Method Article

密度梯度离心法分离小鼠原发胶质细胞的研究

DOI:

10.3791/57065

⸱

February 16th, 2018

 ,  ,  , 
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics & Gynaecology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提出了一种从小鼠脑中分离原发胶质细胞的方法。这种技术有助于促进目前对神经系统状况的理解。将密度梯度离心和磁分离相结合, 产生高纯样品的充分屈服。此外, 我们概述了小胶质细胞的表征步骤。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小胶质细胞, 是大脑中的驻留免疫单元, 是中枢神经系统炎症或损伤的第一反应者。最近的研究发现小胶质细胞是动态的, 能够同时承担炎症和抗炎的表型。两种 M1 (亲炎症) 和 M2 (支持修复) 表型在诸如围产期脑损伤等 neuroinflammatory 条件下起着重要作用, 并表现出不同的功能, 以应对某些环境刺激。胶质激活的调节已被注意到赋予神经保护, 因此提示小胶质细胞可能有治疗潜力的脑损伤。然而, 需要更多的研究, 以更好地了解小胶质细胞在疾病中的作用, 这项议定书有利于这一点。下面描述的协议结合了密度梯度离心过程, 以减少细胞碎片, 与磁性分离, 产生一个高度纯净的主要胶质细胞样本, 可用于体外实验, 没有需要2-3 周的培养。此外, 这些表征步骤产生了关于小胶质细胞的强健的功能数据, 帮助研究, 以更好地了解这两种干细胞的极化和启动, 这在再生医学领域具有很强的意义。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

围产期期间从炎症、缺氧缺血性和出血中获得的损伤可以有一系列的长期后遗症。围产期脑损伤的复杂病理生理学理论涉及炎症和缺血与随后的神经和轴突死亡1。先天免疫应答在导致伤害的一连串事件中起重要作用2。

小胶质细胞, 中枢神经系统 (CNS) 内的居民免疫单元, 是伤害3的第一个应答者。小胶质细胞是具有保护或毒性能力的塑料电池类型, 依赖于环境4。它们参与趋化、吞噬、抗原表达和细胞因子的产生和活性氧种类的4,5。衰老小胶质细胞不断地对环境进行调查, 并由异物或有害物质的存在4激活。激活会导致一种支持炎症的响应, 在 CNS 保护4中至关重要。这些 M1 的 "亲炎" 表型小胶质细胞主要参与抗原表示和病原体的死亡4。尽管炎症反应在神经保护中起着关键作用, 但不受控制或长时间的炎症可能有害, 导致神经元损伤4。然而, 当暴露在某些环境刺激, 小胶质细胞可以表现出一种抗炎的表型。这些支持修复的 M....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

下列程序已获在莫纳什大学动物伦理学委员会批准。健康未经治疗的新生儿 C57Bl6/J P3-6 小鼠被用来产生代表性的结果。

1. 酶消化

注意: 在分离和培养主细胞时, 考虑不孕是很重要的。虽然确保环境尽可能的不育, 但最初的解剖和小鼠大脑的收获可以在层流流罩之外完成, 随后的所有步骤都在层流罩内进行。

