本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。
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通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离
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摘要
摘要
小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，当中枢神经系统发生炎症或损伤时，它们是首先响应的细胞。近期研究表明，小胶质细胞具有高度动态性，能够呈现促炎性和抗炎性两种表型。在围产期脑损伤等神经炎症条件下，M1（促炎性）和M2（促修复性）表型均发挥重要作用，并在特定环境刺激下表现出不同的功能。研究发现，调控小胶质细胞的活化状态可产生神经保护作用，提示小胶质细胞在脑损伤治疗中具有潜在应用价值。然而，仍需进一步研究以更深入理解小胶质细胞在疾病中的作用，本实验方案为此提供了支持。以下所述方案结合了密度梯度离心法以减少细胞碎片，以及磁性分选技术，可获得高纯度的原代小胶质细胞样本，用于 体外 实验无需2-3周的培养即可进行。此外，表征步骤可提供关于小胶质细胞的可靠功能数据，有助于深入理解这些细胞的极化与启动状态，对再生医学领域具有重要意义。
引言
围产期因炎症、缺氧缺血和出血所导致的损伤可能引发多种长期后遗症。围产期脑损伤复杂的病理生理过程被认为涉及炎症和缺血，进而导致神经元和轴突死亡1。先天免疫反应在导致损伤的一系列事件中起着重要作用2。
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）内的常驻免疫细胞，是损伤后最先响应的细胞3。小胶质细胞具有可塑性，其功能既可以是保护性的，也可能是毒性的，具体取决于所处的环境4。它们参与趋化作用、吞噬作用、抗原呈递以及细胞因子和活性氧物质的产生4,5。静息状态的小胶质细胞持续监测周围环境，并在遇到外来或有害物质时被激活4。激活后会引发促炎反应，这对中枢神经系统的保护至关重要4。这类M1型"促炎性"表型小胶质细胞主要参与抗原呈递和病原体清除4。尽管炎症反应在神经保护中具有关键作用，但不受控制或持续过久的炎症可能有害，并导致神经元损伤4。然而，在某些环境刺激作用下，小胶质细胞也可表现出抗炎表型。这类具有修复功能的M2型小胶质细胞在伤口愈合与组织修复中发挥关键作用6，可释放多种细胞因子及其他可溶性介质，从而下调炎症反应、增强吞噬作用并促进修复过程4,7。小胶质细胞的功能多样，包括在再髓鞘化过程中促进少突胶质细胞分化8，在脑卒中模型中缺氧缺糖条件下保护神经元9，以及在脊髓损伤模型中促进神经突生长10。
研究这些胶质细胞对于理解并调控神经炎症反应具有重要意义。本方案描述的方法有助于进一步探究小胶质细胞调控在神经炎症性疾病中的治疗潜力。
在多种条件下，已观察到小胶质细胞活化向神经保护作用的调控11,12,13。因此，加深当前对小胶质细胞活化调控的理解并进一步开展相关研究至关重要，这需要采用包括体外（in vitro）和体内（in vivo）在内的多种模型。由于效率更高、成本更低，并且能够研究孤立的细胞群体，体外（in vitro）研究已成为一种重要的工具。
文献中已描述了多种从小鼠脑组织中分离小胶质细胞的方案，其挑战在于如何高效地获得高产量、高活性且高纯度的细胞样本。目前常用的小胶质细胞原代分离方法包括磁珠分选法以及混合胶质细胞培养物的长时间振荡法。根据实践经验发现，磁珠分选过程中常出现大量细胞碎片，阻碍磁性柱的分离效果。因此，本文采用了一种结合初始密度梯度离心和CD11b磁珠分选的改进方案。下述方案经过优化，可获得数量充足且纯度极高的小胶质细胞。该方法的优势在于纯度高、耗时短——可在2天内完成细胞分离并直接进行功能检测，无需进行2至3周的长期培养。此方案未来亦有望适用于原代小鼠星形胶质细胞的分离。
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方案
以下实验程序已获得莫纳什大学动物伦理委员会的批准。实验使用健康、未经处理的新生C57Bl6/J品系P3-6小鼠以获得代表性结果。
1. 酶消化
注意：在分离和培养原代细胞时，必须考虑无菌条件。尽管应尽可能确保环境无菌，小鼠脑组织的初始解剖和收获步骤可在超净工作台外完成，但后续所有操作均须在超净工作台内进行。
- 使用无菌器械通过颈椎脱位法处死小鼠，将动物断头后用100%乙醇冲洗。用小型无菌剪刀沿头部左右两侧做小切口。在此年龄段，皮肤易于剥离。用弯头镊尖端轻轻将组织向吻端滑动，暴露颅骨，包括前囟（Bregma）。
- 将剪刀尖端插入脊髓管开口处，向耳道方向做侧向切口。沿矢状缝切至前囟（Bregma），操作时轻轻将剪刀尖向上翘起，以避免损伤脑组织。将剪刀尖置于前囟处，沿冠状缝向头部左右两侧做侧向切口。
