使用自动化结晶技术培养具有不同尺寸的蛋白质晶体 原位 动态光散射

摘要

本文介绍了一种用于可控生产蛋白质微晶的实验方案。该过程采用自动化设备，可对多个结晶参数进行精确调控。通过在监测结晶液滴中颗粒半径分布的同时，进行受控且自动化的结晶溶液添加，从而实现蛋白质结晶。

摘要

自动化结晶装置是一项专利技术¹ 专为监测蛋白质结晶实验而开发，旨在精确调控成核过程及晶体生长，以获得理想尺寸的蛋白质晶体。该可控结晶技术基于对样品的检测分析 原位 动态光散射（DLS）结合显微镜与CCD相机在线监测液滴的所有视觉变化，从而能够在结晶过程的各个阶段对蛋白质液滴进行全面研究。该方法的使用 原位 在整个实验过程中进行DLS测量，可精确定位高度过饱和蛋白质溶液向新相态的转变——即晶体成核的形成。通过识别蛋白质成核阶段，可将结晶过程优化，从而从生成大尺寸蛋白质晶体转向生产蛋白质微晶。该实验方案展示了一种基于精确自动化步骤的交互式结晶方法，包括添加沉淀剂、通过水分蒸发诱导高度过饱和，以及样品稀释以减缓诱导均相成核或逆转相变过程。

引言

近年来，蛋白质微晶和纳米晶的生长引起了蛋白质晶体学领域的广泛关注，尤其是随着串行飞秒晶体学（Serial Femtosecond Crystallography, SFX）技术的持续发展。由于新型X射线辐射源具有极高的亮度，且目前已取得一系列成功成果，蛋白质微晶和纳米晶的制备变得尤为重要，对晶态悬浮液的制备提出了很高的需求^2,3。由于在自由电子激光器（XFELs）上进行数据收集所需的晶体尺寸非常小，且实验机时有限，因此在数据收集前对样品进行表征至关重要。迄今为止，表征蛋白质微晶或纳米晶悬浮液最常用的技术是电子显微镜和X射线粉末衍射。

迄今为止，已有多种方法借鉴自常规结晶技术，旨在大量制备尺寸在微米级范围内的蛋白质晶体。批量法（batch method）通过快速混合高浓度的蛋白质溶液与沉淀剂溶液，使样品溶液迅速进入高度过饱和状态，从而有利于纳米结晶的形成⁴。其他方法包括将大尺寸蛋白质晶体破碎，形成晶体悬浊液，该悬浊液可作为纳米晶悬浮液用于数据收集⁵。然而，此类方法有时可能导致衍射质量下降，因为受损晶体的内部有序性较低。基于自由界面扩散的纳米结晶也是一种可行的替代方法，该方法将少量蛋白质溶液加入高浓度的沉淀剂溶液中³。然而，在所有技术中，最有效的方法似乎是批量结晶法，以及采用悬滴法（sitting drop）的蒸汽扩散等更为创新的操作技术⁶。

通常情况下，蛋白质结晶需要克服一定的能量势垒，以促进成核作用——这是晶体形成的第一个热力学步骤。为了使蛋白质溶液从热力学稳定状态转变为过饱和状态，并最终诱导发生相变，需要调节与蛋白质溶液相关的一些变量。这些变量通常包括蛋白质溶液的浓度、环境变化（例如温度、湿度）、溶剂特性（例如pH、离子强度）、浓度和缓冲液性质， 等等。^7,8 可改变样品参数的概述通常以相图表示，相图可采用多种呈现方式，例如溶解度图、成核相图，甚至更详细的描述形式，其中可涉及三维或更复杂的图表。^8,9,10最吸引人的相图通常是二维的，其中主要变量是蛋白质浓度随另一参数的变化，而其余参数保持恒定。^6,11一旦形成一个或少数几个晶核，更大的晶体便可通过从主体溶液中继续摄取蛋白质而生长。当目标是制备微晶和纳米晶体时，由于溶液中晶体数量极少，这种传统的结晶方法便不再可行。纳米晶体悬浮液通常需要含有丰富的晶体实体，因此必须重新调整结晶路径，使样品中出现最大程度的成核事件。这就需要探索一些新的、迄今为止尚未被研究过的蛋白质成核路径，而这些路径目前也尚未被完全理解。^12,13根据前文所述的相图基本原理，经典理论已扩展为一种新假说，即成核过程被描述为两步机制：首先，发生向较高蛋白质浓度的转变（浓液相）；其次，从富集的浓相转变为具有更高内部有序性的状态（形成具有晶格结构的晶核）。^14,15,16蛋白质结晶对多种因素敏感，因此当调整结晶条件以获得不同尺寸的晶体时，并不能总是依赖以往的经验。针对每一种特定的蛋白质靶标，都需要建立新的认识：包括缓冲液成分的优化、样品的纯度与稳定性、对蛋白质溶解度的精确了解， 等等.

