本文介绍了一种利用三维聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术分析油菜（B. napus）韧皮部渗出液中大型天然蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸复合物蛋白质组成的方法，该技术结合了蓝色天然电泳（BN）和两种变性PAGE，并随后进行质谱鉴定。
本文内容
摘要
摘要
对高等植物韧皮部进行取样通常费时费力，且在很大程度上依赖于植物种类。然而，在不同植物物种中，已可实现变性条件下的蛋白质组研究。尽管天然状态下的蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸复合物在韧皮部样本中可能在维持这一特化区室或长距离信号传导中发挥重要作用，但目前对此类复合物的分析仍极为有限。可利用蓝色天然凝胶电泳（BN-PAGE）分离大分子复合物，其蛋白质组分可通过后续的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进一步分离。然而，分子量相近的蛋白质会共迁移，这可能阻碍质谱鉴定蛋白质。将BN-PAGE与两种不同的变性凝胶电泳步骤——即Tris-Tricine-尿素电泳和SDS-PAGE相结合，可根据蛋白质的亲水性/疏水性实现额外分离，从而提高分辨率并提升质谱鉴定成功率。该方法甚至能够区分仅在翻译后修饰上存在差异的蛋白质。此外，还可应用蓝色天然Northern印迹法鉴定大分子复合物中的RNA组分。我们证明，本方案适用于解析韧皮部样本中天然存在的蛋白质-蛋白质复合物及核糖核蛋白（RNP）复合物中的蛋白质和RNA组分。将蓝色天然PAGE与两种不同的变性PAGE步骤结合，有助于分离多种大型蛋白质复合物，并提高其组分通过质谱鉴定的成功率。此外，该方案具有足够的稳健性，可同时检测单个蛋白质复合物中可能结合的核酸分子。
引言
韧皮部的长距离输导组织对高等植物中有机养分的分配至关重要，同时也参与调控许多与生长发育、病原体防御以及对不利环境条件适应相关的重要过程。除了离子、植物激素或代谢物等小分子效应物外，蛋白质和RNA等大分子最近也被认为是潜在的信号分子。
研究表明，韧皮部对蛋白质的装载具有尺寸依赖性，由连接伴胞（CC）和筛管分子（SE）的胞间连丝单位的孔径排阻极限（SEL）所控制，通常范围在10至>67 kDa1,2,3之间。然而，尽管存在这种尺寸限制，在韧皮部系统中仍发现有较大分子量的蛋白质及蛋白质复合物，这挑战了单纯的尺寸排阻理论4，甚至有研究提出蛋白质可能从伴胞非特异性地泄漏至筛管分子5。
多蛋白复合物以及大型核糖核蛋白复合物在生物合成及维持细胞结构完整性中发挥关键作用6。已有证据表明，韧皮部可移动的蛋白质-蛋白质复合物和核糖核蛋白复合物确实存在4,7，但迄今为止，关于其功能的信息仍十分有限。在韧皮部筛管分子中，蛋白质:蛋白质复合物及RNP复合物被认为参与长距离运输和/或信号传导8,9。为了揭示这些转移复合物的功能，需要在不同环境或胁迫条件下研究其组成。为此，必须分离天然状态下的复合物，并以足够分辨率将其组分分离开来。
为了分离韧皮部中的高分子量复合物，首先需要获得足够质量和数量的韧皮液样品。可用于采集韧皮液的技术取决于目标植物物种。目前存在三种主要获取韧皮液的方法10：昆虫口针切断法11、EDTA促进渗出法12和自发渗出法13。
Arabidopsis thaliana（A. thaliana）是全球实验室中主要的模式植物，其韧皮部样品只能通过EDTA辅助渗出法或蚜虫吻针切除法获得14,15。这两种方法均会导致韧皮部汁液高度稀释或样品量极低。此外，EDTA辅助渗出法容易受到污染，可能无法真实反映韧皮部的实际成分16。自发性韧皮部渗出仅限于葫芦科植物、羽扇豆或丝兰等植物种类，这些植物在被切断部分器官后会自发释放韧皮部汁液，便于收集13,17,18,19。我们近期已将油菜（Brassica napus）确立为适用于韧皮部分析的合适模式系统，因其与A. thaliana亲缘关系较近，且通过微小切口即可获得数微升高纯度的韧皮部汁液4,8,20。此外，B. napus的基因组序列已于2014年公布21。
除蚜虫吻针切断法外，所描述的所有韧皮部采集方法均会在取样部位造成周围组织的损伤，而韧皮部汁液的成分可能因损伤而发生变化。因此，无论采用何种取样方法，检查韧皮部样品的质量都至关重要。目前有多种用于采集的韧皮部汁液质量控制的方法，例如通过测定RNase活性22,23、使用针对Rubisco的引物进行RT-PCR8,24，或分析糖类组成8。
