深入了解小胶质细胞功能的努力因缺乏能够模拟成熟小胶质细胞特性的培养模型而受到阻碍 体内 小胶质细胞。本方案描述了一种分离与培养方法，旨在特定培养基条件下维持高度分支的成熟大鼠小胶质细胞的良好存活。
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本文内容
摘要
摘要
小胶质细胞占中枢神经系统（CNS）细胞总数的5–10%，因其在发育、稳态及疾病过程中的重要作用而日益受到关注。尽管巨噬细胞已被深入研究数十年，但作为CNS组织驻留型巨噬细胞的小胶质细胞，其特有特性在很大程度上仍不明确，部分原因在于体外培养难以重现成熟小胶质细胞的特性。本文介绍一种从成熟啮齿类动物脑组织中快速分离高纯度小胶质细胞的简便方法，并描述支持小胶质细胞长期高存活率的无血清培养条件。在该定义明确的培养体系中，小胶质细胞呈现出复杂的分支状突起并表现出动态的监视行为。我们展示了血清暴露对培养小胶质细胞的一些影响，并讨论了此类无血清培养体系与含血清培养体系以及体内小胶质细胞之间的比较 体内.
引言
作为中枢神经系统实质中的巨噬细胞，小胶质细胞与广泛的神经元环路和胶质细胞信号网络相互作用。它们通过突触修剪、凋亡细胞清除以及与神经元突起的短暂接触，在大脑的发育和稳态维持中发挥关键作用1,2。小胶质细胞是神经系统损伤的早期响应者，会将其细长的突起延伸至损伤部位，协调炎症反应并限制出血3,4。在急性和慢性中枢神经系统损伤中，小胶质细胞的形态和功能改变普遍存在，并且在多种疾病状态下表现出形态、定位以及炎症介质表达的异常1。人类遗传学研究表明，在完整的中枢神经系统中，那些改变神经退行性疾病风险的基因突变通常主要或仅由小胶质细胞表达，提示小胶质细胞在疾病发生或进展中具有关键作用5。鉴于其在损伤和疾病中的突出作用，深入理解小胶质细胞生物学已成为开发新型治疗策略的优先方向。
小胶质细胞生物学领域的许多重要进展，源于对其他巨噬细胞群体研究中所发现的技术和机制的推演，包括培养方法、基因表达谱以及功能/形态状态的定义。尽管在中枢神经系统（CNS）环境中，普遍性的巨噬细胞功能常表现出出人意料的特点，但小胶质细胞本身具有高度特化性，呈现出分支状形态和独特的基因表达特征，使其区别于其他组织中的巨噬细胞6。小胶质细胞的谱系与其他大多数组织巨噬细胞不同；它们在胚胎早期原始造血阶段即定植于中枢神经系统，并在整个生命过程中自我更新，不依赖于定型造血的贡献7。成年小胶质细胞完整的成熟基因表达特征直到出生后第二周才完全建立8。周围组织提供的环境信号在决定组织特异性巨噬细胞特征方面起着重要作用6，在中枢神经系统中，这种环境特征还包括血脑屏障限制了血液来源因子的接触9。
完全理解小胶质细胞对中枢神经系统稳态及疾病作用的一个障碍，在于难以重现成熟小胶质细胞所具有的特化特性 体内 使用纯化的细胞 体外 已开发出多种方法用于分离和培养完整的小胶质细胞，但大多数方法依赖血清来维持细胞存活。我们已证明，添加血清——一种含有大量生物活性分子且本身具有批次间差异的试剂——在小胶质细胞操作中尤为成问题，因其可促进细胞呈现阿米巴样形态、增殖增加以及吞噬作用增强9 常被观察到 体内 当血脑屏障受损后，小胶质细胞暴露于血液来源的因子时。根据这些指标，暴露于血清的细胞类似于损伤或疾病状态下的小胶质细胞，但当小胶质细胞在含有CSF-1（或IL-34）、TGF-β、胆固醇和亚硒酸盐的定义明确的培养基中培养时，此类改变会减少。
本方案详细介绍了在无血清条件下培养幼年大鼠小胶质细胞的方法，相关内容见于近期发表的研究9。该方案已针对出生后第21至30天（P21–P30）的大鼠进行了优化，但也可调整用于从任意年龄的大鼠和小鼠中分离小胶质细胞，尽管细胞得率和总体活力会因动物种类和年龄而异。当使用稍不成熟的小胶质细胞（约P9）时，可获得最大得率和最佳活力，随着动物成熟，得率和活力逐渐下降至相对较低水平。小胶质细胞也可从小鼠中分离，但我们发现，在无血清培养条件下，与小鼠细胞相比，大鼠细胞的得率更高、活力更强，且分支形态更为复杂。本方案尚未评估年龄超过P50的动物。本免疫筛选分离方法已优化，旨在最小化分离过程中小胶质细胞转录谱的变化，并最大程度提高细胞后续的存活率。通过使用这些技术与培养基配方，可维持高活力的原代培养数周时间。在此条件下培养的小胶质细胞呈现高度分支的形态，具有突起快速伸展与回缩的特点，并且增殖速率相对较低。我们强调了血清暴露对这些特性的影响，并讨论了该方法相较于其他方法的优势与局限性。
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方案
涉及啮齿类动物的所有操作均符合斯坦福大学指南，该指南遵循国家和州的法律法规及政策。所有动物操作均经斯坦福大学实验动物护理与使用委员会批准。
