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方法文章

探索鸟类模型中器官形成的早期和晚期阶段的两步法：胸腺与甲状旁腺器官发生范式

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DOI：

10.3791/57114

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2018年6月17日

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

本文内容

摘要

本文结合新型技术，对经典的鹌鹑-鸡嵌合体系统进行了更新，以研究器官形成。 体外 和 在卵内 实验步骤

摘要

鸟类胚胎作为实验模型，在发育生物学的开创性发现中具有极其重要的地位。在多种研究方法中，鹌鹑-鸡嵌合体的构建以及利用绒毛尿囊膜（CAM）维持异位组织发育的技术可追溯到上个世纪。如今，将这些经典技术与近期的体外（in vitro）方法相结合，为深入探索器官形成提供了新的前景。

本文介绍了一种两步法，用于研究器官发生早期和晚期阶段。简言之，从鹌鹑胚胎中分离出包含器官预定区域的胚胎组织并进行培养 体外 在器官型系统中（最长可达48小时）。培养的组织随后移植到鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）上。经过10天培养后 在卵内 发育过程中，通过移植组织获得完全成形的器官。该方法还允许通过定期给予药理学试剂以及在整个过程中对组织进行遗传操作，来调控信号通路 体外 和 在卵内 发育阶段。此外，可在任意时间段收集正在发育的组织，以分析其基因表达谱（采用定量PCR（qPCR）、微阵列） 等等。）以及形态学（通过常规组织学和免疫组织化学评估）。

所述实验方法可作为一种工具，用于追踪禽类胚胎外器官的形成过程，从器官发生的早期阶段直至完全形成且具有功能的器官。

引言

禽类胚胎已被广泛用于重要的发育生物学研究中。禽类模型的主要优势包括可以打开蛋壳、较容易接触到胚胎，以及能够进行显微操作。一些应用实例包括经典的鹌鹑-鸡嵌合体系统用于研究细胞命运1，向胚胎施加特定生长因子2，以及在绒毛尿囊膜（CAM）上诱导异位细胞结构的形成1,3,4。

为了深入了解器官形成的各个不同阶段，我们近期开发了一种将移植技术与胚胎组织的体外操作相结合的方法5。这种两步法能够区分并研究器官发生的早期和晚期阶段，而这些阶段通常因组织间高度动态且复杂的相互作用而难以观察2。此外，由于缺乏合适的组织特异性标记物，基因修饰动物模型的应用也常常受到限制6。这种新型的两步法在很大程度上克服了上述局限性。

为了研究器官形成的早期阶段，第一步是分离包含预定器官原基的鹌鹑胚胎区域，并将其在体外培养 体外 在48小时内使用器官型培养系统。在此期间，可通过向培养基中添加药物，对特定信号通路进行药理学调控。5,7此外，可在培养的任何阶段收集组织样本。 体外 生长并检测基因表达（使用qPCR、微阵列等方法） 等等。).

第二步，将培养48小时的组织移植到鸡胚胚胎第8天（cE8）（Hamburger和Hamilton（HH）分期33-35期）的绒毛尿囊膜（CAM）上8CAM 充当营养物质的血管供应源，并允许气体交换1,3,4 移植组织的发育 在卵内 更长时间。该实验步骤特别适用于研究器官发生的晚期阶段，因为经过10天培养后即可获得结构完整的器官。 在卵内 发育5,9,10,11形态学分析可通过常规组织学方法简便完成，以确认器官的正常形成；通过使用物种特异性抗体进行免疫组织化学染色，可鉴定细胞的供体来源。即，单克隆抗体Quail PeriNuclear（QCPN）。在CAM培养期间，移植物也可在药物试剂存在下生长，并可在器官发生的任何发育阶段收集，以评估器官发生进程。

本文深入描述的两步法已在Figueiredo et al.5的研究中用于探索鸟类甲状旁腺/胸腺共同原基的发育过程。因此，以下将介绍胸腺和甲状旁腺在器官发生过程中所涉及的胚胎区域及发育阶段的固有特性。

