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方法文章

疟疾感染期间细胞外囊泡功能的评估

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DOI：

10.3791/57067

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2018年2月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Fribourg

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在这项工作中，我们描述了研究细胞外囊泡（EVs）释放作用的实验方案 恶性疟原虫 感染的红细胞。特别是，我们重点关注细胞外囊泡（EVs）与内皮细胞之间的相互作用。

摘要

疟疾是一种由疟原虫引起的危及生命的疾病 疟原虫 寄生虫，与 P. falciparum 是非洲大陆上最流行的疟原虫种类，也是全球大多数疟疾相关死亡病例的原因。多种因素影响疟疾感染者的疾病进展，包括寄生虫在组织中的滞留、血管功能障碍以及炎症反应。 P. falciparum感染的红细胞（iRBCs）会释放含有多种 cargo 分子的小细胞外囊泡（EVs），这些分子介导寄生虫与宿主之间的致病过程及细胞间通讯。EVs 能被细胞高效摄取，并在其中调节细胞功能。本文讨论了研究 EVs 在寄生虫-宿主相互作用中作用的策略。首先，我们描述了一种使用绿色细胞连接染料标记并追踪内皮细胞摄取 EVs 的简便方法。其次，我们介绍了一种利用荧光标记葡聚糖检测内皮细胞单层通透性的简单方法。最后，我们展示了如何研究小非编码 RNA 分子在内皮细胞功能中的作用。

引言

根据世界卫生组织的数据，2015年全球共有2.12亿例新增疟疾病例，约42.9万人死亡，其中主要是五岁以下儿童1。导致重症疟疾的机制尚不明确，而重症常与血管功能障碍相关2。Plasmodium-iRBCs会分泌一种称为细胞外囊泡（EVs）的小型双层脂质膜结构。已知这些EVs可能与感染过程以及宿主对感染的免疫反应有关，但目前对这些小囊泡在疟疾感染期间的确切功能仍了解甚少3。它们可能发挥两种重要作用：一方面，它们可能通过激活巨噬细胞促进疾病发生4,5；另一方面，它们可能介导寄生虫之间以及寄生虫与宿主之间的细胞间通讯6,7。事实上，寄生虫可通过EVs在彼此之间转移蛋白质或核酸。例如，Trypanosoma brucei rhodesiense的EVs可转移毒力因子血清抗性相关蛋白（SRA），并可靶向其他T. brucei以及宿主红细胞8。此外，P. falciparum-iRBCs可通过EVs内部转移核酸实现相互通讯，从而优化并同步其生长。事实上，EVs可能是配子体转化的主要调控因子，因此在传播阶段的调控中发挥重要作用7。

细胞外囊泡（EVs）不仅调控寄生虫，还介导寄生虫与宿主之间的相互作用。我们最近发现，感染红细胞（iRBCs）来源的EVs含有宿主来源的微小RNA（miRNAs；长度为21–25个核苷酸的小RNA分子9），这些miRNAs可被人类内皮细胞摄取。EVs中的miRNAs与Ago2（RNA诱导沉默复合体的一个组分）形成稳定的复合物，当该复合物被递送至受体细胞后，能够特异性地沉默基因表达，并影响细胞的屏障特性10。目前已有标准方案用于研究EVs的功能。本文首先描述一种可对EVs进行荧光标记的实验方案，以研究其被受体细胞摄取的过程。此外，通过共聚焦显微镜，可以追踪EVs进入细胞后的去向。多种荧光染料可用于EVs的示踪。胺反应性染料5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）和Calcein-AM在进入囊泡后会发出荧光。我们更倾向于使用两亲性染料PKH，因其可产生更明亮且更均匀的信号。该方法为理解EVs与受体细胞之间的相互作用提供了重要信息。在某些情况下，EVs仅结合于细胞表面，而另一些囊泡则被迅速摄取。一旦被摄取，EVs即将其携带的分子 cargo 递送至细胞内部，并在其中发挥其调控功能。

此处，我们介绍一种用于测量内皮细胞屏障功能的实验方案 体外 通过定量荧光标记葡聚糖穿过细胞单层的转运来实现。也可使用更敏感的示踪剂，如放射性标记物，但其使用需要特殊的安全防护措施。此外，还有其他检测方法可用于测量 体外 屏障功能，例如跨内皮电阻（TEER），用于评估紧密连接的完整性。最后，通过免疫荧光观察紧密连接蛋白ZO-1，也可对紧密连接的完整性进行评估10由于细胞外囊泡（EVs）是包含多种具有潜在调控特性的 cargo 分子的复杂且异质性的实体，过表达特定 RNA 以研究其对受体细胞的影响具有重要意义。因此，我们还定义了一种旨在构建稳定表达目标 miRNA 的细胞系的实验方案。10.