可采用多种方法分离和纯化蛋白质复合物，包括尺寸排阻色谱法、蔗糖密度超速离心法，或通过具有不同分子量截断值的膜对样品进行过滤。然而，这些方法的分辨率较低。由 Schägger et al. 首次描述的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）技术25，在分辨率方面具有显著优势。该技术已成功用于测定来自不同细胞器或细胞裂解液中的大型天然蛋白质复合物的分子量及其相对丰度26,27。
为了进一步阐明蛋白质复合物的复杂组成，有必要在变性条件下分离其各个组分，从而实现复合物组分的完全解离。这可以通过第二维SDS-PAGE28,29实现；若需获得更高分辨率，则可采用第二维等电聚焦（IEF）分离，随后进行第三维SDS-PAGE30，并结合质谱技术对蛋白质进行鉴定。
在本实验方案中，我们描述了从 B. napus 植物中采集纯韧皮部汁液的方法，并利用结合了BN-PAGE、Tris-Tricine-尿素-PAGE和SDS-PAGE的三维电泳技术对这些韧皮部样品中的蛋白质复合物进行分析。分离后的蛋白质复合物组分随后通过质谱技术进行鉴定。此外，我们还引入了蓝色天然Northern印迹法，该方法可用于检测大型核糖核蛋白（RNP）复合物中的RNA4，从而拓展了该技术的应用范围。
方案
1. 从 B. napus 植物中采集和制备韧皮部汁液 4,8,20
- 用于韧皮部汁液采样时，使用充分浇水的8周龄植株 B. napus 仅显示初期开花的植株，以防止花粉污染。
- 使用皮下注射针头（Ø 0.8 mm）在花序茎上多次穿刺。在其他花序茎及其他植株上重复该操作，以获取足量韧皮部汁液（图2a).
注意：进行复杂分析时，建议起始使用至少 600 µL 的韧皮部汁液。4 至 5 株植物可获得 200 至 700 µL 的韧皮部汁液。 - 用滤纸擦去损伤部位的首滴液体。这些液滴主要含有来自周围受损组织的高污染物质，应予以弃去。
- 使用移液器收集以下液滴，并将收集的渗出液置于预冷的1.5 mL锥形反应管中，采用无冰冷却系统于-20 °C保存。
- 继续收集，直至无法观察到液滴形成，但时间不超过1小时。该操作可在两天后重复进行，且所收集的韧皮部汁液无明显损失。
注意：收集的韧皮部汁液可立即使用，或于 -80 °C 保存以备后续分析。如需在 -80 °C 保存，应将反应管在液氮中迅速冷冻。 - 将韧皮部样品浓缩至约1/6th 使用截留分子量（MWCO）为10,000道尔顿（Da）的离心浓缩装置，将初始体积浓缩至原体积的一部分。在4 °C、20,000 x g条件下离心浓缩后的样品至少15分钟，以去除灰尘颗粒。
注意：韧皮部汁液浓度不会导致蛋白质显著流失。 - 对于后续的复合分析，请继续执行步骤 3.1。
2. 利用逆转录PCR（RT-PCR）控制韧皮部汁液纯度 4,8,20
- 采用适用于液体材料的标准RNA提取方法，从韧皮部汁液中分离总RNA（例如 TRIzol 或苯酚-氯仿抽提，随后根据制造商方案从水相中用异丙醇沉淀并用乙醇洗涤。
注意：苯酚-氯仿具有毒性。操作时应在通风橱内进行，并使用适当的个人防护装备。提取的RNA可在-80 °C乙醇中保存长达六个月。 - 用DNase I（1 U/µg）消化45分钟以去除DNA污染，反应条件为37 °C；随后加入EDTA至终浓度5 mM以灭活酶活性，并将样品在75 °C孵育10分钟。
- 为获得高纯度RNA，需通过另一步纯化操作对样品进行纯化和浓缩（例如 根据制造商说明书，使用RNA纯化试剂盒进行操作。
- 使用150 ng纯化RNA，按照cDNA合成试剂盒的制造商说明书进行逆转录PCR（RT-PCR）以合成cDNA。
注意：cDNA 可在 -20 °C 保存，以备后续使用。 - 使用5 µL cDNA作为模板，按照制造商说明进行标准PCR反应，以扩增特定区室的转录本，并通过琼脂糖凝胶电泳检测。可通过使用核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基、硫氧还蛋白h和花粉包被蛋白的引物等方法验证韧皮部样品的纯度图1b, 表1).
3. 蓝色天然PAGE 4,25,26,31
- 使用自行制备的天然梯度凝胶，具体方法见其他文献描述27 或商用 Bis-Tris 梯度凝胶。
- 每孔上样20至30 µg浓缩蛋白样品，至少设三个重复。
- 在4 °C、150 V条件下，使用深蓝色阴极缓冲液B和阳极缓冲液电泳运行凝胶表 2) 直至样品迁移至凝胶长度的1/3处rd 凝胶的约 20 至 30 分钟， 图3a).