动态光散射目前已成为分析和优化蛋白质结晶过程的一种成熟方法，其优势在于可检测的颗粒尺寸范围广泛：从单体蛋白质到纳米晶体和微小的微晶均可涵盖。该方法基于溶液中颗粒会进行布朗运动，而此运动的平均速度由颗粒尺寸、热能以及 介质黏度和颗粒几何形状决定。首先，使用激光作为相干光源照射液体介质。颗粒散射的光会形成干涉图样。由于颗粒处于持续运动中，干涉图样也随之不断变化。当从某一特定方向观察时，可检测到光强的波动。这些波动反映了由布朗运动引起的颗粒运动。通过对测得的光强波动计算出自相关函数（ACF）。分析自相关函数可获得颗粒速度分布（更准确地说是扩散系数）的信息，并结合斯托克斯-爱因斯坦方程，将其转换为颗粒半径分布¹⁷。有关动态光散射功能及工作原理的更多详细信息，可参见多种出版物和专著^18,19。

本文应用并描述了一种独特的自动化结晶装置XtalController900，它是XtalController技术的升级版本⁶，专为监测蛋白质结晶过程中的相互作用实验而精确开发。该技术在实时识别和追踪成核事件方面具有巨大潜力，能够精确操控结晶相图。本结晶方法的目标是优化蛋白质结晶过程，以获得高质量的蛋白质微晶和纳米晶体，适用于微聚焦同步辐射X射线源、电子衍射或SFX等技术的应用。

方案

注意：在整个实验方案中，用于添加水的微量加样系统将称为 Pump0，而用于添加沉淀剂的微量加样系统将称为 Pump1。本实验的结果将在后续进一步讨论，并称为 THM2_micro-crystals。

1. 参数与解决方案设置

1. 使用 0.2 µm 无菌注射器滤器过滤 16 mL 的 Na-酒石酸盐溶液（1.2 M）和 16 mL 的蒸馏水。
   注意：Na-酒石酸盐溶液是结晶实验中的沉淀剂溶液。 
2. 用过滤后的溶液分别向沉淀剂瓶和水瓶中各加入 5 mL。
   注意：瓶子的最大容量为 5 mL。
3. 将瓶子安装到实验腔室的泵支架上。
4. 在软件窗口中将实验参数设置为以下数值：温度 20 °C，相对湿度 20，溶剂为水。
   注意：图 2 显示了用户可输入温度、相对湿度和溶剂等参数正确值的显示窗口。软件窗口还显示了一些其他参数，例如添加剂。这些参数仅在沉淀剂溶液中含有添加剂的实验中才重要。
5. 打开实验腔室的前门，取出盖玻片载体。
6. 将一块干净且经硅化处理的盖玻片放置在载体上，然后将其放回设备中。
   注意：盖玻片的尺寸为 2.2 cm。
7. 关闭实验腔室，以维持步骤 1.4 中设定的环境条件。
   注意：此处可暂停该实验方案。

2. 微剂量系统的调整

1. 切换 开启 使用主泵特性进行Pump0 图3 并形成一股水流。
   注意：水流轨迹是根据可调节的某些泵的特性创建的。 图3 显示了主泵的主要特性以及本实验应采用的最佳参数值。
2. 通过手动操作指定的调节螺钉，调整水流的瞄准位置，使其对准盖玻片的中心。切换 关闭 Pump0.
3. 切换 开启 泵1并产生液流，操作方式与步骤2.1中相同。调节泵1的液流位置，使其对准泵0的固定位置。切换 关闭 Pump1
4. 为结晶实验更换新的干净盖玻片。
   注意：在用于结晶实验之前，通常建议使用柔软的擦拭纸清除新盖玻片上残留的灰尘。

