从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中提取血细胞用于微生物感染与分析

摘要

本方法展示了如何利用三维（3D）模型可视化病原体侵入昆虫细胞的过程。从黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中分离的血细胞被病毒或细菌病原体感染，感染方式包括离体（ex vivo）或活体（in vivo）感染。感染后的血细胞经固定和染色处理，用于共聚焦显微镜成像，并进行后续的三维细胞重建。

摘要

病原体感染过程中 黑腹果蝇， 血细胞在感染过程中对免疫应答起着重要作用。因此，本实验方案的目标是建立一种方法，用于可视化病原体在果蝇特定免疫区室（即血细胞）中的侵染过程。利用本方法，最多可获得 3 × 10⁶ 活体血细胞可从200 黑腹果蝇 3^rd 30分钟内处理3龄幼虫 离体 感染。或者，可感染血细胞 体内 通过注射3^rd 三龄幼虫，随后在感染后24小时内提取血细胞。这些被感染的原代细胞经固定、染色后，利用共聚焦显微镜进行成像。随后，基于图像生成三维图像，以明确展示病原体的侵入过程。此外，可从感染后的细胞中获得高质量RNA，用于qRT-PCR检测病原体mRNA；同时亦可提取足量蛋白质，用于Western blot分析。综上所述，本文提出了一种利用细菌与病毒病原体类型，明确验证病原体侵入及感染状态的方法，并提供了一种高效的血细胞提取方法，以获得足够数量的活体血细胞 果蝇 幼虫用于 离体 和 体内 感染实验

引言

Drosophila melanogaster 是研究先天免疫的成熟模式生物¹。在先天免疫反应过程中，血细胞在应对病原体侵染中发挥重要作用。血细胞对于包裹寄生虫至关重要，同时在真菌、病毒和 细菌感染期间，还通过吞噬作用参与抗御病原体^2,3。

为了充分理解宿主对病原微生物感染的固有免疫应答，观察病原体在感染过程中如何侵入宿主细胞至关重要。这种可视化有助于阐明病原体的入侵机制。结合病原体在细胞内的定位信息以及宿主细胞的应答细节，这些数据可为宿主对感染的反应及病原体所相互作用的细胞器提供线索。因此，显微成像后的三维模型重建有助于确定病原体在宿主细胞中的精确定位。在本研究中，我们观察了病原体的侵入过程 贝氏柯克斯体（C. burnetii）， 引起Q热的病原体，Q热是一种对人类和动物健康均构成严重威胁的人畜共患病，进入原代 果蝇 血细胞。最近有研究证明 果蝇 易感于生物安全二级的Nine Mile II相克隆4株（NMII） C. burnetii 并且该菌株能够在 果蝇⁴，表明 黑腹果蝇 可作为研究的模式生物 C. burneti....

方案

1. 离体 感染

1. 培养基与设备
   1. 在无菌条件下，制备新鲜的 果蝇 含75% Schneider's的血细胞分离培养基（DHIM） 果蝇 含25%胎牛血清（FBS）的培养基并过滤除菌。
   2. 在体视显微镜下放置2至3层10 cm × 10 cm的石蜡膜。
   3. 准备玻璃毛细管。将毛细管拉制仪的加热器设置为最大功率的55%。将毛细管拉制成尖端约 10 µm.
   4. 用矿物油回填毛细管。
   5. 将装满液体的毛细管安装到纳米注射仪上（图1A），并用镊子折断毛细管末端以打开熔融的毛细管尖端（图1B）。提示的外径应为 100 µm 便于血细胞的摄取。
   6. 尽可能将毛细管尖端的油全部排出，然后用 DHIM 填充。为了便于观察吸收的血淋巴与油之间的界面，可在油与 DHIM 之间留一个气泡。图1B').
2. 血淋巴提取
   1. 选取3个^rd 龄期 果蝇 用镊子轻轻从培养瓶内壁取下幼虫，并将其放入....

结果

收集活体血细胞以 离体 感染，高达 3×10⁶ 血细胞从200个中提取 果蝇 3^rd 龄幼虫。为建立本方法，尝试了多种不同技术。单个幼虫解剖耗时可达1.5 h，采用该方法平均可获得约8000个细胞¹⁸，其中大多数在采集结束时已死亡。接下来，我们尝试使用玻璃毛细管每次从20只幼虫中提取含有血细胞的血淋巴¹⁹，但毛细管被角质层物质堵塞，导致血淋巴无法被玻璃毛细管有效吸取。最后，我们使用精细镊子对每批20-50条幼虫的角质层进行机械破坏¹²，并形成血淋巴池以便于吸取。这使得从大量幼虫中轻松收集大量血细胞成为可能（表1).