注意：进行Northern印迹时，单个凝胶泳道已足够；而若需通过三维PAGE和质谱分析蛋白质组成，则建议合并最多十个凝胶泳道中相同位置的条带，以富集丰度较低的蛋白质。 - 暂停运行，将深蓝色阴极缓冲液B更换为浅蓝色阴极缓冲液B/10（表2）并继续电泳。当蓝色前沿开始从凝胶中流出时，结束电泳。约 120 至 180 分钟， 图3a).
注意：制备好的蓝色天然凝胶可在 4 °C 下保存至少一周。长时间存放可能导致条带弥散，应避免。深蓝色缓冲液 B 可重复使用。
4. 可选：使用蓝色天然Northern印迹法检测RNA 4
- 从蓝色天然凝胶中切下明显的条带或使用整个凝胶泳道，通过半干转印法以3.5 mA/cm²的电流密度转移至尼龙膜上2 60 分钟，并用铅笔在膜上标记上下胶的边界（图4a).
- 转印后，用经DEPC处理的水洗涤膜，并夹在两张滤纸之间干燥。
- 使用 120,000 µJ/cm² 的紫外线对印迹膜进行交联处理2 （如果使用交联仪，85 秒） 材料表).
- 用6 mL杂交缓冲液（商品化或自制）在杂交炉中68 °C条件下预杂交膜60分钟图4a).
- 加入1 mL杂交缓冲液，其中含有4 µL的3'-生物素标记探针（100 nM）。
- 将膜与探针在烘箱中孵育过夜，同时将烘箱温度从 68 °C 逐渐冷却至 37 °C。
- 用含有 2x SSC 和 0.1% SDS 的缓冲液在室温下洗涤膜 5 分钟，以去除非特异性结合的探针。
注意：SDS 可引起刺激。操作 SDS 及含 SDS 溶液时，请佩戴手套和实验服。 - 在膜上检测3'-生物素标记的探针 例如 使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）偶联物及鲁米诺（luminol）作为辣根过氧化物酶（HRP）底物，产生灵敏的化学发光反应（图4a).
5. 第二维：Tris-Tricine-尿素PAGE 4,28
- 从蓝色天然凝胶中切下单一条带。将平行泳道中样品的条带合并，以进一步浓缩复合蛋白（图5）。
注意：切下的条带可暂时保存在单个反应管中，4 °C 下备用。 - 制备一块12% Tris-Tricine-尿素凝胶（厚度1 mm，尺寸为6.8 cm × 8.6 cm（宽×长））。配制10 mL 分离胶溶液A（表2），倒入两块玻璃板之间，并用异丙醇覆盖上层。待聚合完成后，吸去异丙醇，加入4 mL 浓缩胶溶液B（表2），插入10孔梳子。
注意：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，TEMED 吸入后有害。操作时务必佩戴个人防护装备，并在通风橱内进行。 - 将切下的凝胶条带转移至1.5 mL 反应管中，加入1 mL 2× SDS上样缓冲液，用于凝胶碎片的平衡（图5，表2）。
- 室温孵育10分钟，随后在加热块（95 °C）或微波炉中煮沸，再于室温继续孵育15分钟。
- 将代表同一复合物的多个已平衡凝胶碎片叠加，装入同一凝胶孔中。
- 使用阳极和阴极电泳缓冲液，在150 V条件下电泳45至60分钟，然后切下整条凝胶泳道。
- 将切下的泳道先在酸性缓冲液（100 mM Tris，100 mM 乙酸）中孵育20分钟，再在125 mM Tris-HCl（pH 6.8）中平衡20分钟（图5）。
6. 第三维：SDS-PAGE 4,32
- 根据 Laemmli32 方法配制 15% SDS 分离胶（厚度：1.5 mm，尺寸：6.8 cm × 8.6 cm（宽 × 长））（表 2），并在其上方加入一层薄薄的 4% 浓缩胶。
注意：SDS、丙烯酰胺和 TEMED 具有毒性和危害性。请在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备。 - 将平衡后的凝胶条转移至 SDS 凝胶上，并用含有微量溴酚蓝的 1× SDS 电泳缓冲液中配制的 0.5%（w/w）琼脂糖覆盖凝胶（图 5）。
- 在上样前，将含琼脂糖的 SDS 电泳缓冲液在微波炉中煮沸。
- 若需运行蛋白质 Marker 以估计各组分的分子量，可在凝胶一端插入一片滤纸，直至琼脂糖完全凝固，或使用通常用于 IPG 胶的专用梳子。
- 以 150 V 恒压电泳 60 分钟，随后使用胶体考马斯亮蓝染色、银染或其他适用于后续质谱分析的染色方法对凝胶进行染色。
- 采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等质谱技术分析可见的蛋白质点。
注意：我们推荐使用已报道的胶体考马斯亮蓝染色方法33。在我们的实验中，即使丰度较低的蛋白质也能得到充分染色，并可获得数据质量合理的质谱分析结果。
结果
本文介绍了一种用于分析来自甘蓝型油菜（Brassica napus）韧皮部样品中蛋白质-蛋白质以及蛋白质-RNA复合物的实验方案。该流程如图1所示。B. napus相较于其他模式生物的一个主要优势在于，可通过花序茎上的微小穿刺相对容易地收集韧皮部样品，从而能够获得较大量且较纯净的韧皮部样本。在采集韧皮部样品时，建议始终检测是否存在污染，例如通过RT-PCR8进行检测。一个来自纯净韧皮部样品的代表性结果如图2所示。未受污染的韧皮部样品中应可见硫氧还蛋白h（thioredoxin h）的明显条带，而核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）和花粉外壁蛋白则不应出现信号。在叶片、花序茎或花粉样品中，rubisco小亚基可作为污染对照。硫氧还蛋白h应在所有样品中均可检测到，因为其mRNA已在多种植物的韧皮部中被发现，而花粉外壁蛋白的转录本应仅在花蕾样品中可见。若在植株完全开花时进行韧皮部取样（可能导致花粉外壁蛋白污染），或在韧皮部穿刺取样时未正确弃去最初的几滴渗出液（可能导致rubisco污染），则可能发生污染。