注意：所有溶液和缓冲液的组成均在材料表中提供。
1. 准备用于CD11b免疫平皿筛选的培养皿（第0天）
注意：每1-2个幼年大鼠脑准备1个免疫吸附皿。
- 向一个15 cm的培养皿中加入25 mL的50 mM Tris（pH 9.5）溶液。
- 向培养皿中加入羊抗小鼠IgG（H+L链），使其终浓度为6 µg/mL。轻轻旋转培养皿以均匀分布。
- 将培养皿在37 °C下孵育1–3小时。
- 用DPBS++（含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS））清洗培养皿三次，然后更换为含有1 µg/mL OX42抗体的包被缓冲液。将培养皿在室温下平放过夜。
2. 组织采集（第1天）
注意：本方案应耗时约 3 - 4 小时。
- 开始前，确保所有溶液均为无菌且已预冷至冰上。将所有器械置于冰上预冷，并在使用前用乙醇消毒。
- 按照相应的监管程序，通过二氧化碳窒息法处死一只幼年实验大鼠。
注意：也可使用致死剂量的氯胺酮/赛拉嗪（24 mg/mL 氯胺酮与 2.4 mg/mL 赛拉嗪混合液，剂量为 100–200 µL）处死更年幼的动物。若动物年龄小于14天，则必须使用氯胺酮/赛拉嗪。若同时处理多只动物，应从一只动物中取出组织后立即放入预冷的含钙镁DPBS++中并置于冰上，再继续处理下一只动物。 - 轻捏后肢足掌，确认动物完全无反应后方可继续操作。
- 使用27½-G针头，以10–30 mL冰冻灌注缓冲液对动物进行经心脏灌注，直至流出液体变澄清。
注意：灌注缓冲液的体积根据动物的大小和年龄而有所不同。 - 灌注完成后立即取下动物头部。从脊髓端开始，用解剖剪在两侧剪断枕骨髁，注意不要损伤脑组织。两侧剪切完成后，沿一侧顶骨和额骨向鼻骨方向纵向剪开颅骨。用镊子小心掀开颅骨顶部，迅速取出脑组织（或感兴趣的中枢神经系统结构），并放入预冷的含钙镁DPBS++中置于冰上。
- 对所有剩余动物重复上述步骤。
注意：后续所有操作均应在超净工作台内，在严格无菌条件下进行。
3. 机械解离（第1天）
- 在收集完所有脑组织后，将一个脑组织置于冰上的培养皿中，用冰冷的手术刀将其切成 1 mm3 大小的组织块，转移至含有 5 - 7 mL 冰冷匀浆缓冲液的预冷玻璃匀浆器中。每次仅处理一个脑组织。
- 使用松配合的玻璃匀浆器，以 10 - 20 次轻柔且不完全的上下研磨动作解离组织。注意不要直接在匀浆器底部压碎组织，而是通过研杵与匀浆器壁之间的间隙推动组织实现解离。
- 小心取出研杵，避免引入气泡。待未充分解离的组织块沉降至匀浆器底部后，将上清液转移至新的预冷 50 mL 锥形管中。
- 补充等体积的新鲜匀浆缓冲液，重复步骤 3.2 和 3.3，共进行 3 - 4 轮，或直至所有组织完全解离。对每个脑组织重复上述操作。
4. 髓鞘去除（第1天）
注意：髓鞘去除法用于从出生后12天以上的动物中分离小胶质细胞。
- 使用 25 mL 移液管测量 50 mL 锥形管中细胞悬液的体积，然后加入预冷的douncing缓冲液，将总体积调整至 33.5 mL。
- 向细胞悬液中加入 10 mL 髓鞘分离缓冲液（MSB），通过反复倒置管子充分混匀。最终 MSB 的浓度为 23%，总体积为 43.5 mL。
- 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，使用慢速减速模式。
注意：离心机减速过程应持续约 1.5 至 2 分钟。此步骤将形成上层的髓鞘和死亡细胞碎片、较为浑浊的上清液，以及富含活细胞的小量沉淀。 - 用移液管小心移除上层的髓鞘/碎片及上清液。在去除上层物质时需格外注意，尽可能彻底清除。
- 将细胞沉淀重悬于 12 mL 的平皿缓冲液中。轻柔吹打细胞悬液，以分散可能存在的任何细胞团块。
5. 免疫吸附（第1天）
- 将细胞悬液通过70-µm细胞筛，以去除大块碎片或细胞团块。
- 用DPBS++将OX42包被的贴壁培养皿清洗三次。每次清洗之间切勿让培养皿完全干燥。
- 倒掉最后一次DPBS++清洗液，将过滤后的细胞悬液加入贴壁培养皿中。轻轻晃动培养皿以均匀分布细胞，然后在室温下将培养皿平放孵育20分钟，使细胞贴附。孵育时间不得超过20分钟，否则细胞将难以从培养皿中回收。
- 用DPBS++清洗贴壁培养皿10次，以去除未贴附的细胞。小胶质细胞会牢固地贴附在培养皿上，因此每次清洗时应轻轻晃动培养皿，确保去除其他非贴附细胞。
- 倒掉最后一次DPBS++清洗液，加入15 mL DPBS++和200 μL胰蛋白酶（1.25%储备液）。
- 在37 °C、10% CO2条件下孵育培养皿≤10分钟，进行胰蛋白酶消化。
