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方法文章

从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中提取血细胞用于微生物感染与分析

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DOI：

10.3791/57077

⸱

2018年5月24日

 ,  , 
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine, Washington State University

本文内容

摘要

本方法展示了如何利用三维（3D）模型可视化病原体侵入昆虫细胞的过程。从黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中分离的血细胞被病毒或细菌病原体感染，感染方式包括离体（ex vivo）或活体（in vivo）感染。感染后的血细胞经固定和染色处理，用于共聚焦显微镜成像，并进行后续的三维细胞重建。

摘要

病原体感染过程中 黑腹果蝇， 血细胞在感染过程中对免疫应答起着重要作用。因此，本实验方案的目标是建立一种方法，用于可视化病原体在果蝇特定免疫区室（即血细胞）中的侵染过程。利用本方法，最多可获得 3 × 106 活体血细胞可从200 黑腹果蝇 3rd 30分钟内处理3龄幼虫 离体 感染。或者，可感染血细胞 体内 通过注射3rd 三龄幼虫，随后在感染后24小时内提取血细胞。这些被感染的原代细胞经固定、染色后，利用共聚焦显微镜进行成像。随后，基于图像生成三维图像，以明确展示病原体的侵入过程。此外，可从感染后的细胞中获得高质量RNA，用于qRT-PCR检测病原体mRNA；同时亦可提取足量蛋白质，用于Western blot分析。综上所述，本文提出了一种利用细菌与病毒病原体类型，明确验证病原体侵入及感染状态的方法，并提供了一种高效的血细胞提取方法，以获得足够数量的活体血细胞 果蝇 幼虫用于 离体 和 体内 感染实验

引言

Drosophila melanogaster 是研究先天免疫的成熟模式生物1。在先天免疫反应过程中，血细胞在应对病原体侵染中发挥重要作用。血细胞对于包裹寄生虫至关重要，同时在真菌、病毒和 细菌感染期间，还通过吞噬作用参与抗御病原体2,3。

为了充分理解宿主对病原微生物感染的固有免疫应答，观察病原体在感染过程中如何侵入宿主细胞至关重要。这种可视化有助于阐明病原体的入侵机制。结合病原体在细胞内的定位信息以及宿主细胞的应答细节，这些数据可为宿主对感染的反应及病原体所相互作用的细胞器提供线索。因此，显微成像后的三维模型重建有助于确定病原体在宿主细胞中的精确定位。在本研究中，我们观察了病原体的侵入过程 贝氏柯克斯体（C. burnetii）， 引起Q热的病原体，Q热是一种对人类和动物健康均构成严重威胁的人畜共患病，进入原代 果蝇 血细胞。最近有研究证明 果蝇 易感于生物安全二级的Nine Mile II相克隆4株（NMII） C. burnetii 并且该菌株能够在 果蝇4，表明 黑腹果蝇 可作为研究的模式生物 C. burnetii 发病机制

先前的研究已利用血细胞来检测宿主的先天免疫反应。血细胞已被用于形态学观察5,6,7，形态计量分析2,8，吞噬作用分析2,3，qRT-PCR2,9免疫沉淀10,11，免疫荧光分析10,12，免疫染色13，免疫印迹3,10,11 和免疫组织化学9,14。尽管 果蝇 S2 细胞也可用于各种 体外 实验、永生化以及潜在的预先存在的病毒感染会改变它们的行为15,16使用原代细胞而非永生化细胞系（如S2细胞），可在一个更能代表完整生物体的系统中研究先天免疫功能。此外，血细胞的感染 体内在提取之前，使细胞能够与其他宿主蛋白和组织相互作用，相较于在植入前提取血细胞，具有优势 离体 感染。已有多种不同方法被用于在短时间内获得足够数量的活体血细胞8,17,18,19.