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方案

人红细胞根据Swissethics（swissethics.ch）的指南，从健康供体的血液中获取。

注意： P. falciparum 寄生虫培养（3D7）和EV的制备此前已在Mbagwu中描述， 等.11 因为 P. falciparum 是一种人类病原体，请查阅当地关于处理的法规。培养物应始终保持无菌状态。

1. 细胞外囊泡（EVs）的荧光标记

注意：以下步骤利用标记技术，将一种带有大脂肪族尾链的绿色荧光染料（PKH67）稳定地掺入到细胞外囊泡（EV）膜的脂质区域。反应在200 µL的终体积中进行，其中PKH67的终浓度为20 µM。所有操作步骤均在室温（20–25 °C）下进行。

  1. 在微量离心管中，将100 µg的EVs加入1 mL的PBS中。
  2. 在微量离心管中以最大速度（20,000 × g）离心7分钟，使EVs沉淀。
    注意：由于EVs中含有疟色素（hemozoin），应观察到红色至深棕色沉淀。若上清液呈红色，则表明EVs已裂解。
  3. 离心后，小心吸弃上清液，避免带走任何EVs。
    注意：在用稀释液C重悬EVs前，尽量减少残留缓冲液体积，以提高染色的可重复性和效率。
  4. 用100 µL稀释液C（2× EV悬浮液）重悬EV沉淀，并轻轻吹打以确保完全分散。
  5. 准备一个新的微量离心管，将4 µL PKH67乙醇染料溶液加入100 µL稀释液C中，充分涡旋混匀。在染色前立即配制该2×染料溶液（40 µM）。
    注意：为避免染色不均，切勿将PKH67乙醇染料溶液直接加入EV沉淀中。
  6. 迅速将100 µL的2× EV悬浮液（步骤1.4）与100 µL的2×染料溶液（步骤1.5）混合，然后通过移液器上下吹打10次混匀样品。
  7. 将步骤1.6得到的EV/染料悬浮液避光孵育5分钟，并在孵育期间涡旋混匀3–4次。
    注意：延长EV/染料悬浮液的孵育时间并无益处，因为染色过程非常迅速。
  8. 加入等体积（200 µL）的血清以终止染色反应，孵育1分钟，使过量染料得以结合。
    注意：在终止染色前，需将血清在20,000 × g下离心20分钟以去除其中的EVs。
  9. 用PBS洗涤3次，每次在20,000 × g下离心5分钟。最后将EVs重悬于100 µL PBS中，使其终浓度达到1 µg/µL。

2. 通过共聚焦显微镜观察细胞外囊泡的摄取

注意：以下方案描述了在玻璃盖玻片上培养的内皮细胞对细胞外囊泡（EV）内化的追踪过程。所用内皮细胞为半永生化的人骨髓内皮细胞，如文献12所述。

  1. 在无菌环境中，将过量的0.01%多聚-L-赖氨酸加入盖玻片，室温（RT）孵育10分钟。
  2. 吸除多聚-L-赖氨酸溶液，使盖玻片完全干燥。
  3. 使用台盼蓝排斥法和血细胞计数板进行活内皮细胞计数。
  4. 将1 × 105个内皮细胞悬于1 mL含有补充剂混合物的完全内皮细胞生长培养基中，加入至多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，使细胞生长形成单层。
    注意：该培养基含有促进细胞形成单层及紧密连接的生长因子。
  5. 当细胞形成单层后，小心吸除培养基，加入1 mL新鲜培养基洗涤细胞，重复洗涤一次。加入50 µg PKH67标记的细胞外囊泡（EVs），孵育4小时。
    注意：为确定最佳摄取时间点，可进行时间进程实验。
  6. 孵育4小时后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞3次以去除过量及未结合的EVs。用含3%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞15分钟。
    注意：甲醇可能在固定过程中破坏肌动蛋白结构，因此应避免使用含甲醇或其他溶剂型的固定剂。推荐使用无甲醇的甲醛固定剂。
  7. 用PBS洗涤细胞3次。小心加入250 µL含0.1% Triton X-100的PBS溶液以通透细胞，室温孵育5分钟。
  8. 用PBS洗涤3次。每张盖玻片加入400 µL封闭缓冲液（含5% BSA的PBS），室温封闭30分钟，以阻断非特异性结合。
  9. 用PBS洗涤细胞一次。通过将每张盖玻片所需的5 µL鬼笔环肽储备液稀释于200 µL PBS/1% BSA中配制染色液。每张盖玻片加入200 µL染色液，室温孵育20分钟。
  10. 用PBS洗涤3次。用Hoechst 33342在200 µL PBS中稀释至终浓度2 µg/mL，对DNA进行复染，染色30秒。
  11. 加入400 µL PBS，洗涤盖玻片两次。用镊子小心夹起盖玻片，将其倒置在载玻片上的一滴抗荧光淬灭封片剂液滴上。用纸巾轻轻吸去多余封片剂，并用指甲油密封四周。
  12. 将载玻片置于4 °C避光保存。
  13. 使用共聚焦显微镜观察细胞，激光激发波长分别为405、488和543 nm，配备63X、1.3 NA油镜，荧光发射波长分别为450–470 nm（蓝色）、505–530 nm（绿色）和620 nm。
    注意：典型的F-肌动蛋白染色结果见图1。