在进行BN-PAGE之前，必须对韧皮部汁液进行浓缩。每孔上样量为20至30 µg蛋白时，B. napus 韧皮部汁液经BN-PAGE后可清晰显示至少四个主要的蛋白复合物条带；蛋白浓度过低或过高均会导致复合物无法有效分离（图3）。建议将代表同一复合物的多个凝胶条带加载至第二维凝胶的同一个加样孔中，以进一步富集每个单一复合物的蛋白质，便于后续处理及质谱鉴定。
为了鉴定韧皮部大分子复合物的各个组分，我们将初始的BN-PAGE与第二维的Tris-Tricine-尿素凝胶电泳以及第三维的SDS-PAGE相结合，以实现单个蛋白质的分离。此处由于蛋白质在尿素凝胶和SDS-PAGE凝胶中迁移行为的不同，可观察到高分辨率的分离效果。通常，属于同一复合物的蛋白质会在凝胶上呈现为一条对角线。位于该对角线上方的蛋白质具有更高的疏水性，而位于对角线下方的蛋白质则更具亲水性28（图5，图6）。
为了表征RNP复合物，我们使用BN-PAGE凝胶的一部分进行BN Northern印迹分析。将整个泳道的样品转印至尼龙膜并经紫外辐射交联后，可利用RNA特异性探针对RNA进行检测，如图4所示。结果显示，某种特定tRNA仅存在于一个特定的复合物中。该tRNA结合复合物的蛋白质组分可通过上述三维凝胶方法进一步分析。质谱分析表明，该复合物主要含有tRNA连接酶，这证实了BN Northern印迹所发现的tRNA结合活性。
图1：油菜韧皮部汁液中核糖核蛋白复合物分析的工作流程。 在采集并制备韧皮部样品后，进行BN-PAGE以分离天然复合物。此类BN-PAGE凝胶可用于通过BN Northern印迹平行分析核酸，并通过质谱法鉴定复合物中的蛋白质组分。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：B. napus 韧皮部汁液的取样与纯度控制。 使用无菌皮下注射针穿刺 8 至 10 周龄油菜植株的花序茎后，用移液器收集渗出液，并转移至预冷的反应管中（a）。为确认韧皮部样品的纯度，进行 RT-PCR，扩增硫氧还蛋白 h、Rubisco 小亚基以及花粉外壁蛋白在组织特异性样品中的转录本（b）。以不加逆转录酶的 RT-PCR 作为阴性对照（-）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：BN-PAGE。利用浓缩的甘蓝型油菜（B. napus）韧皮部样品进行蓝色天然PAGE的示意图。（a）将15–20 µL浓缩韧皮部汁液上样至梯度蛋白凝胶后，在低温室中使用1×深蓝色阴极缓冲液B以150 V电压电泳20–30分钟。随后将缓冲液更换为1×浅蓝色阴极缓冲液B/10，并继续以150 V电压电泳120–180分钟，直至深蓝色前沿迁移出凝胶。BN-PAGE凝胶显示出四条明显条带，代表四种不同的高分子量复合物。（b）上样量过少，（c）或过多（d）的韧皮部蛋白均会降低各复合物条带的可辨识度。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：蓝色原生Northern印迹法。 蓝色原生Northern印迹方法的示意图。（a）将BN-PAGE的一个泳道通过半干转印法转移至尼龙膜上。经紫外交联和预杂交后，将膜与RNA特异性探针（此处为甲硫氨酸tRNA特异性探针）在杂交炉中于3'端生物素标记的条件下孵育过夜。通过洗涤步骤去除未结合的探针，随后使用链霉亲和素-HRP偶联物和鲁米诺进行RNA的检测。利用该方法，我们观察到BN-PAGE中的复合物IV含有甲硫氨酸tRNA。（b）考马斯亮蓝染色凝胶和tRNA印迹图显示的是平行运行的两个不同泳道，以避免迁移差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：三维电泳（3D-PAGE）。 三维电泳（3D-PAGE）方法的示意图。从BN-PAGE凝胶中切取来自同一复合物的多条蛋白条带，加入上样缓冲液孵育后，转移至第二维Tris-Tricine-尿素-PAGE的一个加样孔中。电泳完成后，将整个凝胶条带切下，用酸性缓冲液洗涤，进行平衡处理，然后置于15% SDS-PAGE凝胶上进行第三维电泳。第三维电泳结束后，分离的蛋白质经考马斯亮蓝染色，并通过质谱分析。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：3D-PAGE后的代表性结果。 在第一维BN-PAGE中出现了多个复合物。通过后续两次变性PAGE可进一步分离其蛋白质组分，形成对角线状的斑点模式。请点击此处查看该图的放大版本。
| 探针 | 序列 |
| 硫氧还蛋白 h | 上游引物： CTCAAGGCAGCCAAAGAATC 下游引物： ATGGCCTGAACATCGAACTC |
| 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基 | 上游引物： TTCACCGGCTTGAAGTCATC 下游引物： CCGGGTACTCCTTCTTGCAT |
| 花粉包被蛋白 BRU77666 | 上游引物： TCAGAACTGGAGCTTCAACG 下游引物： TTCCTTAATGGCCTCAGTGG |
表1：用于韧皮部样品纯度检测的引物。 为确认韧皮部样品的纯度，可使用针对核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基、硫氧还蛋白h和花粉包被蛋白的特异性引物进行cDNA扩增。
| 缓冲液与溶液 | 成分 | 备注 | |