为了证明所提取的血细胞具有活性并适用于感染实验，采用台盼蓝排斥法检测了使用本方法提取.......

讨论

为了更好地理解宿主细胞如何被感染，明确病原体在细胞内的定位至关重要，尤其是在研究此前未经测试的病原体与细胞类型组合时⁴。虽然研究感染后细胞反应级联可提示病原体是否成功侵入，但结合成像数据与细胞反应数据对于证实病原体的侵入和感染仍必不可少。尽管已有研究报告通过展示病原体侵入宿主细胞的二维图像来表明成功感染，但关于病原体最初侵入宿主细胞的时间点仍可能存在疑问。因此，通过二维图像的z轴层扫数据重建的三维模型可解答这些问题，并明确病原体在宿主细胞内的位置（图4和图5）。然而，使用原代血细胞的一个局限性在于其在细胞培养中的存活时间。先前有报道称，血细胞在培养基中的存活时间仅为8小时¹⁸，而在我们的感染实验方案中，最多只能进行至24小时，无法更久。因此，无法观察到高水平的C. burnetii复制或寄生性液泡的形成，因为后者在感染后2天才开始形成，且直到感染后4–6天才明显增大³⁰。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Schneider's Drosophila 培养基	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	21720024	1.1.1), 2.1.2)
胎牛血清	GE Healthcare Life Sciences  (HyClone)	SH30070.03HI	1.1.1), 2.1.2)
滤器（0.22 µL）	RESTEK	26158	1.1.1)
细胞筛（100 µm）	Greiner bio-one	542000	1.2.1), 2)
体视显微镜	Amscope	SM-1BSZ-L6W	1.2), 2)
玻璃毛细管	Fisher Scientific	21-171-4	1.1), 1.2), 2)
毛细管拉制仪	Narishige International USA, Inc.	PC-10	1.1.3)
矿物油	Snow River Products		1.1.4)
纳升注射仪	Drummond Scientific Company	3-000-204	1.1), 1.2), 2.2)
镊子	VWR	82027-402	1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 递送装置	Genesee Scientific	59-122BC	1.2), 2)
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15250061	1.3)
血细胞计数板	Hausser Scientific	3100	1.3)
24孔板	Greiner bio-one	662160	1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.		1.4), 2.2)
Drosophila 果汁培养基平板	Cold Spring Harbor Protocols		2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
琼脂	Fisher Bioreagents	BP1423-500	2.1.1.1)
对羟基苯甲酸甲酯	Amresco	0572-500G	2.1.1.2)
无水乙醇	Fisher Bioreagents	BP2818-500	2.1.1.2)
Welch's 100% 葡萄汁冷冻浓缩液，340 mL	Amazon	B0025UJVGM	2.1.1.3)
培养皿，10 × 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A	2.1.1.4)
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-545-80	1.4.4), 2.2.2)
酵母，干活性面包酵母	MP Biomedicals	0210140001	2.1) 按体积比将2份水加入1份酵母中（v/v）
钨针	Fine Science Tools	10130-20	2.1)
持针镊	VWR	HS8313	2.1)
多聚甲醛	Fisher Scientific	FLO4042-500	3.1.3)
吐温X-100	Fisher Scientific	BP151-500	3.1.3)
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP9706-100	3.1.3)
4',6-二脒基-2-苯基吲哚	Thermo Fisher Scientific	62247	3.1.4)
抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36930	3.1.6)
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP8-X 白光共聚焦激光扫描显微镜	3.2)
三维成像重建软件	Leica	LASX 配备三维可视化模块	3.3)
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-552-3	3.1.6)
无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV6）	Dr. Teixeria, L.		4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes	ATCC	菌株：10403S	4) 单核细胞增生李斯特菌菌株10403S（Bishop 和 Hinrichs，1987）在含有50 µg/ml 链霉素的Difco脑心浸液（BHI）肉汤（BD Biosciences）中，于30 °C 培养。
DNase I	Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)	18068015	基因组DNA降解
cDNA合成试剂盒	Bio-Rad	1708891	cDNA合成
IIV6_193R_F	IDT		qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R	IDT		qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR 试剂	Thermo Fisher Scientific	K0251, K0252, K0253	qRT-PCR
实时荧光定量PCR系统	Thermo Fisher Scientific	4351107, 7500 Software v2.0	qRT-PCR
抗单核细胞增生李斯特菌抗体	abcam	ab35132	Western blot
兔源抗肌动蛋白抗体	SIGMA-ALDRICH	A2066	Western blot
抗兔IgG（H+L），HRP标记	Promega	W4011	Western blot