3. 内皮细胞通透性

注意：通过测量罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖（平均分子量70,000）穿过内皮细胞单层的转运情况，来评估内皮细胞通透性。葡聚糖是研究血管通透性的理想工具。

  1. 使用0.4%台盼蓝排斥法和血细胞计数板对活内皮细胞进行计数。
  2. 将内皮细胞以0.6 × 105 个细胞的密度接种至24孔组织培养小室（孔径0.4 µm）中，培养至形成融合单层，静置至少5天以形成分化单层结构。每隔两天更换一次培养基。
  3. 当细胞形成单层后，在上室加入细胞外囊泡（EVs，50 µg溶于1 mL）。在上室加入罗丹明标记的葡聚糖，使其终浓度为20 mg/mL。将细胞置于37 °C、5% CO2 条件下孵育。
  4. 通过检测40 µL培养基等分样品的荧光发射，监测荧光标记葡聚糖向底部小室的转移情况。将多功能微孔板读数仪的激发波长设为544 nm，发射波长设为590 nm进行测定。
    注意：可通过标准储备液建立的标准曲线对扩散的葡聚糖量进行定量。此外，可通过在不同时间点取样外室培养基进行动力学实验（图2）。即使未经任何处理，葡聚糖也会透过细胞单层发生扩散。

4. 确定嘌呤霉素敏感性

注意：在用慢病毒转导细胞系之前，确定所选药物针对该特定细胞系的杀灭曲线非常重要。为了确定能够杀死所有细胞所需的最低药物浓度，需使用所选药物的不同梯度浓度进行剂量反应实验。由于每种哺乳动物细胞系对药物的敏感性不同，在开始正式实验前，应按照下述方法建立杀灭曲线滴定实验，以确定抗生素的最佳作用浓度。

  1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将内皮细胞重悬于含有补充剂混合物的完全内皮细胞生长培养基中，调整细胞浓度至 1 × 105 个细胞/mL。
  2. 将 1 × 104 个细胞接种至 96 孔板中，每孔终体积为 100 µL 内皮细胞生长培养基。
  3. 每孔加入 100 µL 含抗生素的培养基，使抗生素终浓度为 0.1–10 µg/mL（见图 3）。
  4. 每隔 2 天在光学显微镜下使用 20 倍物镜观察细胞活力。将细胞培养 10–14 天，并根据细胞生长情况每 2–3 天更换一次含嘌呤霉素的培养基。
  5. 每孔加入 10 µL MTS 试剂，混匀后在标准培养条件下于 37 °C 孵育 4 小时。
  6. 将培养板在摇床上短暂振荡混匀，使用酶标仪在 490 nm 波长处测定处理组与未处理组细胞的吸光度（图 3）。

5. 使用慢病毒载体转导内皮细胞

  1. 转导前一天，在1 mL完全培养基中接种1 × 105个内皮细胞。当细胞融合度达到50–80%时进行转导。
  2. 将慢病毒在冰上解冻，并将病毒原液分装成小份，以避免反复冻融。在打开管盖前，先以200 × g离心30秒，防止液体溢出。
  3. 向细胞中加入六甲溴铵（hexadimethrine bromide），终浓度为8 µg/mL。
    注意：六甲溴铵有助于提高转导效率，但在某些情况下可能对细胞具有毒性。因此，应在转导前通过杀伤曲线实验确定其最佳使用浓度。
  4. 轻轻摇晃培养板以混匀，按适当的感染复数（MOI）加入适量的病毒颗粒（介于0.5–2 × 106个颗粒之间），再轻轻摇晃培养板30秒以充分混匀。
  5. 将细胞与病毒颗粒的混合物在室温下以300 × g离心45分钟，以提高转导效率。随后将细胞与病毒混合物在37 °C孵育过夜。
  6. 小心移除含病毒颗粒的培养基并妥善弃置，更换为新鲜的预热完全培养基。
  7. 从第二天开始进行嘌呤霉素筛选：移除培养基，并更换为含有先前在第4节中确定的正确浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（图3）。
  8. 在嘌呤霉素筛选后收集细胞，并按照试剂盒说明书使用RNA提取试剂盒提取RNA。
  9. 使用逆转录试剂盒对选定的miRNA进行cDNA合成（参见材料表）。
  10. 根据引用的方案13设置qPCR反应体系。