| 深蓝色阴极缓冲液 B | 15 mM Bis-Tris，pH 7.0 50 mM Tricine 0.02% (w/v) 考马斯亮蓝 G250 | 配方改编自 Fiala 等人17 pH 应调节至 7.0 该缓冲液可配制成 10 倍浓缩液 | |
| 浅蓝色阴极缓冲液 B/10 | 15 mM Bis-Tris，pH 7.0 50 mM Tricine 0.002% (w/v) 考马斯亮蓝 G250 | 可通过将阴极缓冲液 B 与不含考马斯亮蓝的阴极缓冲液稀释制备 | |
| 阳极缓冲液 | 50 mM Bis-Tris，pH 7.0 | 该缓冲液可配制成 10 倍浓缩液 | |
| 2x SDS 上样缓冲液 | 125 mM Tris-HCl，pH 6.8 4% SDS 20% 甘油 0.2 M DTT 0.02% (w/v) 溴酚蓝 | ||
| 转膜缓冲液 1x TBE 缓冲液 | 89 mM Tris，pH 7.6 89 mM 硼酸 2 mM EDTA | TBE 缓冲液可配制成 5 倍或 10 倍浓缩液并储存。必须使用无 RNase 的去离子水。 | |
| 2x SSC 缓冲液 | 300 mM NaCl 30 mM Na3柠檬酸盐，pH 7.0 | ||
| 3x 凝胶缓冲液 | 3 M Tris 1 M HCl 0.3% SDS pH 8.45 | 配方改编自 Schägger19 | |
| Tris-Tricine 凝胶溶液 A | 配制 10 mL： 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺 (29:1) 3.34 mL 6 M 尿素 3x 凝胶缓冲液 3.34 mL 70% 甘油 1.4 mL 加 ddH2O 至 10 mL 10% APS 40 µL TEMED 4 µL | 称取 6 M 尿素，加入 3x 凝胶缓冲液、丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液和 70% 甘油。在 60 °C 水浴中加热以溶解尿素。加 ddH2O 至 10 mL，再加入 10% APS，最后加入 TEMED 以启动聚合。 | |
| Tris-Tricine 凝胶溶液 B | 配制 6 mL： 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺 (29:1) 0.8 mL 6 M 尿素 3x 凝胶缓冲液 1.5 mL 加 ddH2O 至 6 mL 10% APS 45 µL TEMED 4.5 µL | 称取 6 M 尿素，加入 3x 凝胶缓冲液和丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液。在 60 °C 水浴中加热以溶解尿素。加 ddH2O 至 6 mL，再加入 10% APS，最后加入 TEMED 以启动聚合。 | |
| 1x Tris-Tricine 电泳缓冲液（阳极） | 100 mM Tris 22.5 mM HCl pH 8.9 | 配方改编自 Schägger19 | |
| 1x Tris-Tricine 电泳缓冲液（阴极） | 100 mM Tris 100 mM Tricine 1% SDS pH 8.25 | 配方改编自 Schägger19 | |
| 酸性缓冲液 | 100 mM Tris 100 mM 乙酸 | ||
| 4% SDS 浓缩胶 | 配制 2 mL： ddH2O 1.4 mL 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺 (37.5:1) 0.33 mL 1 M Tris，pH 6.8 0.25 mL 10% SDS 20 µL 10% APS 20 µL TEMED 2 µL | ||
| 15% SDS 分离胶 | 配制 10 mL： ddH2O 2.3 mL 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺 (37.5:1) 5 mL 1.5 M Tris，pH 8.8 2.5 mL 10% SDS 100 µL 10% APS 100 µL TEMED 4 µL | ||
| 1x SDS 电泳缓冲液 | 25 mM Tris 192 mM 甘氨酸 0.1% SDS | ||
| 考马斯亮蓝染色液 | 5% (w/v) 硫酸铝-(14-18)-水合物 10% (v/v) 乙醇 (96%) 2% (v/v) 正磷酸 (85%) 0.02% (w/v) 考马斯亮蓝 G-250 | ||
| ULTRAhyb 超高灵敏度杂交缓冲液 | Ambion, Life Technologies | ||
表2：溶液与缓冲液配方。 进行3D-PAGE分析所需的所有缓冲液和溶液列表。
| 点样编号 | 实测分子量 [kDa] | 鉴定结果 | 物种 | 登录号 | 理论分子量 [kDa] | MASCOT 分值 | |
| CIV_1 | 130 | 假定疾病抗性蛋白 At4g19050 | B. napus | CDX78917 | 131.1 | 110 | |
| CIV_2 | 130 | 假定疾病抗性蛋白 At4g19050 | B. napus | CDX78917 | 131.1 | 89 | |
| CIV_3 | 100 | 热激蛋白 70 kDa 蛋白 14 样 | B. napus | XP_013748865 | 89.9 | 113 | |
| CIV_4 | 90 | 真核延伸因子 2 细胞分裂控制蛋白 48 同源物 A | B. napus B. napus | CDX90241 CDY41316.1 | 89.5 89.5 | 111 197 | |