注意：孵育时间不得超过10分钟，否则小胶质细胞将难以去除。 - 胰蛋白酶消化10分钟后，小胶质细胞仍会附着在培养皿上。倒掉胰蛋白酶/DPBS++溶液，用DPBS++轻轻清洗两次以去除胰蛋白酶，然后加入12 mL冰冻的微胶质细胞生长培养基（MGM）。
- 将贴壁培养皿置于冰上2分钟，以帮助减弱细胞与基质的相互作用，并确保培养皿保持水平，防止培养皿局部区域干燥。
- 使用10 mL移液器和高速移液控制器剧烈吹打，以从贴壁培养皿中回收细胞。用移液器的液体流在培养皿上画出16×16的网格，尽量去除所有细胞。
- 在20倍显微镜下检查细胞，确认细胞已从培养皿上脱离。在培养皿顶部标记仍有细胞附着的位置，并在这些区域重复吹打。
- 收集细胞悬液，每管分装3–4 mL上清液至15 mL锥形管中。在4 °C条件下以500 × g离心15分钟，使用慢速刹车。
注意：通过较小体积离心小胶质细胞可实现细胞的最大回收率。 - 吸除上清液，每管中留下0.5 mL MGM与细胞沉淀。
- 将每个沉淀重悬于剩余的MGM中，并合并所有管中的细胞。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 根据实验应用，按照第6–7步所述方法接种细胞。
- 在37 °C、10% CO2条件下培养细胞。
注意：定期更换培养基时，细胞可培养长达3–4周；若不更换培养基，可培养一周。
6. 点样包被组织培养板/盖玻片（第1天）
- 在24孔阴阳离子包被的组织培养板中心直接加入15 µL IV型胶原蛋白进行包被（详见材料表），于37 °C、10% CO2条件下孵育15分钟。
- 使用血细胞计数板计数后，将细胞用MGM培养基稀释至2.3 × 105/mL。吸除IV型胶原蛋白液滴，立即在该位置接种15 µL细胞悬液，使每点细胞数为3.5 × 103个。于37 °C、10% CO2条件下孵育5–10分钟，使细胞贴壁，随后轻柔地向孔中加入500 µL经CO2平衡的含TGF-β2、IL-34和胆固醇的生长培养基（TIC）。
- 若在盖玻片上接种，需先将无菌玻璃盖玻片置于含10 µg/mL多聚-D-赖氨酸（PDL）的H2O溶液中室温孵育1小时，用H2O洗涤3次，并在紫外灯下通风橱内晾干。盖玻片干燥后，按照步骤6.2所述方法在盖玻片上进行点种接种。
7. 用于RNA/蛋白质提取的铺板
- 第1天，用IV型胶原对24孔阴阳离子包被的组织培养板的整个区域进行包被，并孵育10分钟。 37 °C、10% CO 条件下孵育 1 小时2，然后移除并立即接种 3 - 5 x 104 孔/孔，在CO2 平衡的TIC培养基
- 第2天，在制备后的次日对每个孔进行50%的培养基更换。死亡细胞 tends to 聚集在孔的中央区域，因此应从此处吸取培养基。
- 每2至3天进行一次50%的培养基更换，以维持培养状态。若培养基更换会引入不必要的变量，细胞在不更换培养基的情况下可存活约1周，而定期维护条件下可存活超过3周。
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结果
本方案描述了一种从幼年大鼠中培养高纯度分支状小胶质细胞的方法。使用未成熟、围产期及成年动物也可获得类似结果，如下文所述。由于细胞分离过程常包含细微的操作差异，且细胞容易死亡，因此我们设置了质量控制检查点，以帮助判断各个步骤是否成功。在分离方案的多个步骤中，我们通常使用血细胞计数板对细胞悬液进行监测（图1A）。成功的分离每只幼年动物可获得 2.5 - 5 x 105 个细胞。P7 至 P15 阶段的动物每只可获得接近 5 x 105 个细胞，而从 P30 以上年龄动物中分离的细胞产量则接近每只 2.5 x 105 个细胞。除了在整个方案过程中监测总细胞数量外，评估分离细胞的整体健康状态也十分重要。然而，由于以本方法分离的小胶质细胞在培养初期呈圆形或双极形态，因此判断其状态可能存在困难。为此，我们提供了 P25 小胶质细胞在分离后前 6 天于 TIC 培养基以及含 10% 胎牛血清（FCS）的 TIC 培养基中培养的相差显微图像（
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讨论