3. 在实验腔室中设置仙茅蛋白液滴

1. 使用软件包创建一个新的实验文件。在实验文件中输入以下信息：蛋白质（来自 Thaumatococcus daniellii 的thaumatin）、蛋白质浓度（14 mg/mL）、沉淀剂（Na-Tartrate）和沉淀剂浓度（1.2 M）。
   注意：这些信息将用于结晶实验过程中沉淀剂和蛋白质浓度的自动计算。
2. 加载新实验文件，以激活步骤 3.1 中的所有信息。
3. 使用 Pump0 添加一小滴水，标记蛋白质液滴的位置。
   注意：目的是创建一个小水滴作为标记，用于指示蛋白质样品的放置位置。
4. 按下 去皮 按钮，将微量天平显示的重量归零。
   注意：此操作将扣除盖玻片以及步骤 3.3 中所加小水滴带来的额外重量。
5. 打开实验腔室的顶盖，用移液器将 8 µL 的 thaumatin 溶液加到水标记处。
6. 通过执行以下命令注册新的 thaumatin 液滴。
   1. 按下 新液滴 按钮，以应用实验文件中的初始条件。
   2. 按下 恒重 按钮，以补偿液滴中水分的自然蒸发。
7. 使用 CCD 相机检查 Pump0 是否对准蛋白质液滴。如果水流未对准液滴，需重新调整 Pump0 的位置。
   注意：从此时起，系统将通过自动添加水来补偿蛋白质液滴中水分的自然蒸发，使蛋白质液滴重量保持恒定。蛋白质液滴的重量以及其他参数（如温度和相对湿度）均可通过显示窗口实时监测。实验可在此暂停。

4. 原位 DLS 测量

1. 切换 开启 使用调节螺丝手动调整DLS激光器，将激光束对准蛋白质液滴。
2. 输入以下DLS参数：测量持续时间（60 s）、两次测量之间的等待时间（10 s）以及测量次数（300）。
   注意：前30次测量将作为蛋白质稳定性检测的参考数据，其余测量将用于全面研究蛋白质液滴在整个结晶过程中的变化。
3. 按下按钮 开始 开始进行DLS测量。通过选择一种DLS图形表示方式来检查样品质量。
   注意：样品应表现出高度的单分散性，溶液中不应存在任何聚集体。DLS结果可显示并读取为：半径分布、半径直方图、半径图谱、测量结果汇总，或计数率强度概览。

5. 样品蒸发步骤

1. 输入蒸发步骤的条件 时间表 使用所示数据 表1.
   注意：该标志 "-" 加入柱中 "摩尔浓度/百分比" 第二行表示蛋白质液滴失去水分，而该数值 "25" 意味着液滴体积将减少25%，即液滴中的蛋白质浓度将增加25%。
2. 按下按钮以启动样品蒸发步骤 自动. 按下按钮 停止 当样品蒸发步骤结束后。
3. 激活按钮 常量 在停止样品蒸发后，保持液滴恒定。

6. 沉淀剂添加步骤

1. 使用表2中提供的数据，在图4所示的时间表中输入沉淀剂添加步骤的条件。
   注意：表中的第一行代表一个校准步骤，期间软件根据需添加到蛋白质液滴中的沉淀剂量来计算蛋白质液滴的自然蒸发速率。软件将外推该值，并自动调整Pump0的喷射频率，以在后续沉淀剂添加步骤中自动补偿水分蒸发。
2. 通过按下Autom按钮启动沉淀剂添加步骤。
   注意：沉淀剂的添加是一个自动化过程，依据时间表中的输入执行。

7. 随时间追踪结晶液滴的演变过程

1. 使用CCD相机检查甜蛋白晶体的外观。
2. 利用动态光散射（DLS）图示分析颗粒尺寸分布。
3. 通过显示窗口监测重量及实验参数的变化。
   注意：当蛋白液滴中的钠-酒石酸盐溶液浓度达到0.74 M时，液滴中将富含甜蛋白微晶，如图7所示。