| CIV_5 | 85 | 热激蛋白 90-2 样 | B. rapa | XP_009132342 | 79.8 | 172 | |
| CIV_6 | 80 | 苏氨酸—tRNA 连接酶 甘氨酸—tRNA 连接酶 | B. oleracea B. napus | XP_013599115 CDY43195 | 81.5 80.8 | 110 88 | |
| CIV_7 | 70 | 70 kDa 热激蛋白 赖氨酸—tRNA 连接酶样 | B. oleracea B. napus | XP_013685267 XP_013747530 | 67.8 69.9 | 230 150 | |
| CIV_8 | 65 | 黑芥子酶 天冬氨酸—tRNA 连接酶 2 天冬酰胺—tRNA 连接酶 1 | B. napus B. napus B. napus | ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126 | 60.6 61.6 63.5 | 183 141 153 | |
| CIV_9 | 60 | 黑芥子酶 | B. napus | ABQ42337 | 60.6 | 164 | |
| CIV_10 | 55 | S-腺苷高半胱氨酸水解酶 2 样 | B. rapa | XP_009135865 | 53.1 | 139 | |
| CIV_11 | 55 | 延伸因子 1-α 1 样 | B. oleracea | XP_013586115 | 51.9 | 161 | |
| CIV_12 | 50 | 胱氨酸裂解酶 CORI3 样 | B. napus | XP_013653143 | 48.1 | 237 | |
| CIV_13 | 44 | 胱氨酸裂解酶 CORI3 样 | B. rapa | XP_009108611 | 48.3 | 213 | |
| CIV_14 | 38 | 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 | B. rapa | XP_009115993 | 38.4 | 226 | |
| CIV_15 | 45 | 胱氨酸裂解酶 CORI3 样 | B. rapa | XP_009108611 | 48.3 | 219 | |
| CIV_16 | 45 | 胱氨酸裂解酶 CORI3 | B. rapa | CDY69765 | 46.9 | 209 | |
| CIV_17 | 38 | 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 | B. rapa | XP_009115993 | 38.4 | 124 | |
| CIV_18 | 18 | 肽基脯氨酰顺反异构酶 CYP18-3 样 | B. napus | XP_009101932 | 18.3 | 128 | |
| CIV_19 | 45 | 胱氨酸裂解酶 CORI3 样 | B. rapa | XP_009108611 | 48.3 | 177 | |
表3：复合物IV中鉴定出的蛋白质组分。 通过3D-PAGE分离后，采用MALDI-TOF质谱分析，在tRNA结合复合物中鉴定出多种tRNA连接酶及其他蛋白质。
讨论
韧皮部是一个备受关注的结构，因为它是光合同化物的主要运输通道，同时也对植物不同部位之间的长距离信号传递至关重要9,20,34,35。除了小分子外，蛋白质和RNA等大分子也被证实参与韧皮部的维持和信号传导过程4,7,8。由于大多数植物物种的韧皮部样本难以获取，对其成分的分析受到限制。昆虫口针法虽然应用广泛，但实验操作复杂，且获得的韧皮部样品量极微11。一种较为简便的韧皮部取样方法是EDTA促进的渗出法12。EDTA可螯合钙等二价离子，从而防止P蛋白和胼胝质堵塞筛板。该方法操作简便，但容易受到受损细胞污染，且样品被稀释。此外，EDTA对二价离子的去除可能导致原有复合物的解体。然而，该方法适用于包括模式植物A. thaliana在内的多种物种15。韧皮部汁液的自发渗出仅存在于少数植物物种中，且该方法具有侵入性，会造成植物组织的显著损伤10。我们近期已将B. napus确立为研究长距离运输的模式物种4,8,20。在此物种中，可通过微小切口采集韧皮部汁液，从而减少创伤效应和污染来源。
近年来，利用不同的取样技术，已对多种植物韧皮部样品的蛋白质组进行了研究7,8,17,36,37,38,39。在这些蛋白质组研究中，蛋白质是在变性条件下提取并沉淀的，因此无法推断在天然状态下存在的蛋白质:蛋白质以及蛋白质:核酸相互作用。共免疫沉淀（CoIP）和印迹结合实验表明，南瓜韧皮部汁液中可能存在一种主要的核糖核蛋白复合物40，但尚未证实韧皮部系统内天然条件下是否存在任何大分子复合物。
由 Schägger 等人等26提出的蓝色天然 PAGE（BN-PAGE）结合后续的高分辨率凝胶电泳步骤，能够实现对大型蛋白质复合物中各个组分的分离。我们近期通过对天然 B. napus 韧皮部渗出液进行 3D-PAGE 分析，证明了在韧皮部样品中存在多种高分子量的蛋白质:蛋白质及核糖核蛋白（RNP）复合物，并且具有酶活性4。尽管存在其他分离蛋白质复合物以及如 RNP 类复合物的方法，例如尺寸排阻色谱法，但在分辨率方面仍不及 BN-PAGE。此外，为了获得合理的复合物分离质量，尺寸排阻色谱柱的基质必须根据所研究复合物的总体分子量进行调整。因此，分析不同大小的复合物将需要不同类型的色谱柱，这成本较高，且无法达到 BN-PAGE 所具备的高聚焦能力。