由于小胶质细胞作为中枢神经系统的哨兵免疫细胞，对环境变化高度敏感；因此，在分离和培养过程中必须格外小心，以尽量减少细胞内的炎症反应8。本方案通过操作速度和温度控制来实现这一目标。尽可能将细胞保持在冰上或4 °C条件下可显著降低细胞活化，因此所有离心步骤均在4 °C下进行，动物用预冷灌注缓冲液灌注，且本方案经过优化，以最大限度缩短从组织提取到细胞培养之间的时间。若需分析 freshly-isolated（新鲜分离）细胞的基因表达模式，应在胰酶消化前直接从CD11b免疫贴壁培养皿中收集细胞裂解物，以将分离过程诱导的变化降至最低。需要注意的是，即使经过谨慎分离的小胶质细胞，在置于温暖环境后也会立即启动炎症反应，这可能是由于识别了与分离操作本身固有相关的损伤相关信号所致。若本方案成功执行，预期每只幼年大鼠可获得2.5 - 5 × 105个细胞。
本文提供的细胞分离方案在从灌注过的中枢神经系统（CNS）中分离CD11b+细胞方面具有高度特异性9。尽管该细胞群体主要由小胶质细胞...
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本工作由脊髓损伤国际研究协会（Christopher and Dana Reeve Foundation）、Miriam博士和Sheldon G. Adelson医学研究基金会、JPB基金会、诺华基础研究所、Vincent和Stella Coates的慷慨捐助，以及Damon Runyon癌症研究基金会（DRG-2125-12）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠：Sprague-Dawley | 查尔斯河 | 货号# 400 | |
| 小鼠抗大鼠 CD11b 单克隆抗体（克隆株 OX42） | 伯乐（Bio-Rad） | 货号 MCA275R | 贴壁：1:1,000；染色：1:500 |
| 山羊多克隆抗Iba1 | Abcam | 货号 AB5076 | 染色：1:500 |
| 兔多克隆抗-Ki67 | Abcam | 货号 AB15580 | 染色：1:500 |
| Alexa Fluor 驴抗小鼠 594 | Invitrogen | 货号# 11055 | 染色：1:500 |
| Alexa Fluor 驴抗山羊 488 | Invitrogen | 货号 A-21203 | 染色：1:500 |
| Alexa Fluor 驴抗兔 647 | Invitrogen | 货号 A-31573 | 染色：1:500 |
| Triton-X（免疫细胞化学染色中的去垢剂） | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| 硫酸乙酰肝素 | Galen 实验室用品 | 货号 GAG-HS01 | |
| 肝素 | Sigma | 货号 M3149 | |
| 脱脂乳蛋白胨 | Sigma | 货号 P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | 货号 100-35B | |
| 小鼠 IL-34 | R&D Systems | 货号 5195-ML/CF | |
| 绵羊羊毛胆固醇 | Avanti Polar Lipids | 货号 700000P | |
| IV型胶原蛋白 | 康宁 | 货号 354233 | |
| 油酸 | Cayman Chemicals | 货号# 90260 | |
| 11(Z)二十碳二烯酸（戈多酸） | Cayman Chemicals | 货号# 20606 | |
| Calcein AM 染料 | Invitrogen | 货号 C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | 货号 E1169 | |
| DNaseI | 沃辛顿 | 货号# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | 货号 T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 货号 15140-122 | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | 货号 A9165 | |
| 胰岛素 | Sigma | 货号 16634 | |
| 脱铁转铁蛋白 | Sigma | 货号 T1147 | |
| 亚硒酸钠 | Sigma | 货号 S-5261 | |
| DMEM（高糖） | Gibco | 货号 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | 货号 0100-20 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | 货号 A-003-E | |