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结果

本文描述了研究细胞外囊泡（EVs）与宿主细胞相互作用的实验方案。通过共聚焦显微镜监测荧光标记的EVs的摄取情况（图1）。内皮细胞可高效摄取EVs，但可通过优化EVs的孵育时间以追踪其摄取过程。为了更准确地定位EVs在细胞内的分布，可用鬼笔环肽（phalloidin）对肌动蛋白进行染色。接下来，我们使用一种滤膜，在其上培养单层内皮细胞。将罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖（Rhodamine B isothiocyanate-dextran）加入滤膜上方的腔室，通过检测荧光葡聚糖向下方腔室的转移量来测定内皮单层的通透性（图2A）。通常情况下，随着EVs浓度的增加，内皮细胞的通透性会发生改变（图2B）。需要注意的是，应将细胞培养数天，以确保其形成完整的单层结构，否则染料会迅速穿过孔板中的细胞间隙。还需注意的是，即使未经处理，葡聚糖也会缓慢地透过细胞单层。

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讨论

多种寄生虫，包括弓形虫（Toxoplasma）、锥虫（Trypanosoma）、利什曼原虫（Leishmania）和毛滴虫（Trichomonas），可诱导感染的宿主细胞释放细胞外囊泡（EVs）。根据病原体的不同，这些释放的EVs可调节宿主免疫反应，或介导寄生虫之间的细胞间通讯6然而，目前关于这些小囊泡如何参与疟疾发病机制的证据仍然十分有限。本文中，我们介绍了几种研究细胞外囊泡（EVs）在疟疾中功能的方法。 疟原虫 感染。例如，EVs 被受体细胞摄取 体内 可通过使用 PKH67 荧光染料标记来高效监测。为确保标记的特异性，必须进行多项对照实验。需特别注意的是，PKH67 染料一旦与稀释液 C 混合，容易形成聚集体，因此必须设置仅含染料而不含 EVs 的对照组，以确定非特异性染色情况。共聚焦显微镜是区分结合于细胞表面与真正被受体细胞内化的囊泡的首选方法。此外，该技术为追踪和监测细胞摄取囊泡数量提供了优良工具。然而，EVs 在受体细胞内的后续加工处理过程仍不明确14因此，采用2、4和8小时的时间点进行时间过程...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分得到了诺华医学与生物学研究基金会（资助对象：PYM）、戈特弗里德与朱莉娅·班格特-赖纳基金会（资助对象：MW 和 PYM）以及弗里堡大学研究基金（资助对象：PYM）的经费支持。其他资助还包括瑞士政府外国学者卓越奖学金（资助对象：KAB 和 SM）。我们感谢伊莎贝尔·费莱（Isabelle Fellay）和索朗日·哈鲁比·赫斯（Solange Kharoubi Hess）提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒（小包装）Sigma-AldrichMINI67-1KT
稀释液 CSigma-AldrichG8278
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP8920
PBS赛默飞世尔科技 - 吉布科10010023
Phalloidin CF594Biotium#00045
Hoechst 33342ThermoFisherH3570
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂赛默飞世尔科技P36934
罗丹明B异硫氰酸酯–葡聚糖ThermoFisherR9379-250MG
带PET膜的透明Falcon插入件 24孔板Falcon353095
内皮细胞生长 中等 MVPromocellC-22020
嘌呤霉素二盐酸盐Sigma-AldrichP9620-10ML
MTS细胞增殖比色法检测试剂盒BiovisionK300-500
六亚甲基溴化物Sigma-Aldrich107689-10G
使命 Lenti microRNA，人 hsa-miR-451aSigma-AldrichHLMIR0583
MISSION Lenti microRNA，ath-miR416，阴性对照1 转导颗粒Sigma-AldrichNCLMIR001
使命 人源Lenti microRNASigma-AldrichNCLMIR0001
Leica TCS SP5徕卡显微系统
miRNeasy mini试剂盒Qiagen217004
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒 1000 次反应赛默飞世尔科技4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR 反应ThermoFisher001141
U6 snRNAThermoFisher001973
TaqMan Universal Master Mix II，含 UNG赛默飞世尔科技4440038
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统ThermoFisher4376600

参考文献

  1. WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727(2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).

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