本研究中，我们介绍了一种从血细胞中提取 果蝇 3rd 用于病原微生物感染的龄期幼虫 C. burnetii, 单核细胞增生李斯特菌 (单核细胞增生李斯特菌），或无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV6）。我们描述了这两种情况的方法 体内 和 离体 血细胞感染 在体- 和 离体感染的血细胞通过共聚焦显微镜观察，并用于构建三维模型 C. burnetii 侵袭。此外，使用该提取方案， 离体-感染的血细胞用于基因和蛋白质表达检测。具体而言，为检测IIV6感染程度， 单核细胞增生李斯特菌，从细胞中分离总RNA或蛋白质，用于qRT-PCR或Western印迹分析。综上所述，该方案提供了从3只昆虫中快速收集大量血细胞的方法rd 龄幼虫及初级血细胞被感染的证据 体内 或 离体是进行微生物病原体感染研究的合适平台，适用于显微镜观察、转录组学和蛋白质组学等后续分析。

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方案

1. 离体 感染

  1. 培养基与设备
    1. 在无菌条件下，制备新鲜的 果蝇 含75% Schneider's的血细胞分离培养基（DHIM） 果蝇 含25%胎牛血清（FBS）的培养基并过滤除菌。
    2. 在体视显微镜下放置2至3层10 cm × 10 cm的石蜡膜。
    3. 准备玻璃毛细管。将毛细管拉制仪的加热器设置为最大功率的55%。将毛细管拉制成尖端约 10 µm.
    4. 用矿物油回填毛细管。
    5. 将装满液体的毛细管安装到纳米注射仪上（图1A），并用镊子折断毛细管末端以打开熔融的毛细管尖端（图1B）。提示的外径应为 100 µm 便于血细胞的摄取。
    6. 尽可能将毛细管尖端的油全部排出，然后用 DHIM 填充。为了便于观察吸收的血淋巴与油之间的界面，可在油与 DHIM 之间留一个气泡。图1B').
  2. 血淋巴提取
    1. 选取3个rd 龄期 果蝇 用镊子轻轻从培养瓶内壁取下幼虫，并将其放入 100 µm 滤网（图1C). 3rd 三至六天后可在成年雌虫产下受精卵后发现龄期幼虫。
      注意：这些实验使用了基因型 w1118;P{w+mC=Hml-GAL4.Δ}2,P{w+mC=UAS-2xEGFP}AH2，因为这些动物的血细胞表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP），有助于通过显微镜观察识别细胞。
    2. 将5 mL无菌水倒入幼虫中，振荡筛子5秒。将筛子放在实验用擦拭纸上以除去多余的水分图1C').
    3. 将幼虫转移至1.5 mL 微离心管中。用CO₂麻醉它们。2 气体，5 秒（图1D).
    4. 将幼虫置于体视显微镜下的石蜡膜上，背面向上（图2A).
    5. 将玻璃毛细管轻轻置于幼虫后部以固定其位置，并使用尖头镊子撕开后部表皮图2B).
    6. 让血淋巴流到石蜡膜上（图2C).
    7. 在石蜡膜上将20-50只幼虫的血淋巴（含血细胞）混合成一 pool。
    8. 使用纳米注射器上的玻璃毛细管吸取混合的血淋巴图2D).
      注意：应有大约 10-20 µL 血淋巴
    9. 将血淋巴排入含有1.5 mL微量离心管中 500 µL DHIM的图2E).
    10. 对每一批幼虫重复步骤 1.2.4) 至 1.2.9)。
  3. 统计血细胞数量。
    1. 移液器 5 µL 0.4% 台盼蓝溶液加入至0.6 mL 微离心管中，用于染色死细胞。使用移液器轻轻混合1.5 mL 管中的DHIM与血细胞，然后转移 5 µL 将DHIM（含血细胞）加入0.6 mL微量离心管中，轻轻混匀。
    2. 移液器 10 µL 将1:1的台盼蓝-血细胞混合液中的细胞加入血细胞计数板。
    3. 统计血细胞计数板四个角的四个计数区域中未被台盼蓝染色的活血细胞数量，使用以下公式计算每毫升血细胞的浓度：
      细胞计数公式、方程：(a+b+c+d)/2 × 10⁴，数学生物学计算
      其中，X 表示每毫升活体血细胞的浓度；a、b、c 和 d 为血细胞计数板中计数的四个视野内活细胞的数量（通过台盼蓝排斥法确定）。细胞总数除以 2 是因为细胞与台盼蓝溶液进行了 1:1 稀释。被台盼蓝染色的细胞视为死细胞。
  4. 离体 感染
    1. 根据每个实验所需的时间点和生物学重复数量，确定接种细胞的孔数。5.0×104 感染后，血细胞是进行RNA和蛋白质纯化的理想材料。
    2. 使用以下公式计算用于感染的病原体储存液需用 DHIM 稀释的体积：
      病原体滴度计算公式、病毒载量计算公式示意图、MOI、每孔血细胞计数
      其中，感染复数（MOI）是指每个细胞所需的病毒或细菌数量。
      注意：所用的MOI取决于具体的实验和进行的检测。此处，使用每细胞10个基因组当量（GE）的病毒 C. burnetii，每细胞10 CFU 单核细胞增生李斯特菌，或 1 TCID50使用了IIV6的细胞。
    3. 准备 500 µL 按每孔适量将DHIM加入装有病毒或细菌的离心管中，为24孔板的每个孔制备病原体培养基。
    4. 将一个12 mm圆形盖玻片（1号厚度）放入24孔板的一个孔中。
    5. 将含有血细胞的DHIM分装至24孔板的各孔中。
    6. 添加 500 µL 将病原体培养基加入到孔中的血细胞内。
    7. 以 1,000 × g 离心 5 分钟。
    8. 在37°C下孵育平板1小时 28 °C每15分钟，用手轻轻将培养板前后倾斜，然后左右倾斜，每次持续5秒。
    9. 在侵染/黏附步骤1.4.8）1小时后，轻柔地用移液器吸去病原体培养基，用新鲜DHIM洗涤血细胞，并重新加入DHIM 500 µL 新鲜的 DHIM。
    10. 将感染的血细胞在所需时间内孵育。在本实验中， C. burnetii或IIV6感染的血细胞在24小时内孵育， 单核细胞增生李斯特菌感染的血细胞在1、2或4小时后孵育。

