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组蛋白修饰的染色质免疫沉淀(ChIP)实验——以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为材料

DOI:

10.3791/57080

2017年12月29日

本文内容

摘要

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本文介绍了一种从芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中进行染色质免疫沉淀以富集修饰组蛋白的实验方案。免疫沉淀所得的DNA随后用于定量PCR,以检测组蛋白翻译后修饰在整个基因组中的丰度和定位情况。

摘要

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组蛋白翻译后修饰(PTMs),如乙酰化、甲基化和磷酸化,由一系列酶动态调控,这些酶根据细胞接收到的信号添加或去除这些修饰标记。这些PTMs在基因表达调控和DNA修复等过程的调控中起着关键作用。染色质免疫沉淀(chIP)已成为解析在不同细胞扰动条件下全基因组范围内多种组蛋白PTMs丰度与定位的重要手段。本文介绍一种适用于酿酒酵母中翻译后修饰组蛋白的染色质免疫沉淀的通用方法。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 该方法描述如下:利用甲醛处理酵母培养物,实现蛋白质与DNA的交联;通过珠击法裂解酵母细胞制备裂解液;使用微球菌核酸酶消化使染色质片段溶解;随后对组蛋白-DNA复合物进行免疫沉淀。与目标组蛋白修饰相关的DNA被纯化后,通过定量PCR分析,评估其在基因组多个位点的富集程度。文中讨论了在野生型和突变型酵母中检测组蛋白修饰H3K4me2和H4K16ac定位的代表性实验,以展示数据分析与解释方法。该方法适用于多种组蛋白翻译后修饰(PTMs),可应用于不同突变菌株,或在多种环境胁迫条件下进行,是研究不同条件下染色质动态变化的有力工具。

引言

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组蛋白的动态翻译后修饰(PTM)是调控多种以DNA为模板的生命过程的关键机制,包括转录、复制和DNA修复1,2因此,确定这些过程中修饰组蛋白的丰度及其精确定位的能力,对于理解细胞在不同条件下对这些过程的调控机制至关重要。染色质免疫沉淀(chIP)技术的发展在很大程度上源于蛋白质与DNA相互作用的生化研究,特别是 体外 使用化学交联剂的方法,结合评估蛋白质-DNA 相互作用动态特性的需求 体内 以及基因组的特定区域3,4,5定量PCR(qPCR)和测序技术的进步也增强了开展染色质免疫沉淀(chIP)实验的能力,可实现定量比较并覆盖整个基因组,使其成为在多个层面解析DNA-蛋白质相互作用的有力工具。

目前,对于任何关注染色质介导的基因组调控的研究团队而言,染色质免疫沉淀(chIP)是一种必需的方法,因为在体内直接探究组蛋白修饰与特定基因组位点之间物理联系的方法中,尚无其他可与之相比的技术。in vivo。尽管已有采用下一代测序技术来全基因组范围内绘制组蛋白修饰图谱的chIP方法变体6

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方案

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1. 将抗体预结合至磁珠

  1. 充分混匀蛋白A/G磁珠,每份免疫沉淀(IP)样品取20 µL磁珠转移至1.5 mL离心管中。
    注意:吸取磁珠时,请使用宽孔、低吸附的枪头。
  2. 将装有磁珠的离心管置于磁力架上,静置使磁珠吸附至管壁一侧,随后小心移除上清液。
  3. 用1 mL预冷的Tris缓冲盐水(TBS)(50 mM Tris-HCl pH 7.5,150 mM NaCl)洗涤磁珠3次。
  4. 向磁珠中加入200 µL TBS及适量抗体,于4 °C、8 rpm条件下旋转孵育过夜。
    注意:对于多数组蛋白PTM抗体,每份IP使用1–3 µg抗体已足够。但建议通过梯度稀释实验确定最佳浓度。已充分表征的商业化组蛋白PTM抗体,其推荐使用浓度通常准确,可参考已发表文献或产品说明书。
  5. 将磁珠置于磁力架上,待磁珠吸附后移除上清液,再用1 mL TBS洗涤一次。
  6. 每份IP样品加入20 µL TBS重悬磁珠,并额外加入5 µL TBS(以补偿移液误差)。
    注意:磁珠悬液可在4 °C短期保存,直至使用。

2. 培养酵母细胞

  1. 取适量YPD培养基(10%酵母提取物、20%蛋白胨和20%葡萄糖)10 mL,接种适当菌株的单菌落,于30 °C、220 rpm摇床培养箱中过夜培养。
  2. 使用分光光度计测定酵母培养....