8. 结晶液滴的回收

1. 用石蜡油包被一个洁净的标准Terasaki板。
   1. 向板中加入3 mL石蜡油。
   2. 轻轻倾斜移动Terasaki板，使石蜡油均匀分散至各孔，确保覆盖板上的全部72个孔。
   3. 倾倒出浮在板面上多余的石蜡油，去除过量油相。
2. 按下停止按钮以结束结晶实验。小心取出含有结晶液滴的样品载体。
3. 使用移液器，将2 µL的结晶液滴分装至Terasaki板的各孔中。
   注意：通过在油相下将结晶液滴回收至板中，可定期使用显微镜或其他适用于标准Terasaki板的动态光散射（DLS）技术，检测样品的稳定性及晶体生长情况。

结果

结晶实验过程中通过动态光散射（DLS）测量获得的结果显示了流体动力学粒子半径的详细演变过程，最终形成两个主要的粒子分布组分，且随时间逐渐发展。在实验的第一阶段，样品被缓慢蒸发，以达到更高的蛋白质浓度。如图5B所示，蛋白质液滴的浓度从14 mg/mL升高至19.5 mg/mL。在此期间，根据图5A中的半径分布模式，蛋白质在溶液中表现为单体状态，粒子尺寸稳定在约2.5 nm。随着样品进一步蒸发，单体蛋白质在溶液中保持稳定，未出现任何变性或样品聚集的迹象。

在样品蒸发后立即向蛋白质液滴中加入沉淀剂溶液，并在半径分布图和平衡曲线中以灰色高亮显示，以便更清晰地观察（图5）。根据样品质量的计算结果，该高亮的颗粒组分对应于晶体成核的起始阶段，颗粒半径大小约为 200 - 400 nm。这一现象（称为成核）发生在蛋白质液滴中沉淀剂浓度达到 0.6 M 时，时间点约为实验开始后 66 分钟，或沉淀剂添加开始后约 23 分钟。随着沉淀剂浓度的增加，半径分布显示出溶液中颗粒的分布范围变宽。随着更多晶核的形成，初始的晶体实体逐渐长大，半径分布达到 800 - 1,300 nm。可以推断，在此阶段晶体核持续生长，同时由于蛋白质分子被微晶捕获，溶液中的蛋白质组分逐渐减少。当蛋白质液滴中的沉淀剂浓度缓慢升高后，微晶的形成在约 75 分钟后即可被明显识别，此时半径分布持续发展至 500 - 1,500 nm 范围。半径分布的演变也通过CCD相机图像得到证实，在溶液中沉淀剂浓度达到 0.7 M 时可观察到蛋白质微晶（图7）。当沉淀剂添加完成后，结晶液滴保持恒定，此时半径分布的主要相集中在 1,000 - 3,000 nm 之间，而成核事件的比例随时间逐渐减少。此时，结晶液滴已完全被微晶饱和，溶液中不再发生新的成核事件。

利用微量天平提供的反馈数据作为实验输入，绘制了综合性的结晶相图，以深入理解甜蛋白的结晶过程。 图6，实验相图显示了三次独立的结晶实验，其中嗜热菌素的生成 T. danielli 微晶标记为 THM_2 微晶（实验方案）。另外两个结晶实验，标记为 THM_1 大晶体和 THM_3 大晶体，已被用作输入数据，以实现相图中不同区域的准确映射例如，溶解度或亚稳区）。由于这些实验的方案遵循不同的结晶路径，成核区域的识别变得更加容易，因而也更为准确。对于每个实验，结晶路径通过数字顺序加以标注，以强调为实现特定结果所采用的不同方法及结晶步骤的数量，而灰色箭头则表示在形成结构明确的稳定蛋白质晶体过程中，晶体生长从溶液中摄取蛋白质分子后蛋白质最终浓度的估算值。

