本文描述了一种从小鼠脑组织和细胞培养物中分离不溶性和可溶性突变亨廷顿蛋白亚型的方法。该方法可用于表征和定量亨廷顿蛋白的动态变化，有助于分析疾病发病机制中以及存在干扰因素时的蛋白质稳态。
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摘要
摘要
错误折叠蛋白的积累是亨廷顿病（HD）及许多其他神经退行性疾病病理过程的核心。具体而言，HD 的一个关键病理特征是突变型 HTT（mHTT）蛋白异常聚集，形成高分子量复合物以及由蛋白片段和其他蛋白组成的细胞内包涵体。目前用于检测和研究含 mHTT 聚集体不同形式贡献的常规方法包括荧光显微镜、蛋白质印迹分析和滤膜截留实验。
然而，大多数这些方法具有构象特异性，因此可能无法解析mHTT蛋白流动的完整状态，这是由于聚集体的溶解性和分辨率具有复杂的性质。
为了鉴定聚集的突变亨廷顿蛋白（mHTT）及其各种修饰形式和复合物，必须对细胞内的聚集体和片段进行分离和溶解。本文介绍了一种用于分离和可视化可溶性mHTT、单体、寡聚体、片段以及不溶性高分子量（HMW）蓄积型mHTT组分的方法。HMW mHTT的水平与疾病进展相关，与小鼠行为学检测结果相对应，并且可被某些治疗干预有效调节1。该方法适用于小鼠脑组织、外周组织及细胞培养样本，也可根据需要调整用于其他模型系统或疾病背景。
引言
确保细胞内蛋白质正确折叠和降解的蛋白质质量控制网络一旦发生紊乱，很可能是阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）以及其他"蛋白质错误折叠"类疾病发病机制的核心因素2,3。因此，深入理解蛋白质稳态网络的组成成分及其在病理过程中的作用，对于开发更有效的治疗干预手段至关重要。HD 是由于 HD 基因中的 CAG 重复序列异常扩增，导致亨廷顿蛋白（huntingtin, HTT）中出现一段延长的多聚谷氨酰胺（polyQ）序列所致4。HD 发病过程中一个稳定的病理特征是 HTT 蛋白的错误折叠、积累并在脑区及外周组织中形成聚集，这一过程已被证实会以多种方式干扰细胞正常的稳态和功能5,6。尽管 HTT 在全身广泛表达，但纹状体中的中等棘状神经元具有选择性易损性，受损最为明显，同时皮层萎缩也显著与 HD 的发病机制相关。
亨廷顿病（HD）患者及动物模型脑内HTT蛋白聚集体的形成通常被用作疾病进展的替代标志物，并反映突变HTT（mHTT）的显性负性功能获得效应7。尽管蛋白质错误折叠和聚集导致mHTT毒性的具体机制尚不明确，但在HD患者及多种动物模型脑内形成包涵体是一种恒定且不可避免的特征。这些包涵体主要由含有N端扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）的HTT片段累积而成，表明全长HTT的蛋白水解与加工过程以及选择性剪接8,9可能在HD发病机制中发挥重要作用。N端HTT片段可能构成一种致病性HTT形式，能够快速聚集、成核，并加速或促进聚集过程的传播10。
然而，这些包涵体的存在并不一定与HTT诱导的毒性或细胞死亡相关11。据提出，HTT会经历一个从可溶性单体经由可溶性寡聚体和β片层纤维，最终形成不溶性聚集体和包涵体的聚集过程12。由于这些不同蛋白质形态在低去污剂裂解缓冲液中具有稳定性，且难以通过常规生化检测方法进行可视化，因此利用标准生化检测方法解析这些蛋白形态一直是该领域面临的挑战。因此，在检测突变HTT（mHTT）的累积程度和聚集模式时，方法学上的考量至关重要。
本文所述方案提供了一种可视化亨廷顿蛋白（HTT）多种中间产物的方法，特别是可溶性高分子量（HMW）HTT不可溶物种的形成过程，该过程似乎与亨廷顿病（HD）的发病机制及疾病进展密切相关1,13,14。能够分辨并追踪多种突变型HTT（mHTT）物种，为研究人员提供了一种生化工具，可用于研究疾病发病机制，并通过评估潜在治疗干预手段对疾病发病过程的调节作用及其影响，来评价其治疗效果。
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方案