分析来自 B. napus 的复合物的关键步骤包括用作起始材料的韧皮部汁液总量。至少需要 600 µL 的韧皮部样品，这些样品可从五株充分浇水的植株中获得。对于 3D-PAGE 和 BN 印迹杂交，必须使用足量的韧皮部样品开始最初的 BN 胶电泳。为此，需将韧皮部样品浓缩，直至每个加样孔可上样 20 至 30 µg 蛋白质，并且同一样品至少需设置三个平行重复。浓度过低或过高均会降低复合物的检测效果（图 3）。韧皮部样品需在冰上收集至离心管中，并应冷冻保存以备后续使用，以避免蛋白质降解和周转。所有已分析的韧皮部蛋白质组中均发现存在蛋白酶抑制剂，但也在 B. napus 的韧皮部中报道存在完全活性的蛋白酶体4。此外，韧皮部样品的体积和成分取决于采样时间点和环境条件10。因此，必须注意在每天相同时间、相似条件下进行采集。胁迫处理（例如 干旱）会减少可采集到的韧皮部汁液量。通过质谱鉴定单个蛋白质时，必须全程佩戴手套以最大限度减少角蛋白污染。角蛋白会在质谱分析过程中产生额外信号，干扰蛋白质的鉴定。以较高电压或在室温下运行 BN-PAGE 可能导致凝胶发热，从而引起脆弱复合物的解离。
本文介绍的方案适用于蛋白质：蛋白质复合物的分析。我们还表明，该方案可平行用于检测复合物中包含的特定RNA。为实现这一目标，我们近期引入了一种BN Northern印迹杂交方案4。RNA容易受到RNase污染的降解。为减少此类降解，应使用经DEPC处理的水。
该方法的主要局限性包括通过BN-PAGE分离的蛋白质复合物的分子量估算，因为其迁移行为取决于复合物的大小、形状，甚至翻译后修饰状态31,41由于核酸对迁移行为的影响，RNP复合物的大小估计更为复杂。同样无法避免的是，相同大小的复合物可能共迁移形成单一的条带，这可能导致对复合物组成的错误推断。因此，有必要利用互补的技术验证所观察到的相互作用， 例如 通过功能检测4, 可能是必要的。此外，仅微弱或瞬时结合于大分子复合物的蛋白质可能在所用的BN缓冲液中丢失。为避免此问题，可对样品进行交联处理，但这可能引入假象或阻碍蛋白质鉴定；或者可优化缓冲液条件。
与传统的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）不同，尿素-PAGE 与 SDS-PAGE 的结合可根据疏水性和分子量进行分离，而非等电点（pI）和分子量28，且不受限于特定 pI 范围的蛋白质分离。与传统二维电泳类似，分离后的蛋白质以单个斑点形式可见，但这些斑点分布于一条对角线上4,28（图5，图6）。疏水性更强的蛋白质出现在该对角线上方的斑点中，而亲水性更强的蛋白质则位于对角线下方28。本方案所使用的聚丙烯酰胺浓度可有效分离分子量在 25 至 80 kDa 之间的蛋白质。若需分离更小或更大的蛋白质，可在第三维中调整聚丙烯酰胺浓度或使用梯度凝胶。通过三维电泳（3D-PAGE）分离的复合物 IV 组分（图3，图6）被切下后进行胰蛋白酶消化，并通过质谱分析，结果鉴定出多种 tRNA 连接酶。其他复合物的组分最近已有报道4。我们的 3D-PAGE 技术实现了分子量相近的不同连接酶的分离，包括天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸和甘氨酸连接酶（表3）。利用甲硫氨酸 tRNA 特异性探针，我们能够检测到复合物 IV 中可能结合的 tRNA，但所用探针无法区分是全长 tRNA 还是 tRNA 片段存在于该复合物中。为验证核酸是否真正结合于复合物内部而非共迁移，可使用蛋白酶消化后的韧皮汁液样品作为合适的迁移对照。
早先有人推测，蛋白质翻译可能在韧皮部筛管内发生，因为在韧皮部样品中已检测到几乎完整的核糖体组分以及延伸因子4,7。我们发现的tRNA及tRNA连接酶似乎支持这一观点。然而，已在南瓜韧皮部样品中发现的tRNA片段被证实是翻译的强效抑制剂42，且功能性核糖体似乎并不存在4，这表明翻译过程可能无法进行。
综上所述，本文所展示的实验方案能够从韧皮部样品中分离天然的蛋白质-蛋白质复合物甚至核糖核蛋白（RNP）复合物，并以高分辨率分离和鉴定其各个组分。该方法的应用有助于在韧皮部样品中发现新的蛋白质和RNP复合物，从而揭示这一高度特化的植物区室中的新功能。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Jennifer Deke 和 Urszula Zarzenska 提供的科学支持。本工作获得了欧洲委员会第七个框架计划内职业整合资助（CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734）、汉堡州研究资助项目（Landesforschungsförderung Hamburg）LFF-GK06“DELIGRAH”以及德国研究基金会（DFG）资助项目（DFG KE 856_6-1）对 JK 的经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 反应管 | Eppendorf | 30120086 | |
| SDS-PAGE 10 孔梳，厚度 1 mm | BioRad | 1653359 | |
| 2-丙醇 | AppliChem | 131090 | |
| 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（29:1） | BioRad | 1610156 | |
| 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（37.5:1） | BioRad | 1610158 | |
| 96% 乙醇 | Carl Roth | P075 | |
| 乙酸 | Carl Roth | 6755 | |
