在这项工作中，我们描述了研究细胞外囊泡（EVs）释放作用的实验方案 恶性疟原虫 感染的红细胞。特别是，我们重点关注细胞外囊泡（EVs）与内皮细胞之间的相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
疟疾是一种由疟原虫引起的危及生命的疾病 疟原虫 寄生虫，与 P. falciparum 是非洲大陆上最流行的疟原虫种类，也是全球大多数疟疾相关死亡病例的原因。多种因素影响疟疾感染者的疾病进展，包括寄生虫在组织中的滞留、血管功能障碍以及炎症反应。 P. falciparum感染的红细胞（iRBCs）会释放含有多种 cargo 分子的小细胞外囊泡（EVs），这些分子介导寄生虫与宿主之间的致病过程及细胞间通讯。EVs 能被细胞高效摄取，并在其中调节细胞功能。本文讨论了研究 EVs 在寄生虫-宿主相互作用中作用的策略。首先，我们描述了一种使用绿色细胞连接染料标记并追踪内皮细胞摄取 EVs 的简便方法。其次，我们介绍了一种利用荧光标记葡聚糖检测内皮细胞单层通透性的简单方法。最后，我们展示了如何研究小非编码 RNA 分子在内皮细胞功能中的作用。
引言
根据世界卫生组织的数据，2015年全球共有2.12亿例新增疟疾病例，约42.9万人死亡，其中主要是五岁以下儿童1。导致重症疟疾的机制尚不明确，而重症常与血管功能障碍相关2。Plasmodium-iRBCs会分泌一种称为细胞外囊泡（EVs）的小型双层脂质膜结构。已知这些EVs可能与感染过程以及宿主对感染的免疫反应有关，但目前对这些小囊泡在疟疾感染期间的确切功能仍了解甚少3。它们可能发挥两种重要作用：一方面，它们可能通过激活巨噬细胞促进疾病发生4,5；另一方面，它们可能介导寄生虫之间以及寄生虫与宿主之间的细胞间通讯6,7。事实上，寄生虫可通过EVs在彼此之间转移蛋白质或核酸。例如，Trypanosoma brucei rhodesiense的EVs可转移毒力因子血清抗性相关蛋白（SRA），并可靶向其他T. brucei以及宿主红细胞8。此外，P. falciparum-iRBCs可通过EVs内部转移核酸实现相互通讯，从而优化并同步其生长。事实上....
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方案
人红细胞根据Swissethics（swissethics.ch）的指南，从健康供体的血液中获取。
注意： P. falciparum 寄生虫培养（3D7）和EV的制备此前已在Mbagwu中描述， 等.11 因为 P. falciparum 是一种人类病原体，请查阅当地关于处理的法规。培养物应始终保持无菌状态。
1. 细胞外囊泡（EVs）的荧光标记
注意：以下步骤利用标记技术，将一种带有大脂肪族尾链的绿色荧光染料（PKH67）稳定地掺入到细胞外囊泡（EV）膜的脂质区域。反应在200 µL的终体积中进行，其中PKH67的终浓度为20 µM。所有操作步骤均在室温（20–25 °C）下进行。
- 在微量离心管中，将100 µg的EVs加入1 mL的PBS中。
- 在微量离心管中以最大速度（20,000 × g）离心7分钟，使EVs沉淀。
注意：由于EVs中含有疟色素（hemozoin），应观察到红色至深棕色沉淀。若上清液呈红色，则表明EVs已裂解。 - 离心后，小心吸弃上清液，避免带走任何EVs。
注意：在用稀释液C重悬EVs前，尽量减少残留缓冲液体积，以提高染色的可重复性和效率。
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结果
本文描述了研究细胞外囊泡（EVs）与宿主细胞相互作用的实验方案。通过共聚焦显微镜监测荧光标记的EVs的摄取情况（图1）。内皮细胞可高效摄取EVs，但可通过优化EVs的孵育时间以追踪其摄取过程。为了更准确地定位EVs在细胞内的分布，可用鬼笔环肽（phalloidin）对肌动蛋白进行染色。接下来，我们使用一种滤膜，在其上培养单层内皮细胞。将罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖（Rhodamine B isothiocyanate-dextran）加入滤膜上方的腔室，通过检测荧光葡聚糖向下方腔室的转移量来测定内皮单层的通透性（图2A）。通常情况下，随着EVs浓度的增加，内皮细胞的通透性会发生改变（图2B）。需要注意的是，应将细胞培养数天，以确保其形成完整的单层结构，否则染料会迅速穿过孔板中的细胞间隙。还需注意的是，即使未经处理，葡聚糖也会缓慢地透过细胞单层。
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讨论
多种寄生虫，包括弓形虫（Toxoplasma）、锥虫（Trypanosoma）、利什曼原虫（Leishmania）和毛滴虫（Trichomonas），可诱导感染的宿主细胞释放细胞外囊泡（EVs）。根据病原体的不同，这些释放的EVs可调节宿主免疫反应，或介导寄生虫之间的细胞间通讯6然而，目前关于这些小囊泡如何参与疟疾发病机制的证据仍然十分有限。本文中，我们介绍了几种研究细胞外囊泡（EVs）在疟疾中功能的方法。 疟原虫 感染。例如，EVs 被受体细胞摄取 体内 可通过使用 PKH67 荧光染料标记来高效监测。为确保标记的特异性，必须进行多项对照实验。需特别注意的是，PKH67 染料一旦与稀释液 C 混合，容易形成聚集体，因此必须设置仅含染料而不含 EVs 的对照组，以确定非特异性染色情况。共聚焦显微镜是区分结合于细胞表面与真正被受体细胞内化的囊泡的首选方法。此外，该技术为追踪和监测细胞摄取囊泡数量提供了优良工具。然而，EVs 在受体细胞内的后续加工处理过程仍不明确14因此，采用2、4和8小时的时间点进行时间过程.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了诺华医学与生物学研究基金会（资助对象：PYM）、戈特弗里德与朱莉娅·班格特-赖纳基金会（资助对象：MW 和 PYM）以及弗里堡大学研究基金（资助对象：PYM）的经费支持。其他资助还包括瑞士政府外国学者卓越奖学金（资助对象：KAB 和 SM）。我们感谢伊莎贝尔·费莱（Isabelle Fellay）和索朗日·哈鲁比·赫斯（Solange Kharoubi Hess）提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒（小包装） | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| 稀释液 C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | 赛默飞世尔科技 - 吉布科 | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | 赛默飞世尔科技 | P36934 | |
| 罗丹明B异硫氰酸酯–葡聚糖 | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| 带PET膜的透明Falcon插入件 24孔板 | Falcon | 353095 | |
| 内皮细胞生长 中等 MV | Promocell | C-22020 | |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS细胞增殖比色法检测试剂盒 | Biovision | K300-500 | |
| 六亚甲基溴化物 | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| 使命 Lenti microRNA，人 hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA，ath-miR416，阴性对照1 转导颗粒 | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| 使命 人源Lenti microRNA | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | 徕卡显微系统 | ||
| miRNeasy mini试剂盒 | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒 1000 次反应 | 赛默飞世尔科技 | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR 反应 | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II，含 UNG | 赛默飞世尔科技 | 4440038 | |
| StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统 | ThermoFisher | 4376600 |
参考文献
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan p....
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