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结果

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该实验方案的一个关键步骤是优化微球菌核酸酶(MNase)的浓度,以将染色质消化成可溶性片段,如步骤10所述。这对于获得组蛋白修饰在基因组特定区域分布的高分辨率数据至关重要。应进行MNase梯度实验,以确定最适浓度,使可溶性染色质组分中主要为单核小体,并含有少量二核小体。可通过提取经MNase消化后的染色质沉淀中的DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳来观察结果(图2)。在本实验所用MNase的制备条件下,2.5 µL酶液(20单位/µL)可主要产生单核小体,因此该用量被用于后续的染色质免疫沉淀(chIP)实验。

本研究展示了该染色质免疫沉淀(chIP)实验的两组代表性结果(图3)。在第一个示例中,检测了野生型细胞与缺失催化该甲基化修饰的甲基转移酶的细胞中组蛋白甲基化标记的情况。具体而言,在野生型和set1Δ细胞中,分别使用针对.......

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讨论

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本文所述方法可通过免疫沉淀高效回收酵母细胞中与修饰组蛋白结合的DNA。随后使用可扩增目标区域的引物进行qPCR,以确定特定组蛋白修饰在局部区域的富集或耗竭情况。尽管染色质免疫沉淀(chIP)技术已有近20年的发展历史,它仍然是研究不同基因组区域及多种条件下组蛋白修饰状态的决定性实验方法。虽然将chIP与下一代测序技术联用可实现全基因组范围内的组蛋白修饰分析6,7,但这些方法的成本和所需的数据分析工作量可能限制其在某些实验室环境中的应用。此外,这些表观基因组学实验之后通常还需进行与qPCR联用的chIP实验,以验证某些基因组位点处组蛋白修饰状态的观察结果。目前尚无多少其他方法能够像chIP一样,有效地将组蛋白标记(或其他蛋白质)在物理上与基因组中的特定位置关联起来,并分析该相互作用在不同环境或生物学条件下的动态变化。尽管近期已有成功从定义明确的基因组区域分离染色质,并利用质谱技术鉴定局部组蛋白修饰的报道8,9

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢 Green 实验室成员提供的有益讨论。本工作部分由 NIH 资助项目 R03AG052018 和 R01GM124342 支持,资助对象为 E.M.G。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酵母提取物Research Products International (RPI)Y20025-1000.0
蛋白胨Research Products International (RPI)P20250-1000.0
葡萄糖ThermoScientificBP350-1
甲醛Sigma-AldrichF8775
甘氨酸Fisher ScientificAC12007-0050
TrisAmresco0497-5KG
EDTASigma-AldrichE6758-500G
NaClThermoScientificBP358-10
4-壬基苯基-聚乙二醇Sigma-Aldrich74385等同于 NP-40
MgClThermoScientificS25533
CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
LiClThermoScientificAC413271000
十二烷基硫酸钠AmrescoM107-1KG
脱氧胆酸钠Sigma-Aldrich30970-100G
乙酸钠Sigma-AldrichS2889
NaHCO3ThermoScientificS25533
PMSFSigma-AldrichP7626-5G
酵母蛋白酶抑制剂混合物VWR10190-076
25 酚:24 氯仿:1 异戊醇VWR Life Science97064-824
乙醇Sigma-AldrichE7023
无核酸酶水VWR100720-992
微球菌核酸酶Worthington BiochemicalLS004797
糖原ThermoScientificR0561
蛋白酶KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
 Bradford 法检测试剂ThermoScientific23238
 BSA 标准品 2 mg/mLThermoScientific23210
α H4EMD Millipore04-858
α H4K16acEMD MilliporeABE532
α H3Abcamab1791
α H3K4me2Active Motif39142
 高 Rox qPCR 混合液Accuris qMax Green, 低 Rox qPCR 混合液ACC-PR2000-L-1000
Protein A/G 磁珠ThermoScientific88803
适用于 1.5 mL 管的磁力架Fisher ScientificPI-21359
酸洗玻璃珠Sigma-AldrichG8772
 微型管匀浆器BenchmarkD1030
带密封圈的 2.0 mL 螺口管Sigma-AldrichZ763837-1000EA
加样枪头(凝胶上样用)Fisher Scientific07-200-288
比色皿Fisher Scientific50-476-476
Parafilm 封口膜Fisher Scientific13-374-10
50 mL 锥形管Fisher Scientific14-432-22
384 孔 PCR 板Fisher ScientificAB-1384W
 旋转式摇床New Brunswick Scientific型号 G10
分光光度计ThermoScientificND-2000c
 实时荧光定量 PCR 检测系统Bio-Rad1855485

参考文献

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  1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
  2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Bio....

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标签

PCR H3K4me2 H4K16ac

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