2. 体内 感染

  1. 感染
    1. 加热 果蝇 室温下将果汁琼脂平板放置15分钟。平板制备方法如前所述20.
      1. 将30 g琼脂加入700 mL水中，高压灭菌40 min。
      2. 将0.5 g对羟基苯甲酸甲酯溶解于10 mL无水乙醇中。
      3. 将对羟基苯甲酸甲酯溶液加入300 mL果汁浓缩液中。
      4. 将果汁浓缩液迅速混入已灭菌的琼脂溶液中，并将5 mL分装至10个35 mm × 10 mm的培养皿中。
      5. 平板冷却15分钟后，将其储存于 4 °C.
    2. 制备 3rd 一龄幼虫，按步骤 1.2.1) - 1.2.3) 进行操作。
    3. 将酵母糊置于琼脂平板上。在琼脂平板上划出细小切口，以便幼虫迁移，避免干燥图3A）。使用石蜡膜和持针镊组装一支尖端为0.001 mm的钨针（图3B, C).
    4. 移液器 50 µL 高滴度表达mCherry的C. burnetii (5.95×109 在体视显微镜下，将细菌（GE/mL）滴加到石蜡膜上，并将幼虫放入细菌液滴中。
    5. 将幼虫放入细菌液滴中，用钨针刺穿幼虫图3D）。将幼虫转移至琼脂平板上（图3E).
    6. 将剩余的病原体培养基转移至琼脂平板上，并用石蜡膜密封平板。
    7. 将幼虫置于培养皿中，在湿润空气中培养至感染后所需时间图3F）。在此实验中， C. burnetii感染的幼虫在平板上放置 24 h。
  2. 血淋巴提取及血细胞铺板
    1. 按照步骤 1.1) 准备培养基和设备。
    2. 将一个12 mm圆形盖玻片（1号厚度）放入24孔板的一个孔中。用移液器吸取 500 µL 将DHIM加入孔中。
    3. 按照步骤 1.2.4) - 1.2.8) 从感染的幼虫中提取血淋巴。
    4. 按照步骤 2.2.2）将血淋巴排出至孔中。
    5. 对多批幼虫重复步骤 2.2.3）和 2.2.4）。
    6. 以 1,000 x g 离心 5 分钟。