- 用镊子轻轻剥离颅骨以暴露脑组织。操作时夹住侧向切口暴露出的颅骨边缘，轻柔地将颅骨向一侧拉起，颅骨应可轻松剥离。使用弯头镊子轻轻从脑组织下方插入，将脑组织完整取出。
- 将脑组织放入一个5 mL无菌容器中，用冰浴预冷的洗涤液（低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加1%青霉素-链霉素）清洗2–3次，每次约5 mL，以去除血液。
- 在超净工作台中，将5 mL容器中的内容物转移至一个置于冰上的小培养皿（35 mm）。使用无菌手术刀片或无菌剪刀，去除小脑和嗅球。沿中线切开，分离两个半球。
- 用精细镊子小心剥离脑表面的脑膜层，注意避免损伤皮层组织。脑膜层为覆盖在脑表面的一层极薄且略带红色的细胞层，可见血管结构。保持脑组织低温对于有效去除脑膜至关重要。若脑膜层破裂，应继续剥离断裂的碎片，直至完全清除。
- 将脑半球转移至另一个置于冰上的小培养皿中，并加入洗涤液。使用无菌手术刀片或剪刀将脑组织切成小块。
注意：组织块大小应约为1 mm2，注意不要切得过小，以免降低细胞得率。 - 向培养基中加入100 µL木瓜蛋白酶（17 U/mg 原液）和150 µL DNase I，于37 °C孵育30分钟。
- 消化完成后，使用P1000移液器吹打组织进行分散。若组织块过大无法进入移液枪头，可考虑使用无菌剪刀适当扩大枪头开口。操作过程中应避免引入气泡，以防降低细胞活力。
2. 髓鞘碎片清除
- 在超净工作台内使用无菌器械，为每只脑组织准备一个装有100 µm细胞筛网的50 mL锥形管。将含有消化液和脑组织碎片的培养皿内容物倒入筛网中，用无菌3 mL注射器的推杆以研磨动作推动脑组织碎片，直至肉眼不可见组织块。消化完成后，脑组织应易于解离。
- 在整个过程中持续用洗涤液冲洗滤膜，通过不断补充细胞筛网中的液体完成冲洗，以洗去滞留在筛网中的细胞。
注意：此步骤应持续至管中液体体积约为~15 mL。目的是确保充分冲洗筛网，并最大化收集细胞数量。 - 将单细胞悬液在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。在此期间，按以下方法准备密度梯度介质。
- 配制等渗Percoll储备液（SIP），即所用的密度梯度介质。按密度梯度介质与10倍无菌Hanks平衡盐溶液（HBSS）以9:1的比例混合配制。
- 配制30% SIP的DMEM溶液和70% SIP的1× HBSS溶液。例如，配制10 mL的30% SIP溶液时，将3 mL SIP加入7 mL DMEM中。
- 吸除锥形管中的上清液，用8 mL含30% SIP的DMEM重悬细胞沉淀。将全部液体转移至新的15 mL锥形管中。
- 将70% SIP溶液铺于下层。操作时，用移液器吸取70% SIP溶液，小心地将移液器插入锥形管底部，当管尖接近管底时，缓慢推出其中内容物。
注意：操作应缓慢进行，避免破坏30%与70% SIP之间的界面，两层之间必须形成清晰的分界线。 - 将含细胞的SIP分层液在室温下以650 × g离心25分钟，设置刹车为0，加速度为4。
注意：离心结束时必须关闭刹车，让离心机自然缓慢停止，因为使用刹车会破坏中间相界面，显著减少两层SIP之间单核细胞的回收量。 - 吸除管顶的细胞碎片，并从上层移除约4 mL培养基，以便于下一步单核细胞的收集。使用P1000移液器，将吸头小心地插入两相界面处，从30%/70%密度梯度介质界面分离单核细胞。从浑浊的界面处收集约3 mL液体，转移至新的15 mL锥形管中。随后加入9 mL HBSS稀释混合液，以利于去除密度梯度介质。
- 将含有单核细胞的稀释后密度梯度介质中间相在500 × g条件下离心5分钟。吸除上清液后，用1 mL生长培养基（DMEM添加10%胎牛血清和1%抗生素）重悬细胞。随后用台盼蓝染色重悬的细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
3. 磁珠激活细胞分选
注意：这些步骤已根据制造商的方案进行了修改。
- 将收集的单个核细胞在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，以去除会干扰磁性分离的生长培养基。根据步骤 2.8 获得的相同细胞计数，重悬于 1 × 108 每毫升 PBS（含 Ca）中的有核细胞数++ 和 Mg++ 含2% FBS和1 mM EDTA的无钙缓冲液，体积范围为0.1–2.5 mL。
- 将上一步骤中PBS中的全部有核细胞加入到一个新的5 mL（12 × 75 mm）聚苯乙烯圆底管中。每1 mL样本加入50 µL CD11b PE标记试剂。室温避光孵育15分钟。
- 每1 mL样品中加入70 µL分选混合液（含针对CD11b的单克隆抗体，溶于PBS中）。避光，室温孵育15分钟。
- 用移液器反复吹打磁性颗粒超过5次以混匀。按每毫升样品加入50 µL的量添加。室温避光孵育10分钟。