胸腺和甲状旁腺的上皮组织虽然功能不同，但均起源于咽囊（pharyngeal pouches, PP）的内胚层12。在鸟类中，这些器官的上皮组织起源于第三和第四咽囊内胚层（3/4PP）12；而在哺乳动物中，胸腺上皮来源于第三咽囊（3PP），甲状旁腺上皮在小鼠中来源于3PP，在人类中则来源于3PP和3/4PP13,14。

这些器官发育的最早阶段之一是在共同的原基中出现独立的胸腺和甲状旁腺区域。在鸡中，这些区域可通过以下方式识别： 原位 在E4.5时期使用特异性分子标记进行杂交15随着发育的进行，这些器官原基逐渐特化并从咽部分离，同时由神经嵴来源的细胞形成一层薄的间充质囊膜将其包裹（E5；HH 27期）。随后，胸腺上皮被造血祖细胞定植（E6.5；HH 30期）。12.

与经典的鹌鹑-鸡研究1,12类似，这种两步法在研究造血/淋巴器官（即胸腺5）的形成过程中尤为有用。由于在造血祖细胞定植之前，已将带有器官原基的鹌鹑外植体移植到鸡胚胎中，因此会形成嵌合胸腺，其中鸡源性循环祖细胞浸润至鹌鹑胸腺上皮组织中。因此，该方法是研究造血细胞在禽类造血/淋巴系统发育过程中所起作用的有效工具。

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方案

所有这些实验均遵循里斯本医学院的动物护理与伦理指南。

1. 孵化受精的鹌鹑和鸡卵

  1. 将受精的日本鹌鹑（Coturnix coturnix japonica）卵和鸡（Gallus gallus）卵分别在38 °C的湿润培养箱中孵化3天和8天。
    1. 将卵的大头（气室端）朝上放置于38 °C的湿润培养箱中。
    2. 本实验建议使用约20枚日本鹌鹑卵和40枚鸡蛋。
      注意：首次建立该实验流程时，建议将上述卵的数量加倍。

2. 分离含有胸腺和甲状旁腺原基预定区域的鹌鹑胚胎组织

注意：使用水平层流罩以及灭菌的器械和材料，在无菌条件下进行卵子操作步骤。

  1. 准备一个大硼硅酸盐玻璃碗，盛装约四分之三满的冷磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。
  2. 孵化3天后，轻敲鹌鹑蛋壳，并用弯头剪刀在其钝端对侧剪出一个圆形开口。小心移除壳片，将胚胎转移至盛有冷PBS的玻璃碗中。
  3. 用精细镊子固定E3期（qE3，相当于鸡HH 21期）的鹌鹑胚胎，用弯头剪刀在包裹卵黄的卵黄膜上剪开一个小口。继续沿胚外血管周缘的外部剪开卵黄膜，环绕一周。
  4. 用细镊子将胚胎转移至一个盛有约四分之三冷PBS的小烧杯中，彻底清洗残留的卵黄。
  5. 使用移液器将胚胎转移至带有黑色底面的100 mm玻璃培养皿中（参见 材料表) 加入 10 mL 冷的 PBS。
  6. 将培养皿置于体视显微镜下。
    注意：从此时起，在体视显微镜下进行显微外科操作，以实现逐步放大的观察。建议采用体视显微镜内置或光纤传导的LED光源，因其产热较少。
  7. 用细的昆虫针将胚胎固定在培养皿底部。在胚胎外区域用四根针形成一个正方形。
  8. 用精细镊子去除头区的胚外膜，并在该处放置第五根针。
    注意：如果胚胎位置正确，则耳泡、心脏管和第1个st, 2nd，以及 3rd 咽弓（PAs）应可见。
  9. 解剖感兴趣的胚胎区域， 即，3rd 和 4th 咽弓区（3/4PAR），使用Wecker眼科剪刀。
    1. 沿胚胎轴方向，在体节/神经管区域与咽囊之间平行进行纵向切割。
    2. 用剪刀剪除腹侧的心管。保持剪刀位置不变，旋转培养皿以根据切割方向重新调整胚胎的位置。
    3. 在两者之间切割nd 和 3rd PAs 及其下方的 4th PA.
    4. 用细镊子将剩余的膜从3/4PAR上剥离。
  10. 用2 mL无菌塑料移液管吸出分离的组织（3/4PAR），转移至一个盛有冷PBS、装至3/4满的玻璃培养皿中。
    注意：此后，组织可进行培养 体外 最长可保存48小时，或立即移植至E8期鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）上。
  11. 在准备过程中，将装有分离的3/4PAR的玻璃培养皿置于冰上。 体外 检测