所展示的三项关于thaumatin的实验 图6 在进入成核区时表现出不同的条件，因此最终的结晶结果也不同，如相图下方图片所示。对于THM1和THM3的情况，蛋白质溶液穿过成核区后重新进入亚稳区，并在此区域停留直至晶体形成。因此，实验结果为生成被母液包围的大尺寸、形态明确的晶体。然而，在本方案部分所展示的THM2_micro-crystals实验中，其结晶路径采用了特定的方式。在前文曾提到，若要获得微晶，蛋白质溶液必须处于成核区较深的位置，以使成核事件以最大速率发生。在THM2_micro-crystals实验中，蛋白质与沉淀剂浓度的比例被调整至一种特定状态：当向蛋白质溶液中持续添加沉淀剂时，体系不仅进入成核区，而且不会移向相图中的其他区域，而是始终保持在成核区内高度过饱和的状态。结果，随着蛋白质液滴迅速被大量微小晶核饱和，溶液的熵急剧降低。

图1. 结晶实验的示意图。 该图展示了结晶实验腔室的总体布局，包括进行自动化结晶实验所需的所有技术组件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：DLS软件窗口及与结晶实验相关的样品参数。 参数包括温度、相对湿度、黏度 等等.

图 3：晶体学实验中微剂量系统的软件控制窗口。 该界面可调节生成液滴或溶液流的具体参数。

图 4：描述实验中结晶步骤的时间表软件窗口。 结晶液滴的初始条件也整合在此窗口中。

图 5. 索马甜 T. daniellii 微晶生成的总体概述。 （A）在整个结晶过程中，蛋白质液滴内颗粒尺寸的半径分布。（B）实验参数的监测概览。图中曲线表示蛋白质液滴重量（黑色曲线）、计算得到的蛋白质浓度（红色曲线）和沉淀剂浓度（蓝色曲线）随时间的变化情况。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：奇异果甜蛋白 T. danielli 的实验结晶相图及其对应结果。 所有曲线图均基于微量天平提供的反馈信息，由实验数据绘制而成。括号中显示的各实验编号表示在结晶实验方案中所进行的步骤顺序及步骤数量。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：THM2微晶（实验方案）的记录照片，显示溶液中大量微晶已达到饱和状态。 该图像拍摄于将蛋白质液滴置入结晶实验腔室后4小时（240分钟）。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：THM_1 宏晶体的记录照片，显示溶液中存在数个稳定的大型甜蛋白（thaumatin）晶体。 该照片是在将蛋白质液滴置入实验腔室进行结晶后20小时拍摄的。请点击此处查看此图的放大版本。

图9：THM_3大晶体的记录照片，显示溶液中不同大小的索马甜晶体。 该照片是在将蛋白质液滴置入实验腔室进行结晶后20小时拍摄的。 请点击此处查看此图的放大版本。

物质	摩尔浓度/百分比	时间 (s)
water	0	100
water	-25	2100
water	0	2100

表1：合成索马甜微晶过程中样品蒸发步骤的自动化程序输入。

物质	摩尔浓度/百分比	时间 (s)
water	0	100
prec	0.8	1800
water	0	18000

表2：用于生产索马甜微晶过程中沉淀剂添加步骤的自动化程序输入。

讨论

结晶装置旨在基于改进的蒸气扩散法，在结晶实验过程中监测和调控关键参数。该技术可对蛋白质结晶实验的各个阶段进行实时监测和评分，使用户能够精确掌握并控制蛋白质溶液在整个结晶相图中的状态，依据 原位 样品悬浮液的DLS分析。

结晶装置包含一个实验腔室（图1），该腔室连接至CCD相机，可对结晶液滴进行实时监测。相机与配备不同放大倍数物镜的显微镜相适配，空间分辨率最高可达约2.5 µm。实验腔室的核心是一台超灵敏微量天平，用于追踪样品重量随时间的变化。结晶过程采用坐滴气相扩散实验方法，将蛋白质液滴置于经硅化处理的盖玻片上，再将盖玻片放置于微量天平上。根据液滴因添加沉淀剂、水/添加剂或样品蒸发所引起的重量变化，微量天平向算法提供精确输入，以即时计算蛋白质和沉淀剂浓度随时间的变化。此外，温度和相对湿度等关键结晶参数也得到精确监测与控制。