| Primaria 培养板 | VWR | 货号 62406-456 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 储备试剂 | |||
| Apo-转铁蛋白 | 重建：在 PBS 中配制成 10 mg/mL 使用浓度：1:100 储存：-20°C | ||
| N-乙酰半胱氨酸 | 复溶：5 mg/mL，溶于H2O 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C | ||
| 亚硒酸钠 | 复溶：2.5 mg/mL，溶于H2O 使用浓度：1:25,000 储存：-20°C | ||
| IV型胶原蛋白 | 重建：200 μg/mL in PBS 使用浓度：1:100 储存：-80°C | ||
| TGF-β2 | 重悬：在 PBS 中重悬至 2 mg/mL 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C | ||
| IL-34 | 重建：200 μg/mL in PBS 使用浓度：1:1,000 储存：-80°C | ||
| 绵羊羊毛胆固醇 | 复溶：1.5 mg/mL，溶于100%乙醇 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C | ||
| 硫酸乙酰肝素 | 重悬：1 mg/mL，溶于H2O 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C | ||
| 油酸/芥酸 | 重悬：芥酸：0.001 mg/mL；油酸：0.1 mg/mL，溶于100%乙醇 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C | ||
| 肝素 | 重悬：50 mg/mL，PBS中 使用浓度：1:100 储存：-20°C | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 溶液 | |||
| 灌注缓冲液 | 配方：50 μg/mL 肝素，溶于含 Ca++ 和 Mg++ 的 DPBS++（PBS） 注释：冰浴时使用 | ||
| Douncing 缓冲液 | 配方：200 μ0.4% DNaseI 溶于 50 mL DPBS++ 中的溶液 注释：冰浴时使用 | ||
| 平皿缓冲液 | 配方：2 mg/mL 牛奶固体蛋白胨溶于 DPBS++ | ||
| 小胶质细胞生长培养基（MGM） | 配方：DMEM/F12，含100单位/毫升青霉素、100 μg/mL 链霉素，2 mM 谷氨酰胺，5 μg/mL N-乙酰半胱氨酸，5 μ微克/毫升胰岛素，100 μg/mL 脱铁转铁蛋白，以及 100 ng/mL 硒酸钠 注释：使用预冷的MGM从免疫平皿中洗脱微胶质细胞。 | ||
| IV型胶原蛋白包被 | 配方：含有2的MGM μg/mL 胶原蛋白 IV | ||
| 髓鞘分离缓冲液 | 配方：9 mL Percoll PLUS，1 mL 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 10x PBS，9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 注释：添加后充分混匀 CaCl2 和 MgCl2 | ||
| 含TGF-β2/IL-34/胆固醇的生长培养基（TIC） | 配方：MGM 培养基含人 TGF-β2 2 ng/mL、小鼠 IL-34 100 ng/mL、1.5 μg/mL 羊毛胆固醇，10 μg/mL 肝素硫酸酯，0.1 μg/ml 油酸，以及 0.001 μg/ml 十一碳烯酸 注意事项：务必向已预热至 37℃ 的培养基中添加胆固醇 °C 且不超过 1.5 μg/mL，否则会析出沉淀。含胆固醇的培养基不得过滤。在加入细胞前，将TIC培养基置于10% CO2环境中平衡30分钟至1小时，以确保最佳pH值。 |
参考文献
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- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
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- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
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