3. 体外 器官型培养实验：含有胸腺和甲状旁腺原基区域的胚胎组织培养

  1. 使用添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基制备培养液。
    注意：可将可溶性药理学试剂加入培养基中（例如 LY-411,575（Ly）、二苯并氮䓬或环巴胺和维莫德吉），分别用于抑制 Notch 和 Hedgehog（Hh）信号通路。在本实验中，为抑制 3/4PAR 中的 Notch 信号通路，使用 50–200 nM 的 Ly 或 5–15 µM 的二苯并氮䓬；为抑制 3/4PAR 中的 Hh 信号通路，使用 20 µM 的环巴胺或 10 µM 的维莫德吉。5.
  2. 制备 体外 在6孔板中培养3/4PP外植体。
    1. 在6孔板的一个孔中加入5 mL培养基。放入一个24 mm聚碳酸酯膜插入式培养小室（参见 材料表用细镊子将盖玻片轻轻盖在孔板上。
    2. 在体视显微镜下，使用移植匙（或刮铲）和细镊子轻轻滑动，将3/4PAR外植体从玻璃培养皿转移至膜表面。将外植体腹侧朝上、背侧与膜接触放置。每个膜插件上最多放置七个外植体。进入步骤3.4。
  3. 或者，将组织块在漂浮式膜滤器中进行培养。
    1. 准备一个35 mm的培养皿，加入5 mL培养基。借助细镊子，将一张膜滤器漂浮于液面上（参见 材料表）并保持干燥表面与空气接触。
    2. 在体视显微镜下，借助移植匙（或刮铲）和细镊子，轻柔滑动将3/4PAR外植体从玻璃培养皿转移至膜滤器上。将外植体腹侧朝上、背侧与膜接触放置。每张膜滤器上可放置最多8个外植体。
  4. 将步骤 3.2 和 3.3 中制备的外植体小心置于含 5% CO₂、37 °C 的湿润培养箱中2.
  5. 在孵育48小时后，从培养箱中取出6孔板和35 mm培养皿。
    1. 从6孔板的膜插件中收集培养的外植体。
      1. 向膜插件中加入室温（RT）的 PBS。
      2. 使用2 mL无菌塑料移液管用力冲洗，将外植体从膜上分离。
      3. 使用刮铲和细镊子将培养的外植体转移至一个盛有3/4体积PBS、室温放置的玻璃培养皿中。
    2. 类似地，从35 mm培养皿中漂浮的膜滤器上收集培养的外植体。
      1. 用细镊子将膜滤器转移至盛有PBS的新35 mm培养皿中，于室温下放置。
      2. 使用2 mL无菌塑料移液管通过剧烈吹打将外植体从膜滤器上分离。
      3. 借助细镊子，在确认外植体已完全脱离膜滤器后，将不含外植体的膜滤器移出。
      4. 使用刮铲和细镊子将外植体转移至盛有PBS的玻璃培养皿中，于室温下放置。
  6. 用刮勺将培养的外植体转移至1 mL总RNA提取试剂中，用于基因表达研究。
    警告： 接触该试剂（参见 材料表可能对健康造成严重危害。请佩戴适当的护目镜、防护服和手套。遵循制造商提供的操作说明并阅读安全数据表。
  7. 或者，将培养的组织移植到E8期鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）上，然后进行步骤4。