  1. 使用无菌器械, 弄死小鼠颈椎脱位, 斩首动物, 用100% 乙醇冲洗。使用小的不育剪刀, 使小切口沿左右两侧的头部。在这个年龄, 皮肤很容易脱落。使用弯曲钳的尖端, 轻轻地滑向讲台上的组织, 以揭露头骨, 包括 Bregma。
  2. 在椎管内的开口插入剪刀尖端, 并在耳道上进行侧向切口。沿矢状缝线切开 Bregma, 轻轻地指着剪刀的尖端, 以防止损伤大脑。在 Bregma 上插入剪刀尖端, 并沿冠状缝合在头部的左右两侧进行侧向切口。
  3. 使用镊子, 轻轻剥去头骨暴露大脑。要做到这一点, 掌握侧切口暴露的颅骨边缘, 轻轻地将头骨拉到侧面。头骨应该很容易剥开。使用弯曲钳, 轻轻铲下大脑, 以消除它。
  4. 将大脑放置在5毫升无菌容器中, 用冷洗介质 (低葡萄糖 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM) 补充1% 青霉素-链霉素), 大约5毫升介质每洗涤, 以去除血液。
  5. 在层流气流罩, 放置5毫升容器的内容在一个小的培养皿 (35 毫....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用此处概述的方法, 可以隔离小胶质细胞的纯种群, 并可以使用体外和资产管制分析来进行表征。首先, 多达18只动物可以使用每一个剔除, 预期产量约 45万-60万胶质细胞。首先确认分离细胞的纯度是至关重要的, 这样做是通过对两个标记 CD45 和 CD11b 的染色来进行的. 胶质细胞的鉴定可以证明是麻烦的, 因为小胶质细胞表达的许多标记也表达了巨噬细胞, 并使用这两个标记, 使准确和可靠的量化。具体地说, 小胶质细胞的 CD45 表达低, 与中枢神经系统和外周巨噬鼠的高表达相比, 也对 CD11b (图 1) 是阳性的。从这个特殊的隔离, 报告了纯度89.3%。CD11b 染色后, 我们注意到, 我们的主要小胶质细胞具有相似的形态学特征, 从明显的 unramified (大的球状体细胞体, 很少或没有扩展的过程) 的范围, 以更分支 (与更小, 更椭圆胞体和通常由次要顺序进程组成) 与一系列激活状态相关, 如预期的那样, 可以看到在体内 (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小胶质细胞具有支持和抗炎的能力, 通过环境刺激改变。先前的研究表明, 小胶质细胞活化的调节可以赋予神经保护作用。他们为神经元提供保护和修复损伤的能力需要更多的研究来进一步了解这些复杂细胞的现状。因此, 高纯度原发性小胶质细胞的分离是一项重要而有用的技术。这是一个相对较快的方法, 获得高纯度的主要小胶质细胞为体外实验在2天内准备好。

文献中描述了一系列的协议, 用于从小鼠脑中分离出原发胶质细胞。主要的挑战是有效地生产足够的样品, 高的活力和纯度。该协议的主要优点是高纯样本的收益率, 而不需要在文化中的时间。因此, 该方法从2周缩短到2天, 这有助于快速的结果。这些特征步骤产生了关于小胶质细胞的强健的功能数据, 增强了对这些复杂单元的当前理解。该协议结合了两种电流方法-密度梯度离心和磁分离。相对于其他隔离技术14,15,16, 在文献中对小胶质细胞的分离进行了很好的验证。虽然对孤立的.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM，低葡萄糖，丙酮酸Gibco11885084
抗生素-抗真菌剂 （100X）Gibco15240062
DNaseI II 级，来自Sigma-Aldrich10104159001
瓜蛋白酶，缓冲水溶液Sigma-AldrichP3125-100mg
胎牛血清，合格，热灭活Gibco16140071
PercollGE Healthcare17-0891-01
Hank's 平衡盐溶液 （1X）Gibco14175-103
Hank's 平衡盐溶液 （10X）Gibco14185052
EasySep 小鼠 CD11b 阳性选择试剂盒StemCell Technologies18770EasySep 磁力架变体
EasySep 磁力StemCell Technologies18000
EasySep 缓冲液StemCell Technologies20144
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水Gibco14040182
胰蛋白酶 （2.5%） （10X）Gibco15090-046
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc Block™）BD Biosciences553141
Falcon 5mL 圆底高透明度 PP 试管，带卡口盖，无菌康宁352063
175cm²带通气盖的斜颈细胞培养瓶Corning431080
来自大肠杆菌 O127：B8 的脂多糖Sigma-AldrichL5024
96 孔经 TC 处理的微孔板 规格 96 孔，透明，聚苯乙烯，圆底CorningCLS3799
多聚甲醛（粉末，95%）Sigma-Aldrich158127
Triton-XSigma-AldrichX100
兔抗 IBA1和光01919741 
山羊抗兔 IgG H&L （Alexa Fluor 488）Abcamab150077
FACS 抗体公司目录号
V450，大鼠，抗小鼠，CD45,30-F11，RUOBD Biosciences560501
PerCP-Cy5.5 CD11b eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Red 大肠杆菌生物颗粒偶联物Thermo Fisher ScientificP35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
碘化物前足溶液Miltenyi Biotech130-093-233
木瓜乳胶的 木架

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia IsolationDensity Gradient CentrifugationMagnetic SeparationPrimary MicrogliaPercoll GradientCell CountingTrypan Blue StainingCD11b LabelingHemocytometer AnalysisPercoll Layering

Related Articles