注意：这些颗粒将与抗体形成四聚体复合物，并附着于磁性柱上。 - 如果细胞混合物的总体积小于2.5 mL，用PBS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）补足至该体积。++ 和 Mg++ 加入含2% FBS和1 mM EDTA的缓冲液，轻轻吹打2-3次混匀。将离心管（不盖盖子）放入磁力架中，室温孵育5分钟。
- 一次性连续操作，将带有离心管的磁铁完全倒置2-3秒，倾去上清液。将磁铁恢复至直立位置，取下离心管。准备用洗涤液冲洗柱中剩余的细胞。
注意：上清液中含有未标记的非目标细胞，在磁铁中将离心管倒置以去除这些细胞。离心管中保留有结合的Cd11b+ 细胞 - 重复步骤3.5和3.6再洗涤细胞两次。如果样品体积大于1 mL，建议再次重复步骤3.5和3.6。
- 将细胞重悬于所需的培养基中。同时冲洗收集容器的管壁。例如使用15 mL离心管收集管壁上的细胞，以最大限度提高得率。
4. 小胶质细胞纯度的验证
注意：从 3 只动物（总计 n = 5）分离得到的原代小胶质细胞通过荧光激活细胞分选（FACS）验证纯度，以获得代表性结果。
- 将细胞以每瓶 1 - 2 × 106 个细胞的密度接种于含 10% FBS 的生长培养基中，在 T-25 培养瓶中过夜培养。
- 用 PBS 洗涤 T-25 培养瓶中的细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次，以去除可能干扰胰蛋白酶消化的残留培养基。
- 加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶，使细胞从培养瓶表面脱落。确保胰蛋白酶体积足以覆盖整个培养瓶表面。轻轻晃动培养瓶以保证胰蛋白酶均匀覆盖后，于 37 °C 培养 5 分钟。
- 向培养瓶中加入含 10% FBS 的生长培养基 2 mL，以终止胰蛋白酶消化过程。
- 收集含有胰蛋白酶消化后细胞的上清液，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟，以收集细胞。
- 弃去含有生长培养基和胰蛋白酶的上清液，将沉淀重悬于 500 μL FACS 缓冲液中。使用台盼蓝进行细胞计数。
- 于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。通过每 5 × 106 个细胞加入 50 μL FACS 缓冲液 + 1 μL FcR 阻断剂进行 Fc 受体阻断。于 4 °C 孵育 15 分钟。
注意：Fc 受体阻断是染色过程中的关键步骤，可防止免疫球蛋白非特异性结合至免疫细胞群体中的 Fc 受体。此阻断不会影响其他抗体的下游结合。 - 加入 500 μL FACS 缓冲液稀释以终止阻断过程。随后，将含有细胞的混合物于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。
- 将细胞重悬于新鲜的 500 μL FACS 缓冲液中。
- 将大部分细胞（例如，若将细胞重悬于 500 μL FACS 缓冲液中，则取 400 μL）转移至样品管中。将剩余细胞分配至各对照管中，并补加 FACS 缓冲液至每管 100 μL（例如，对于 6 个对照管，每管加入 16.67 μL，再补加 83.33 μL FACS 缓冲液）。设置分组（对照管加粗）为：未染色组、单染组（CD45、CD11b）、活/死细胞单染组、FMO 组及样品管。
- 将所有管中的细胞于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟，形成沉淀。
- 每 5 × 106 个细胞使用 1 μL 抗体溶于 100 μL FACS 缓冲液中对管内细胞进行染色。于 4 °C 孵育 20 分钟。
注意：若细胞数量少于 2 × 106 个，则使用 50 μL 抗体混合液。 - 用 500 μL FACS 缓冲液洗涤细胞。于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。
- 将细胞重悬于 300 μL FACS 缓冲液中。
注意：若细胞数量少于 2 × 106 个，则使用约 100 μL。 - 通过流式细胞术分析，定量 CD45low 且 CD11b 染色阳性的细胞比例。该百分比即为分离得到的原代小胶质细胞。
5. 原代小胶质细胞的免疫组织化学染色
- 将细胞以1 × 105个细胞的密度接种于96孔板中，加入生长培养基，过夜培养。
- 移除上清液，并用PBS洗涤3次。
- 用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞15分钟。用P1000移液器移除PFA，然后用含0.1% Triton-X的PBS洗涤3次。
- 用3%牛血清白蛋白在室温下封闭非特异性结合位点，孵育1小时。
- 加入兔源Iba-1一抗（1:100），4 °C孵育24小时。随后移除一抗溶液，并用PBS洗涤3次。