4. 尿囊绒毛膜（CAM）的制备

  1. 从孵育器中取出具有8天胚胎发育期的鸡卵。
    注意：卵在加湿孵育器中以气室朝上、38 °C的条件孵育。
  2. 用透明胶带覆盖卵的钝端，以防止蛋壳碎片落入气室内。轻敲蛋壳，并使用弯头剪刀在蛋壳上剪出一个环形开口。此时应可见气室。
  3. 用精细镊子小心去除气室上的白色膜。随后即可观察到绒毛尿囊膜（CAM），并可用于异位组织移植。
    注意：在移植前或移植后，均不得使用PBS润湿CAM，因为PBS会促进移植物滑动和错位。若膜已干燥，则应弃用该卵。

5. 将培养的外植体移植到CAM上

  1. 使用持针器夹持显微手术刀，在CAM的较小血管中制造微小的血管损伤/伤口。
    注意：若出血过多，可用巴斯德移液管的尖端通过毛细作用吸除血液。
  2. 使用刮铲和细镊子将培养的外植体转移至CAM的损伤区域。
  3. 裁剪一张略大于外植体的滤纸，覆盖在外植体上方。
    注意：滤纸有助于在外植体于CAM中发育后追踪其位置。此外，如有需要，可在in ovo发育期间通过滤纸每日递送药物（见步骤5.6）。
  4. 用透明塑料胶带封闭蛋壳窗口，并使用炭笔标记编号。
    注意：塑料胶带可在孵育期间防止胚胎脱水。
  5. 将操作后的鸡蛋置于38 °C的湿润孵育箱中孵育10天。随后进入步骤6。
  6. 可选步骤：孵育期间每日给药。
    1. 为接触滤纸，可部分揭开塑料胶带。将100 µL药物溶液逐滴加至滤纸表面。重新密封窗口，并将鸡蛋放回38 °C的湿润孵育箱中。
      注意：在本实验中，20 µM浓度的环杷明可抑制in ovo发育过程中的Hh信号通路5。

6. 在CAM上孵育10天后的异位器官形成 在卵内 发育

  1. 孵育10天后，将鸡蛋从孵育箱中取出，并小心移除塑料胶带。
  2. 使用弯头剪刀在滤膜区域周围剪下CAM，将带有滤纸的CAM来源外植体转移至一个约四分之三体积盛有冷PBS的小玻璃皿中。
  3. 借助细镊子将CAM来源外植体转移至一个底部为黑色的100 mm培养皿中，内含10 mL PBS。使用Wecker眼科剪和细镊子轻轻去除滤纸及多余的膜组织。
  4. 用移液铲将CAM外植体转移至固定液（含3.7%多聚甲醛的PBS）中。使用大剪刀在胚胎颈部区域进行精确剪切，无需将鸡胚从蛋中取出即可实施安乐死。
  5. 通过常规组织学和免疫组织化学方法，评估CAM来源外植体石蜡切片中的器官形成情况。

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结果

上述方案详细描述了一种可用于研究器官发生早期和晚期阶段的方法，这些阶段通常受限于复杂的细胞和分子相互作用。

该方法先前已在 Figueiredo et al.5 中用于揭示 Notch 和 Hh 信号通路在鸟类甲状旁腺/胸腺共同原基发育中的作用。

此处展示了新的结果 图1 和 图2 使用相同的器官发生模型。 图1A 展示了用于研究胸腺和甲状旁腺早期发育阶段的实验设计。分离并培养了包含预定器官原基（3/4PAR）的鹌鹑胚胎区域 体外 在器官型系统中培养48小时。

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讨论

该方法成功的关键在于鸡卵和鹌鹑卵的质量。考虑到较长的孵化周期，特别是在in ovo检测过程中，高质量的鸡卵可显著提高实验结束时的胚胎存活率（可达90%）。为确保卵源质量，应从不同供应商处测试卵样，将未经操作的卵进行长时间孵化（最长至16-17天），并观察其发育情况。若超过80%的胚胎表现出正常发育，则可认定为高质量批次。此外，确保每一步孵化过程均能获得可重复且同步的发育阶段，对于最终获得可靠且具代表性的结果至关重要。由于蛋壳具有通透性，所有卵的孵化步骤均需在加湿环境中进行。为避免环境污染，可在实验中向PBS溶液添加抗生素（可选步骤）。

