分离与培养啮齿类动物小胶质细胞以在无血清培养基中促进动态分支状形态

摘要

深入了解小胶质细胞功能的努力因缺乏能够模拟成熟小胶质细胞特性的培养模型而受到阻碍 体内 小胶质细胞。本方案描述了一种分离与培养方法，旨在特定培养基条件下维持高度分支的成熟大鼠小胶质细胞的良好存活。

摘要

小胶质细胞占中枢神经系统（CNS）细胞总数的5–10%，因其在发育、稳态及疾病过程中的重要作用而日益受到关注。尽管巨噬细胞已被深入研究数十年，但作为CNS组织驻留型巨噬细胞的小胶质细胞，其特有特性在很大程度上仍不明确，部分原因在于体外培养难以重现成熟小胶质细胞的特性。本文介绍一种从成熟啮齿类动物脑组织中快速分离高纯度小胶质细胞的简便方法，并描述支持小胶质细胞长期高存活率的无血清培养条件。在该定义明确的培养体系中，小胶质细胞呈现出复杂的分支状突起并表现出动态的监视行为。我们展示了血清暴露对培养小胶质细胞的一些影响，并讨论了此类无血清培养体系与含血清培养体系以及体内小胶质细胞之间的比较 体内.

引言

作为中枢神经系统实质中的巨噬细胞，小胶质细胞与广泛的神经元环路和胶质细胞信号网络相互作用。它们通过突触修剪、凋亡细胞清除以及与神经元突起的短暂接触，在大脑的发育和稳态维持中发挥关键作用^1,2。小胶质细胞是神经系统损伤的早期响应者，会将其细长的突起延伸至损伤部位，协调炎症反应并限制出血^3,4。在急性和慢性中枢神经系统损伤中，小胶质细胞的形态和功能改变普遍存在，并且在多种疾病状态下表现出形态、定位以及炎症介质表达的异常¹。人类遗传学研究表明，在完整的中枢神经系统中，那些改变神经退行性疾病风险的基因突变通常主要或仅由小胶质细胞表达，提示小胶质细胞在疾病发生或进展中具有关键作用⁵。鉴于其在损伤和疾病中的突出作用，深入理解小胶质细胞生物学已成为开发新型治疗策略的优先方向。

小胶质细胞生物学领域的许多重要进展，源于对其他巨噬细胞群体研究中所发现的技术和机制的推演，包括培养方法、基因表达谱以及功能/形态状态的定义。尽管在中枢神经系统（CNS）环境中，普遍性的巨噬细胞功能常表现出出人意料的特点，但小胶质细胞本身具有高度特化性，呈现出分支状形态和独特的基因表达特征，使....

方案

涉及啮齿类动物的所有操作均符合斯坦福大学指南，该指南遵循国家和州的法律法规及政策。所有动物操作均经斯坦福大学实验动物护理与使用委员会批准。

注意：所有溶液和缓冲液的组成均在材料表中提供。

1. 准备用于CD11b免疫平皿筛选的培养皿（第0天）

注意：每1-2个幼年大鼠脑准备1个免疫吸附皿。

1. 向一个15 cm的培养皿中加入25 mL的50 mM Tris（pH 9.5）溶液。
2. 向培养皿中加入羊抗小鼠IgG（H+L链），使其终浓度为6 µg/mL。轻轻旋转培养皿以均匀分布。
3. 将培养皿在37 °C下孵育1–3小时。
4. 用DPBS⁺⁺（含Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲液（PBS））清洗培养皿三次，然后更换为含有1 µg/mL OX42抗体的包被缓冲液。将培养皿在室温下平放过夜。

2. 组织采集（第1天）

注意：本方案应耗时约 3 - 4 小时。

1. 开始前，确保所有溶液均为无菌且已预冷至冰上。将所有器械置于冰上预冷，并在使用前用乙醇消毒。
....

结果

本方案描述了一种从幼年大鼠中培养高纯度分支状小胶质细胞的方法。使用未成熟、围产期及成年动物也可获得类似结果，如下文所述。由于细胞分离过程常包含细微的操作要点，且存在大量导致细胞死亡的可能性，因此我们设置了质量控制检查点，以帮助判断各步骤是否成功。我们通常在整个分离方案的多个步骤中使用血细胞计数板监测细胞悬液（图1A）。成功的分离每只幼年动物可获得 2.5 - 5 x 10⁵ 个细胞。P7 至 P15 阶段的动物每只产量接近 5 x 10⁵ 个细胞，而从 P30 以上年龄动物分离的细胞产量则接近每只 2.5 x 10⁵ 个细胞。除了在整个操作过程中监测总细胞数量外，评估分离细胞的整体健康状态也十分重要。然而，这具有一定难度，因为以本方法分离的小胶质细胞在培养初期呈现圆形或双极形态。为此，我们提供了P25小胶质细胞在TIC培养基以及含10%胎牛血清（FCS）的TIC培养基中分离后前6天的相差显微图像（图1B

讨论

由于小胶质细胞作为中枢神经系统的哨兵免疫细胞，对环境变化高度敏感；因此，在分离和培养过程中必须格外小心，以尽量减少细胞内的炎症反应⁸。本方案通过操作速度和温度控制来实现这一目标。尽可能将细胞保持在冰上或4 °C条件下可显著降低细胞活化，因此所有离心步骤均在4 °C下进行，动物用预冷灌注缓冲液灌注，且本方案经过优化，以最大限度缩短从组织提取到细胞培养之间的时间。若需分析 freshly-isolated（新鲜分离）细胞的基因表达模式，应在胰酶消化前直接从CD11b免疫贴壁培养皿中收集细胞裂解物，以将分离过程诱导的变化降至最低。需要注意的是，即使经过谨慎分离的小胶质细胞，在置于温暖环境后也会立即启动炎症反应，这可能是由于识别了与分离操作本身固有相关的损伤相关信号所致。若本方案成功执行，预期每只幼年大鼠可获得2.5 - 5 × 10⁵个细胞。