- 加入抗兔IgG的GFP荧光二抗（1:200），室温孵育1小时。随后移除二抗溶液，并用PBS洗涤3次。
- 用荧光封片剂封片，并使用荧光显微镜采集图像。
6. 使用 pHrodo 检测法对小胶质细胞进行定量
注意：pHrodo 检测法可用于鉴定培养细胞中的吞噬作用水平。当生物颗粒偶联物通过内吞作用被摄取并进入更酸性的环境时，其荧光水平会增强。随后可通过流式细胞术（FACS）对荧光水平进行定量分析。以下步骤已根据试剂盒生产商的说明书进行了修改。
- 在T-25培养瓶中，以1 - 2 × 10⁶个细胞/mL的密度接种，于生长培养基中过夜培养6 每瓶细胞。用 PBS 清洗 T-25 培养瓶中的细胞，每次 5 分钟，共清洗 3 次。
- 使用 2 mL 0.25% 胰蛋白酶消化细胞，于 37 °C 培养 5 分钟。
- 通过向培养瓶中加入含有10%胎牛血清（FBS）的2 mL培养基来终止消化过程。
- 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 去除上清液，将含有原代小胶质细胞的沉淀重悬于培养基中，细胞密度为106 cells/mL
注意：或者，可在96孔板中接种细胞，至少提前一天，细胞密度以1 x 10⁵为目标5 每次检测时每孔的活细胞数 - 将细胞以每孔1 x 10⁴个的密度接种于96孔板中5 每孔细胞数/孔，每孔100 μL。设置对照组和实验组，每组设三个复孔，并为每个阳性对照保留一个无细胞的空孔，用于扣除背景。
- 向未接种细胞的孔中加入 100 μL 培养基，用于扣除无细胞背景值。
注意：与其他任何情况一样 体外 检测时，适当的对照对于读数的准确性至关重要。除无细胞对照（背景读数）外，还需设置阴性对照孔（加入pHrodo偶联物，但置于冰上）。 - 盖上培养板，在含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 1 小时2 在 37 °C。
- 通过添加刺激物和处理剂准备实验孔，在未处理孔中加入阴性对照（仅培养基）。
注意：使用脂多糖1 µg/mL [刺激物] 和人羊膜上皮细胞（hAEC）条件培养基 [处理] 获得代表性结果。 - 解冻一管偶联染料，加入2 mL摄取缓冲液并短暂涡旋。将管内液体转移至一支洁净的玻璃管中，超声处理5分钟，以确保颗粒均匀分散。
- 吸弃微孔板孔中的培养基，迅速加入100 μL染料悬浮液。盖好后于37 °C孵育1小时。
注意：请记得对对照管也进行染色。 - 使用流式细胞术分析，定量呈pHrodo偶联微球染色阳性的细胞，并以占亲代细胞百分比的形式表示具有活跃吞噬作用的小胶质细胞比例。
7. 炎症刺激后小胶质细胞凋亡的定量分析
- 重复步骤1-7 "小胶质细胞纯度验证" 部分
- 将大部分细胞置于（例如 如果将细胞重悬于500 μL FACS缓冲液中，则取400 μL加入样品管中。将剩余细胞分装至各对照管，每管补至100 μL。例如 对于6个对照管，每个对照管中加入16.67 μL，再用FACS缓冲液补至83.33 μL。分组（对照管加粗）：未染色、单染（Annexin V、碘化丙啶）、单次活/死染色、FMO对照、样本管。
- 将所有离心管中的细胞在500 × g下离心5分钟，使细胞沉淀。
- 在 100 μL FACS 缓冲液中加入 1 μL 抗体，与 5 × 10⁶ 细胞避光孵育6 4 °C 下孵育细胞 20 分钟。
注意：若少于 2 x 10⁶ 个细胞，使用 50 μL6 细胞 - 加入500 μL FACS缓冲液重悬细胞，500 x g离心5 min。
- 将细胞沉淀重悬于300 μL FACS缓冲液中。
注意：若细胞数量少于 2 x 10⁶，则体积约为 100 μL6. - 对每个象限内的细胞进行定量（Q1：坏死细胞，Q2：晚期凋亡细胞，Q3：活细胞，Q4：早期凋亡细胞）。
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结果
使用此处所述方法，可分离出纯化的 microglia 群体，并可用于后续表征分析 体外 以及流式细胞术分析。首先，每次处死最多可使用18只动物，预计可获得约450,000至600,000个小胶质细胞。至关重要的是，需首先确认所分离细胞的纯度，为此通过CD45和CD11b两种标记物染色进行流式细胞术分析。小胶质细胞的鉴定可能较为困难，因为小胶质细胞表达的许多标记物也同时表达于巨噬细胞；而使用这两种标记物可实现准确且可靠的定量。具体而言，与中枢神经系统及外周巨噬细胞中高表达的CD45相比，小胶质细胞CD45表达水平较低，且对CD11b呈阳性图1）。从此次特定分离中，报告的纯度为89.3%。在对CD11b染色后，我们注意到，我们的原代小胶质细胞具有相似的形态学特征，形态范围从明显非分枝状（具有较大球形胞体，突起极少或无）到更多分枝状（胞体较小、更呈椭圆形，通常具有至二级分支的突起），这与预期的多种活化状态相对应 体内 (图2...
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讨论