该方法首先分离鹌鹑器官原基，并在器官型培养系统中培养48小时。这一初始步骤此前已被用于研究胸腺和甲状旁腺的早期发育。5，如果考虑到检测的局限性，也可应用于其他器官。器官原基的小型外植体（小于3 mm）以及较短的培养时间 体外 建议进行孵育（最长48小时），以防止营养物质扩散效率降低以及组织干燥，这种情况通常在组织块达到较大尺寸时发生。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢António Cidadão、Isabel Alcobia和Leonor Parreira对稿件的审阅，感谢Padma Akkapeddi为视频提供解说，以及里斯本大学里斯本医学院发育组织学与生物学研究所组织学服务中心的Vitor Proa提供的技术支持。我们特别感谢里斯本大学里斯本医学院视听单元（Unidade de audiovisuais）的Paulo Caeiro和Hugo Silva在本视频制作过程中所表现出的卓越投入。我们感谢Leica Microsystems慷慨提供配备视频系统的体视显微镜，感谢Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. 提供鹌鹑受精卵。本研究由里斯本大学里斯本医学院（FMUL）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鸡受精卵（Gallus gallus）Pintobar，葡萄牙家禽养殖场 
鹌鹑受精卵（Coturnix coturnix）Interaves，葡萄牙鸟类养殖场 
15 mL 聚丙烯离心管Corning430052
50 mL 聚丙烯离心管Corning430290
60 × 20 mm 珀克斯培养皿Duran集团21 755 41
100 × 20 mm 珀克斯培养皿Duran集团21 755 48
聚碳酸酯膜插件 Corning341224 mm Transwell，带0.4 mm孔径聚碳酸酯膜插件 
膜滤器MilliporeDTTP013000.6 mm Isopore膜滤器
6孔细胞培养板Nunc，Thermo Fisher Scientific140675
培养皿，35 × 10 mmSigma-AldrichP5112 
珀克斯烧杯超市购买 
移液管Samco Scientific，Thermo Fisher Scientific2041S2 mL 塑料移液管
玻璃巴斯德移液管normax5426015
Whatman 定性滤纸Sigma-AldrichWHA1001090滤纸
透明塑料胶带超市购买 
细胞角蛋白（泛酸性和碱性，I型和II型细胞角蛋白），克隆Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
环巴胺水合物Sigma-AldrichC4116Hh信号通路药理学抑制剂
胎牛血清Invitrogen，Thermo Fisher Scientific标准FBS
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
青霉素-链霉素Invitrogen，Thermo Fisher Scientific15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）GIBCO，Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN抗体发育研究杂交瘤库QCPN
RPMI 1640培养基，含GlutaMAX补充剂 GIBCO，Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B硅胶弹性体1.1 kg套装ELKEM/SilmidRH141001KG用于制备培养皿底座
Stemolecule LY411575Stemgent04-0054Notch信号通路药理学抑制剂
TRIzol试剂Invitrogen，Thermo Fisher Scientific15596026总RNA提取试剂
Dumont #5镊子Fine Science Tools11251-30 细镊子
超精细弯头Bonn剪刀Fine Science Tools14085-08弯头剪刀
昆虫针 Fine Science Tools26001-30
微型刮勺 Fine Science Tools10087-12移植勺
微型细针（Minutien Pins）Fine Science Tools26002-20微型解剖刀
Moria镀镍针持Fine Science Tools26016-12持针器
Moria带孔勺Fine Science Tools10370-17捞取勺
Wecker眼科剪Fine Science Tools15010-11
相机Leica Microsystems MC170 HD
体视显微镜Leica Microsystems Leica M80
显微镜Leica Microsystems DM2500

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