| 琼脂糖 | Lonza | 50004 | |
| 硫酸铝-(14-18)-水合物 | AppliChem | 141101 | |
| 过硫酸铵（APS） | Carl Roth | 9592.3 | |
| Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
| 硼酸 | AppliChem | A2940 | |
| 溴酚蓝 | AppliChem | A2331 | |
| 离心浓缩器 例如 Vivaspin 500（截留分子量 10 kDa） | Sartorius | VS0102 | |
| 化学发光核酸检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
| 层析纸 例如 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
| CoolBox M30 系统 | Biocision | BCS-133 | |
| 考马斯亮蓝 G-250 | AppliChem | A3480 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | AppliChem | A0881 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | AppliChem | A1101 | |
| DNase I | AppliChem | A3778 | |
| 无水乙醇 | AppliChem | A3693 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | AppliChem | A1103 | |
| 凝胶成像系统 例如 Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
| 甘油 | AppliChem | 141339 | |
| 甘氨酸 | AppliChem | 131340 | |
| 加热块 TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
| 杂交炉 例如 GFL 杂交培养箱 7601 | GFL | 7601 | |
| 皮下注射针头（0.8 mm） | B Braun | 4658309 | |
| IPG 胶梳，厚度 1 mm | BioRad | 1653367 | |
| RNA 标记 例如 Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
| 天然梯度胶 例如 Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris 蛋白胶 | Invitrogen | BN1002BOX | |
| 尼龙膜 例如 Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
| 正磷酸 | Carl Roth | 6366.1 | |
| PageRuler 预染蛋白 Marker | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| 电泳仪电源（用于凝胶电泳 EPS） | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | 可从 GE Healthcare 购得 |
| RNA 纯化试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| 半干转印仪 例如 Fastblot 43B 半干转印仪 | Biometra | 846-015-100 | |
| 氯化钠（NaCl） | AppliChem | A1149 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | AppliChem | 142363 | |
| cDNA 合成 例如 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| 四甲基乙二胺（TEMED） | AppliChem | A1148 | |
| Tricine | AppliChem | A3954 | |
| Tris | AppliChem | A1086 | |
| 柠檬酸三钠二水合物 | AppliChem | A3901 | |
| TRIzol 试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| ULTRAhyb 超高灵敏度杂交缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
| 尿素 | AppliChem | A1360 | |
| 紫外交联仪 例如 Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | 来自 Fisher Scientific |
| 垂直电泳装置 例如 XCell SureLock Mini-Cell 或 Mini-Protean III 系统 | Thermo Fisher Scientific 或 BioRad | EI0001 或 1658004 | |
| 擦拭纸 例如 KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |
参考文献
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重印与许可