小胶质细胞具有促炎和抗炎双重潜能，其功能状态可受环境刺激的影响而发生改变。既往研究表明，调控小胶质细胞的活化状态可产生神经保护作用。小胶质细胞具备保护神经元和修复损伤的能力，因此有必要开展更多研究以深入理解这些复杂细胞的功能机制。因此，高纯度原代小胶质细胞的分离是一项重要且实用的技术。该方法可相对快速地获得高纯度的原代小胶质细胞，适用于后续实验 体外 2天内进行实验。
文献中描述了多种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的方案。主要挑战在于高效地获得足够数量、高活力和高纯度的样本。本方案的主要优势在于无需进行长时间的培养即可获得高纯度的细胞样本，从而将实验周期从两周缩短至两天，显著加快了研究进程。后续的表征步骤可提供关于小胶质细胞的可靠功能数据，有助于加深对这些复杂细胞当前的理解。该方案结合了两种现有方法——密度梯度离心和磁珠分选。磁珠分选在文献中已被广泛验证，相较于其他分离技术，能够以相对温和的方式分离小胶质细胞14,15,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM，低糖，含丙酮酸钠 | Gibco | 11885084 | |
| 抗生素-抗真菌素（100倍浓度） | Gibco | 15240062 | |
| 牛胰 DNase I，II 型 | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| 木瓜蛋白酶，来自木瓜乳胶，缓冲水溶液 | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| 胎牛血清，经鉴定合格，热灭活 | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's 平衡盐溶液（1倍浓度） | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's 平衡盐溶液（10倍浓度） | Gibco | 14185052 | |
| EasySep 小鼠 CD11b 阳性选择试剂盒 | StemCell Technologies | 18770 | EasySep 磁力架型号 |
| EasySep 磁力架 | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep 缓冲液 | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14040182 | |
| 胰蛋白酶（2.5%）（10倍浓度） | Gibco | 15090-046 | |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（Mouse BD Fc Block™） | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5 mL 圆底高透明度聚丙烯试管，带卡扣盖，无菌 | Corning | 352063 | |
| 175 cm² 倾斜颈细胞培养瓶，带通气盖 | Corning | 431080 | |
| 大肠杆菌 O127:B8 来源脂多糖 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 孔 TC 处理微孔板，96 孔，透明，聚苯乙烯，圆底 | Corning | CLS3799 | |
| 多聚甲醛（粉末，95%） | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 兔抗 Iba1 抗体 | Wako | 01919741 | |
| 山羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150077 | |
| FACS 抗体 | 公司 | 目录编号 | |
| V450，大鼠，抗小鼠，CD45，30-F11，仅供科研使用 | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 标记 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red 标记的大肠杆菌生物颗粒偶联物 | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin V-FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| 碘化丙啶溶液 | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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