为了进行结晶实验，该设备配备了两套微剂量系统（无接触式压电泵），可在皮升级别上添加沉淀剂和水。由于使用如此微量的物质，蛋白质液滴内的浓度梯度和对流现象被最小化。压电泵的主要作用是添加沉淀剂或水，后者例如可用于补偿蛋白质液滴的自然蒸发。微剂量系统具有一系列可控制物质添加的参数，包括：添加物质的重复频率、每秒添加的液滴数量、物质流轨迹的宽度和高度 等等此外，泵的位置可手动调节，使用户能够精确控制向蛋白质液滴中添加物质的位置。

通过独特的反馈控制来操控结晶液滴得以实现 原位 DLS 数据可显示在整个实验过程中蛋白质寡聚状态的可能变化。该技术能够持续评估随时间推移的粒径分布，从而揭示未知的蛋白质相关机制。DLS 光学设备被战略性地置于盖玻片区域下方，使检测器和激光束能够穿过盖玻片，进而穿过蛋白质液滴 原位 时尚；因此，DLS 光路仅记录液滴内部的变化。为便于操作，该装置设有两个开口：前方的门可用于盖玻片的最佳定位，顶部的盖板可拆卸，以便用户调整微剂量系统的喷射位置，并准确地在盖玻片上放置新的蛋白质液滴。

利用上述装置进行的交互式结晶方法是一种可靠的技术，可用于尺寸可控的蛋白质晶体生产。尽管目前已有多种结晶方法，但关于结晶机制本身的信息仍难以获取。通常情况下，使用传统结晶方法只能在相图的结晶区域内对溶液进行有限控制，且一旦实验开始，改变其进程的可能性非常有限。而在进行结晶实验时，结合原位动态光散射（in situ DLS）的自动化结晶技术，可以获得大量关于相图中相变过程的知识。一般来说，在相图中导致无定形沉淀和引发均相成核的区域彼此非常接近。因此，通过基于实时颗粒分布信息调控结晶液滴的演变路径，可以逐步调整结晶条件，使其趋向于成核和晶体形成，从而避免蛋白质沉淀的发生。

如今，许多结晶条件中都包含含有聚乙二醇（PEG）衍生物的沉淀剂溶液。这类化合物通常具有高黏度，可能导致移液或分液困难。在本案例研究中，用于沉淀剂分液的微剂量系统采用极细的毛细管，以实现皮升级体积的添加 增加了操作的可行性。然而，在处理高黏度物质时仍存在一些局限性。在之前的一系列实验中，该系统成功使用了以下聚乙二醇（PEG）衍生物：50% PEG200、20% PEG3000、10% PEG6000、10% PEG8000。尽管目前仅测试了上述溶液，但微量加样系统配备有特殊的加热装置，可用于降低溶液黏度。另一个需要考虑的因素是作为蛋白质沉淀剂使用的盐溶液。在使用高浓度盐溶液时，少量盐可能在微量加样系统的喷嘴处结晶，导致加样泵喷嘴表面堵塞，即使实验腔内相对湿度较高时也可能发生。为解决此问题，需暂停实验以清除喷嘴处的盐结晶。该过程可能需要特殊操作，并可能在沉淀剂添加阶段引入误差。

由于进行此类自动化结晶实验所能获得的重要信息，该技术还可拓展应用于研究蛋白质结晶的物理化学特性。成核与晶体生长反应速率属于动力学现象，可根据实验中呈现的时间依赖性信息（如温度、颗粒尺寸增长以及蛋白质和沉淀剂浓度）进行推导和计算。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
来自丹尼尔氏奇果（Thaumatococcus daniellii）的塔玛汀（Thaumatin）	Sigma-Aldrich	1002365940	实验方案用蛋白
Bis-Tris 14880	Sigma-Aldrich	2302377	蛋白溶液缓冲液
酒石酸二钠二水合物	AppliChem	A0451,0500	蛋白溶液沉淀剂
硅化盖玻片	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051203	用于结晶的盖玻片
注射器滤器	Starstedt	831826001	滤膜孔径 0.2 µm
注射器	Omnifix	4617207V	Luer Lock Solo 20 mL
石蜡油	Sigma-Aldrich	2323842	用于涂覆板的油
标准Terakasi板	Sigma-Aldrich	M5812270EA	用于回收结晶液滴的板
软质擦拭纸	KIMTECH Science
XtalController900	Xtal-Concepts GmbH	XTC900	结晶装置