本文提供的细胞分离方案在从灌注过的中枢神经系统（CNS）中分离CD11b+细胞方面具有高度特异性⁹。尽管该细胞群体主要由小胶质细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠：Sprague-Dawley	查尔斯河	货号# 400
小鼠抗大鼠 CD11b 单克隆抗体（克隆株 OX42）	伯乐（Bio-Rad）	货号 MCA275R	贴壁：1:1,000；染色：1:500
山羊多克隆抗Iba1	Abcam	货号 AB5076	染色：1:500
兔多克隆抗-Ki67	Abcam	货号 AB15580	染色：1:500
Alexa Fluor 驴抗小鼠 594	Invitrogen	货号# 11055	染色：1:500
Alexa Fluor 驴抗山羊 488	Invitrogen	货号 A-21203	染色：1:500
Alexa Fluor 驴抗兔 647	Invitrogen	货号 A-31573	染色：1:500
Triton-X（免疫细胞化学染色中的去垢剂）	Thermo Fisher	Cat# 28313
硫酸乙酰肝素	Galen 实验室用品	货号 GAG-HS01
肝素	Sigma	货号 M3149
脱脂乳蛋白胨	Sigma	货号 P6838
TGF-β2	Peprotech	货号 100-35B
小鼠 IL-34	R&D Systems	货号 5195-ML/CF
绵羊羊毛胆固醇	Avanti Polar Lipids	货号 700000P
IV型胶原蛋白	康宁	货号 354233
油酸	Cayman Chemicals	货号# 90260
11(Z)二十碳二烯酸（戈多酸）	Cayman Chemicals	货号# 20606
Calcein AM 染料	Invitrogen	货号 C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	货号 E1169
DNaseI	沃辛顿	货号# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
胰蛋白酶	Sigma	货号 T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
青霉素/链霉素	Gibco	货号 15140-122
谷氨酰胺	Gibco	Cat# 25030-081
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	货号 A9165
胰岛素	Sigma	货号 16634
脱铁转铁蛋白	Sigma	货号 T1147
亚硒酸钠	Sigma	货号 S-5261
DMEM（高糖）	Gibco	货号 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	货号 0100-20
聚-D-赖氨酸	Sigma	货号 A-003-E
Primaria 培养板	VWR	货号 62406-456
名称	公司	目录编号	评论
储备试剂
Apo-转铁蛋白			重建：在 PBS 中配制成 10 mg/mL 使用浓度：1:100 储存：-20°C
N-乙酰半胱氨酸			复溶：5 mg/mL，溶于H2O 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C
亚硒酸钠			复溶：2.5 mg/mL，溶于H2O 使用浓度：1:25,000 储存：-20°C
IV型胶原蛋白			重建：200 μg/mL in PBS 使用浓度：1:100 储存：-80°C
TGF-β2			重悬：在 PBS 中重悬至 2 mg/mL 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C
IL-34			重建：200 μg/mL in PBS 使用浓度：1:1,000 储存：-80°C
绵羊羊毛胆固醇			复溶：1.5 mg/mL，溶于100%乙醇 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C
硫酸乙酰肝素			重悬：1 mg/mL，溶于H2O 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C
油酸/芥酸			重悬：芥酸：0.001 mg/mL；油酸：0.1 mg/mL，溶于100%乙醇 使用浓度：1:1,000 储存：-20°C
肝素			重悬：50 mg/mL，PBS中 使用浓度：1:100 储存：-20°C
名称	公司	目录编号	评论
溶液
灌注缓冲液			配方：50 μg/mL 肝素，溶于含 Ca++ 和 Mg++ 的 DPBS++（PBS） 注释：冰浴时使用
Douncing 缓冲液			配方：200 μ0.4% DNaseI 溶于 50 mL DPBS++ 中的溶液 注释：冰浴时使用
平皿缓冲液			配方：2 mg/mL 牛奶固体蛋白胨溶于 DPBS++
小胶质细胞生长培养基（MGM）			配方：DMEM/F12，含100单位/毫升青霉素、100 μg/mL 链霉素，2 mM 谷氨酰胺，5 μg/mL N-乙酰半胱氨酸，5 μ微克/毫升胰岛素，100 μg/mL 脱铁转铁蛋白，以及 100 ng/mL 硒酸钠 注释：使用预冷的MGM从免疫平皿中洗脱微胶质细胞。
IV型胶原蛋白包被			配方：含有2的MGM μg/mL 胶原蛋白 IV
髓鞘分离缓冲液			配方：9 mL Percoll PLUS，1 mL 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 10x PBS，9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 注释：添加后充分混匀  CaCl2 和 MgCl2
含TGF-β2/IL-34/胆固醇的生长培养基（TIC）			配方：MGM 培养基含人 TGF-β2 2 ng/mL、小鼠 IL-34 100 ng/mL、1.5 μg/mL 羊毛胆固醇，10 μg/mL 肝素硫酸酯，0.1 μg/ml 油酸，以及 0.001 μg/ml 十一碳烯酸 注意事项：务必向已预热至 37℃ 的培养基中添加胆固醇 °C 且不超过 1.5 μg/mL，否则会析出沉淀。含胆固醇的培养基不得过滤。在加入细胞前，将TIC培养基置于10% CO2环境中平衡30分钟至1小时，以确保最佳pH值。