024
96 孔 TC 处理微孔板，96 孔，透明，聚苯乙烯，圆底	Corning	CLS3799
多聚甲醛（粉末，95%）	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
兔抗 Iba1 抗体	Wako	01919741
山羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 488）	Abcam	ab150077
FACS 抗体	公司	目录编号
V450，大鼠，抗小鼠，CD45，30-F11，仅供科研使用	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 标记 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red 标记的大肠杆菌生物颗粒偶联物	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin V-FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
碘化丙啶溶液	Miltenyi Biotech	130-093-233