3. 可视化

  1. 固定与染色
    1. 待血细胞在孔中的圆形盖玻片上沉降后，轻轻移除各孔中的培养基。
    2. 向已沉降的血细胞各孔中轻轻加入 200 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA），在室温下孵育 20 分钟。
    3. 移除 4% PFA，向各孔中轻轻加入含 0.1% Triton X-100 和 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 200 µL，在室温下孵育 10 分钟。
    4. 移除 PBS，向各孔中轻轻加入 1× 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）200 µL，在室温下避光孵育 10 分钟。
    5. 移除 DAPI 溶液，向各孔中轻轻加入 PBS，在室温下孵育 5 分钟。
    6. 在载玻片上滴加 10 µL 抗荧光淬灭封片剂。
    7. 移除各孔中的 PBS 后，用尖头镊子从 24 孔板中取出盖玻片，将其细胞面朝下轻轻放置在载玻片的抗荧光淬灭封片剂上。
    8. 将载玻片置于暗处过夜，使其自然干燥。
  2. 共聚焦成像
    1. 配置共聚焦显微镜以进行 DAPI、EGFP 和 mCherry 的三色成像。使用以下设置：DAPI 激发（ex）405 nm，发射（em）415–480 nm；EGFP 激发 488 nm，发射 493–564 nm；mCherry 激发 587 nm，发射 597–700 nm。
    2. 将样品置于显微镜载物台上，使用 63X/1.4 数值孔径（NA）物镜对焦，并在视野中定位待成像的血细胞。
    3. 调节激光功率和探测器增益，以获得适当的样品曝光。检查多个 z 平面，确保整个样品厚度范围内的曝光水平合适。
    4. 确定单个完整血细胞在 z 轴上的顶部和底部位置，并将这两个位置设定为 z 层切的起始和终止位置。
    5. 仅使用扫描缩放功能对包含血细胞的区域进行成像，通常使用 3X 的缩放倍数。
    6. 以适当的分辨率采集图像序列，例如在 x-y 平面上为 1024 × 1024 像素，z 方向上层间间距为 0.3 µm。
  3. 三维模型重建
    ​注：存在可执行以下大部分三维模型重建功能的开源软件。
    1. 将 z 层切成像序列文件导入与共聚焦显微镜配套的软件中，用于三维模型重建。
    2. 选择一个显示在 EGFP 表达的血细胞中，DAPI 染色的细胞核与表达 mCherry 的 C. burnetii 共定位的细胞。将图像序列裁剪至仅包含该单个细胞。
    3. 选择“3D Viewer”选项，利用软件内置算法重建三维模型。在“融合”、“表面”和“混合”模式中选择所需的三维显示类型。本方法中，血细胞、细胞核和 C. burnetii 均采用表面模型显示。
    4. 通过按住鼠标按钮并在屏幕上拖动光标，从不同视角观察重建的三维细胞。调整细胞取向和模型光源位置以优化图像效果。还可通过调节不透明度、最小与最大阈值、镜面反射、环境光、光泽度和伽马值等参数进一步优化图像。
    5. 使用裁剪和切片命令对模型进行横截面观察，以可视化血细胞内部结构。

4. 基因和/或蛋白质分析的应用

  1. 在感染 IIV6 和 Listeria 后，按照先前所述方法21以及制造商说明书，裂解细胞以进行后续的 qRT-PCR 或 Western blot 分析。
    注意：有关 qRT-PCR 所用引物和 Western blot 所用抗体的信息，请参见材料表。
  2. 按照先前所述方法22，通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物，以确认扩增产物的正确长度。

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结果

收集活体血细胞以 离体 感染，高达 3×106 血细胞从200个中提取 果蝇 3rd 龄幼虫。为建立本方法，尝试了多种不同技术。单个幼虫解剖耗时可达1.5 h，采用该方法平均可获得约8000个细胞18，其中大多数在采集结束时已死亡。接下来，我们尝试使用玻璃毛细管每次从20只幼虫中提取含有血细胞的血淋巴19，但毛细管被角质层物质堵塞，导致血淋巴无法被玻璃毛细管有效吸取。最后，我们使用精细镊子对每批20-50条幼虫的角质层进行机械破坏12，并形成血淋巴池以便于吸取。这使得从大量幼虫中轻松收集大量血细胞成为可能（表1).

为了证明所提取的血细胞具有活性并适用于感染实验，采用台盼蓝排斥法检测了使用本方法提取...