动物伦理声明——实验严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》以及加州大学欧文分校（University of California, Irvine）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的动物研究方案进行。该校为AAALAC认证机构。所有实验均尽可能减少动物痛苦。
1. 裂解缓冲液的制备
- 准备 "可溶性" 裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，1% Triton-X 100，150 mM NaCl，10%甘油），经0.22 µm滤膜无菌过滤。
- 用于工作 "可溶性" 裂解缓冲液，量取N-乙基马来酰亚胺（NEM），并充分溶解于100 mM苯甲基磺酰基 氟化苯甲基磺酰氟（PMSF）溶于100%乙醇（EtOH）。
注意：裂解缓冲液抑制剂：（i）20 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）；（ii）0.2 mM PMSF；（iii）1 mM 原钒酸钠（Na3VO4）；（iv）1 µg/mL 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）；（v）1 µg/mL 抑肽酶（aprotinin）；（vi）20 mM 氟化钠（NaF）。
注意：在整个实验过程中，处理NEM时必须佩戴口罩。裂解缓冲液需新鲜配制，以确保抑制剂的活性。 - 对于含蛋白酶抑制剂的可溶性裂解缓冲液，按以下顺序加入抑制剂：氟化钠（NaF）、用冷裂解缓冲液定容至终体积、原钒酸钠（Na3VO4抑肽酶和亮抑蛋白酶肽。
- 用于工作 "可溶性" 裂解缓冲液，量取N-乙基马来酰亚胺（NEM），并充分溶解于100 mM苯甲基磺酰基 氟化苯甲基磺酰氟（PMSF）溶于100%乙醇（EtOH）。
- 对于 "不溶性" 裂解缓冲液，通过向2 mL中加入500 µL 20% SDS，补充至4% SDS "可溶性" 裂解缓冲液。室温放置。
注意：SDS 在 4 °C 保存时会析出沉淀；请于室温保存。裂解缓冲液终浓度组成：10 mM Tris（pH 7.4）；1% Triton X-100；150 mM NaCl；10% 甘油；4% SDS（仅不溶性）。
2. 可溶性/不可溶性组分分离方案
注意：示意图参见图1。
- 为每个样本标记两组试管： "可溶的" 和 "不溶。"
- 加入 X-µL 冰冷的含蛋白酶抑制剂（见 1.1.1）的工作浓度可溶性裂解缓冲液至组织中。
注意：X = 体积根据组织量不同而变化；参见 表1. - 对于小鼠脑组织（即，纹状体），在1 mL玻璃Dounce匀浆器中缓慢匀浆30次 并用移液器转移至 "不溶性" 标记的离心管（置于冰上）。
注意：开始使用Dounce匀浆器后，应避免打破液面，否则会产生气泡，可能导致匀浆不完全。 - 对于细胞（即，HeLa，HEK293T），用预冷的1×PBS洗涤细胞一次。吸除PBS，加入最小体积的裂解缓冲液，用细胞刮棒刮取细胞。
注意：对于上述细胞系，细胞接种密度为 5 x 105 每6孔板接种细胞至接近汇合。一个孔的细胞量相当于小鼠纹状体所用体积。 - 将匀浆液或细胞裂解物转移至已标记的， "不溶性" 离心管置于冰上裂解1小时（最后一管处理完毕后开始计时）。
注意：对于细胞裂解液，在开始孵育前需反复吹打数次，以分散细胞团块。避免产生气泡。在裂解过程中途，每份样品短暂涡旋振荡1秒。 - 在 4 °C、15,000 x g 条件下离心样品 20 分钟。
- 回收上清液作为 "可溶性" 组分
- 用移液器小心移除，注意不要扰动沉淀/浑浊层，以免污染组分。将上清组分移入 "可溶性" 标记试管，置于冰上。
- 用500 µL裂解缓冲液洗涤沉淀（重复2次），每次洗涤后在4 °C、15,000 x g条件下离心5 min；移除上清时带出部分浑浊层亦无妨。
- 最后一次洗涤后，移除所有残留的洗涤缓冲液，仅保留组织沉淀。
注意：从此时起，不溶性样品应于室温保存。 - 用 X µL 裂解缓冲液重悬沉淀，裂解缓冲液中添加 4% SDS（体积可根据沉淀大小调整；参见 表1).
- 每个样品在室温下使用探头式超声仪（125 瓦，20 kHz，脉冲模式，振幅 40%）超声处理 30 秒，参见 材料表).