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讨论

为了更好地理解宿主细胞如何被感染，明确病原体在细胞内的定位至关重要，尤其是在研究此前未经测试的病原体与细胞类型组合时4。虽然研究感染后细胞反应级联可提示病原体是否成功侵入，但结合成像数据与细胞反应数据对于证实病原体的侵入和感染仍必不可少。尽管已有研究报告通过展示病原体侵入宿主细胞的二维图像来表明成功感染，但关于病原体最初侵入宿主细胞的时间点仍可能存在疑问。因此，通过二维图像的z轴层扫数据重建的三维模型可解答这些问题，并明确病原体在宿主细胞内的位置（图4和图5）。然而，使用原代血细胞的一个局限性在于其在细胞培养中的存活时间。先前有报道称，血细胞在培养基中的存活时间仅为8小时18，而在我们的感染实验方案中，最多只能进行至24小时，无法更久。因此，无法观察到高水平的C. burnetii复制或寄生性液泡的形成，因为后者在感染后2天才开始形成，且直到感染后4–6天才明显增大30。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Robert Heinzen 博士提供了表达 mCherry 的Coxiella burnetii菌株。感谢 Luis Teixeira 博士提供了无脊椎动物虹彩病毒 6，感谢布卢明顿菌种中心提供了果蝇品系。本项目部分由美国国立卫生研究院资助项目 R00 AI106963（资助 A.G.G.）和华盛顿州立大学资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Schneider's Drosophila 培养基 Thermo Fisher Scientific (Gibco)217200241.1.1), 2.1.2)
胎牛血清GE Healthcare Life Sciences  (HyClone)SH30070.03HI1.1.1), 2.1.2)
滤器（0.22 µL）RESTEK261581.1.1)
细胞筛（100 µm）Greiner bio-one5420001.2.1), 2)
体视显微镜AmscopeSM-1BSZ-L6W1.2), 2)
玻璃毛细管Fisher Scientific21-171-41.1), 1.2), 2)
毛细管拉制仪Narishige International USA, Inc.PC-101.1.3)
矿物油Snow River Products1.1.4)
纳升注射仪Drummond Scientific Company3-000-2041.1), 1.2), 2.2)
镊子VWR82027-4021.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 递送装置Genesee Scientific59-122BC1.2), 2)
台盼蓝Thermo Fisher Scientific (Gibco)152500611.3)
血细胞计数板Hausser Scientific31001.3)
24孔板Greiner bio-one6621601.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherryDr. Heinzen, R.1.4), 2.2)
Drosophila 果汁培养基平板Cold Spring Harbor Protocols2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
琼脂Fisher BioreagentsBP1423-5002.1.1.1)
对羟基苯甲酸甲酯Amresco0572-500G2.1.1.2)
无水乙醇Fisher BioreagentsBP2818-5002.1.1.2)
Welch's 100% 葡萄汁冷冻浓缩液，340 mLAmazonB0025UJVGM2.1.1.3)
培养皿，10 × 35 mmFisher Scientific08-757-100A2.1.1.4)
显微镜盖玻片Fisher Scientific12-545-801.4.4), 2.2.2)
酵母，干活性面包酵母MP Biomedicals02101400012.1) 按体积比将2份水加入1份酵母中（v/v）
钨针Fine Science Tools10130-202.1)
持针镊VWRHS83132.1)
多聚甲醛Fisher ScientificFLO4042-5003.1.3)
吐温X-100Fisher ScientificBP151-5003.1.3)
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP9706-1003.1.3)
4',6-二脒基-2-苯基吲哚Thermo Fisher Scientific622473.1.4)
抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP369303.1.6)
共聚焦显微镜LeicaTCS SP8-X 白光共聚焦激光扫描显微镜3.2)
三维成像重建软件LeicaLASX 配备三维可视化模块3.3)
显微镜载玻片Fisher Scientific12-552-33.1.6)
无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV6）Dr. Teixeria, L.4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenesATCC菌株：10403S4) 单核细胞增生李斯特菌菌株10403S（Bishop 和 Hinrichs，1987）在含有50 µg/ml 链霉素的Difco脑心浸液（BHI）肉汤（BD Biosciences）中，于30 °C 培养。
DNase IThermo Fisher Scientific(Invitrogen)18068015基因组DNA降解
cDNA合成试剂盒Bio-Rad1708891cDNA合成
IIV6_193R_FIDTqRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_RIDTqRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwdSIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_revSIGMA-ALDRICHqRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR 试剂Thermo Fisher ScientificK0251, K0252, K0253qRT-PCR
实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher Scientific4351107, 7500 Software v2.0qRT-PCR
抗单核细胞增生李斯特菌抗体abcamab35132Western blot
兔源抗肌动蛋白抗体SIGMA-ALDRICHA2066Western blot
抗兔IgG（H+L），HRP标记PromegaW4011Western blot

参考文献

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从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中提取血细胞用于微生物感染与分析
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