- 将样品煮沸（剧烈沸腾）30分钟；在6,000 × g下短暂离心（15秒），以避免样品损失 样品
- 进行去垢剂兼容性（DC）蛋白质测定（参见 材料表）或Lowry蛋白测定法测定蛋白浓度（建议细胞裂解液的起始稀释度为样品在相应裂解缓冲液中1/5稀释，组织裂解液为1/10稀释）。
注意：由于去垢剂浓度较高，必须使用DC法或Lowry法测定蛋白浓度。 - 将样品分装为每份50 µL，以避免冻融问题。
注意：在此步骤可暂停实验流程，将两个组分于 -20 °C 保存，以便后续进行生物化学分析。
3. 蛋白质印迹与定量分析
- 按照文献报道的方法1,13进行Western印迹，将30 µg样品以1:1比例稀释于上样缓冲液（1.6x上样染料，1x还原剂）中。
注意：每条泳道上样30 µg蛋白已足够，但可根据最佳分辨率需求进行调整。不溶性组分应使用3 - 8% Tris-乙酸聚丙烯酰胺凝胶，可溶性组分推荐使用4 - 12% Bis-Tris凝胶。 - 将样品煮沸（持续翻滚沸腾）5分钟，然后在6,000 × g离心15秒以收集样品。
- 根据生产商针对还原样品的说明书，通过SDS-PAGE和Western印迹分析各组分。
注意：不溶性组分在转移至0.45 µm硝酸纤维素膜时效果最佳。可溶性组分可使用0.45 µm或0.2 µm硝酸纤维素膜，具体取决于目标蛋白的大小。对于高分子量物质的转移，可能需要进行一定的优化。 - 使用全蛋白染色剂（例如，MEMcode，参见材料表）对膜进行染色，以评估蛋白上样均一性。
注意：Western印迹可通过平均像素强度进行分析。可溶性组分可依据实验体系选择最合适的看家蛋白进行归一化。不溶性组分中相对蛋白丰度的验证可通过可逆蛋白染色或在另一张印迹膜上以组蛋白H3归一化实现。
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结果
可采用蛋白质印迹分析和滤膜滞留实验检测分级分离后可溶性与不可溶性细胞裂解物的分离情况图2）。例如，使用转染试剂对HEK293T细胞进行转染（例如，Lipofectamine 2000），转染含有97个谷氨酰胺重复序列的HTT外显子1编码cDNA15 接着是富含多聚脯氨酸的区域，这些细胞被允许表达44小时。细胞分别用以下处理 5 µM MG132 处理以阻断蛋白酶体，或使用 DMSO 作为对照，处理 18 小时后收集细胞并按上述方法裂解。经分级分离后，突变型 HTT 外显子 1 在 4 - 12% Bis-Tris PAGE 凝胶上以约 45 kDa 的可溶性单体形式存在，而在 3 - 8% Tris-乙酸 PAGE 凝胶上则表现为高分子量（HMW）不溶性聚集物。图 2A）。可溶性单体可定量并以看家蛋白（此处显示为 GAPDH）进行归一化。HMW（高分子量）不溶性 mHTT 通过平均像素强度...
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讨论
为确保上述实验方案结果的一致性和定量性，需采取一些预防措施。首先，两种组分中的突变亨廷顿蛋白（mHTT）在多次冻融循环后会随时间推移自发形成聚集体，尤其是在高浓度条件下。因此，必须将蛋白样品分装后冷冻，并仅在按照上述方案进行检测前解冻所需体积。此外，若不溶性组分在解冻后出现白色沉淀，则可能需要通过额外的5秒超声处理、5分钟煮沸，并在生化检测分析前重新定量，以实现有效重悬。
通过将可溶性组分的平均像素强度与每个样本中的上样对照或看家基因进行归一化，可实现本检测的定量分析。如图所示，由于GAPDH主要定位于细胞质，因此被用作可溶性组分的看家基因（图1）。其他常用的看家蛋白包括肌动蛋白（actin）、α-微管蛋白（α-tubulin）和Erk 1/2。然而，应针对所研究的系统优化合适的归一化蛋白，以确保其表达处于稳定状态，从而实现准确且不受干扰的归一化。尽管不溶性组分因存在组蛋白3且缺乏GAPDH而可作为粗核组分（1），但在3–8% PAGE凝胶上的分辨率限制了对常用核标志物的检测...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：RO1-NS090390）资助。我们还要感谢Joan Steffan博士在本检测方法开发过程中提供的技术协助和讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无菌滤器 | Millipore | SCGP505RE | 带螺口盖的无菌真空滤器 |
| 1 mL 组织研磨器，Dounce 型 | Wheaton | 357538 | |
| 超声破碎仪 | Qsonica | Model Q125 | |
| DC 蛋白定量试剂盒 | Biorad | 5000111 | 与 Lowry 法相当 |
| 1 M Tris 缓冲液 | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| 5 M NaCl 溶液 | Teknova | S0251 | |
| 甘油 | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS 溶液 | Teknova | S0295 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | E1271 | |
| 苯甲基磺酰氟 | Sigma | P7626 | 用 100% 乙醇配制 100 mM 储存液，4°C 保存 |
| 正钒酸钠 | Sigma | S6508 | 用水配制 0.5 M 储存液 |
| 亮抑蛋白酶肽 | Sigma | L2884 | 用水配制 10 mg/mL 储存液 |
| 抑肽酶 | Sigma | A1153 | 用水配制 10 mg/mL 储存液 |
| 氟化钠 | Sigma | S4504 | 用水配制 500 mM 储存液 |
| 抗 HTT 抗体 | Millipore | MAB5492 | Western 印迹按 1:1000 使用，滤膜滞留实验按 1:500 使用 |
| 抗 GAPDH 抗体 | Novus Biologicals | NB100-56875 | 可溶性蛋白 Western 印迹按 1:1000 使用 |
参考文献
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