本方案详细描述了在室温下用于X射线衍射数据收集的微流控器件的制备与操作方法。此外，还介绍了如何通过动态光散射监测蛋白质结晶过程，以及如何处理和分析所获得的衍射数据。
方法文章
微流控芯片用于 原位 晶体X射线衍射与 原位 用于序列晶体学的动态光散射
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摘要
摘要
本方案描述了用于基于测角仪的固定靶标串行晶体学的低X射线背景微流控器件的制备方法。该器件采用软光刻技术以环氧胶进行图案化，适用于 原位 室温下的X射线衍射实验。样品孔的两侧均覆盖聚合物聚酰亚胺薄膜窗口，可在低X射线背景干扰下实现衍射数据采集。该器件制备方法简便且成本低廉。在获得SU-8母模晶圆后，所有制备步骤均可在普通科研实验室环境中完成，无需洁净室。芯片设计与制备工艺利用毛细管阀控技术，通过微流控方式将水相反应液分割为若干体积精确的纳升级液滴。该加载机制可避免因通道死体积导致的样品损耗，且无需使用泵或其他流体驱动设备，可完全手动操作。我们描述了如何对分离的纳升级蛋白质溶液液滴进行监测 原位 通过动态光散射控制蛋白质晶体的成核与生长。在获得合适晶体后，可使用基于测角仪的系统收集完整的X射线衍射数据集 原位 室温下固定靶串行X射线晶体学。本方案提供自定义脚本，利用一系列软件工具处理衍射数据集，以解析并精修蛋白质晶体结构。该方法避免了传统晶体学实验中低温保存或手动操作晶体可能引入的假象。我们展示并比较了三种利用芯片中生长的尺寸约为10–20 µm的小晶体所解析的蛋白质结构。通过在芯片中进行结晶与衍射 原位，从而最大限度地减少对脆弱晶体的操作及机械干扰。该方案详细介绍了如何制备一种定制的X射线透明微流控芯片，适用于 原位 序列晶体学。由于几乎每个晶体都可用于衍射数据收集，这些微流控芯片是一种非常高效的晶体输送方法。
引言
了解蛋白质的三维结构对于理解其功能至关重要。迄今为止，近原子分辨率的结构最常通过X射线晶体学获得。该技术将蛋白质晶体暴露于X射线辐射中，随后分析产生的衍射图样以确定和优化结构。在传统的X射线晶体学中，完整的衍射数据集通常来自单个理想情况下较大的晶体，并在低温条件下采集。然而，此类晶体通常难以生长，且确定合适的低温保护条件本身可能具有挑战性，有时还可能导致蛋白质结构偏离其天然构象5。
X射线自由电子激光（FEL）和同步辐射光束线的最新技术进步使得能够利用更小的晶体解析结构，这得益于新型微聚焦光束线、更高的X射线束亮度以及改进的X射线探测器的出现6,7。通常情况下，小晶体比大而无缺陷的晶体更容易生长8,9。然而，小晶体比大晶体更快地遭受X射线辐射损伤。这是因为与大晶体相比，为了达到相近的衍射分辨率，必须将更高剂量的X射线投射到更小的晶体体积中。因此，即使采用低温保护，通常也难以从单个微晶中记录到完整的衍射数据集。
为了克服这一障碍，序列晶体学已成为首选方法，通过收集并合并来自大量随机取向微晶的衍射图样，从而获得完整的数据集。通过将解析蛋白质结构所需的总X射线剂量分散到大量晶体上，可最大限度地减少辐射诱导的晶体损伤5,10。在“先衍射后破坏”的自由电子激光（FEL）实验中，每个晶体仅使用一次飞秒级X射线脉冲进行曝光。第三代同步辐射光源上的微聚焦光束线则可通过数毫秒的短时X射线曝光实现序列晶体学实验11,12,13,14。然而，由于在数据收集过程中不进行晶体摆动或旋转，只能记录到部分布拉格衍射点，因此结构解析通常需要数万张甚至更多的衍射图样15。迄今为止，已开发出多种适用于序列晶体学的样品递送方法，近期已有综述对此进行总结14,16,17,18,19。其中，若干基于固定靶的样品递送策略已成功结合X射线曝光期间的晶体旋转，使得相较于传统的仅记录静态图像的序列晶体学实验，所需衍射图样数量显著减少，同时样品消耗量也更低，却仍可获得同样完整的数据集7,16,20,21,22,23,24。
我们提出一种用于制备低X射线背景微流控器件的方案。该器件采用软光刻技术，以5分钟环氧胶为材料进行图案化，适用于 原位 室温下的X射线衍射实验，通过将样品制备直接整合到X射线装置中而获益，例如在跟踪混合诱导动力学的时间分辨研究中即为此类情况18,19微流控通道两侧均以聚合物聚酰亚胺薄膜封盖，形成总厚度约为16 µm的X射线窗口，可实现低X射线背景成像。所有所用材料均具有良好的耐溶剂性。该制备方法相对简单且成本较低。在获得SU-8母版晶圆后，所有制备步骤均可在典型科研实验室环境中于洁净室外完成。
在应用实例中，我们描述了用于基于测角仪的固定靶标序列晶体学的芯片。首先讨论了利用毛细管阀对水相反应液进行微流控分割的设计与制备考虑，可将反应液分割为特定数量的纳升级液滴。该加样机制可避免因通道死体积造成的样品损失，且分割过程可手动完成，无需使用泵或其他流体驱动设备。此类被分离的纳升级蛋白溶液液滴可被监测 原位 使用动态光散射（DLS）控制蛋白质晶体的成核与生长。已有研究证明，可在由聚二甲基硅氧烷（PDMS）结构与玻璃载片键合而成的微流控装置中进行DLS测量。25,26由于聚酰亚胺层在波长大于550 nm时具有高透射率，因此在使用适当的激光波长时，该方法也可扩展应用于X射线透明芯片中的测量。27,28根据DLS结果，可以观察到初始成核现象，此时可停止进一步的液滴蒸发，以获得数量较少但尺寸较大的蛋白质晶体。
在获得足够晶体后，可使用基于测角仪的装置收集完整的X射线衍射数据集 原位 室温下固定靶连续X射线晶体学。衍射数据集通过一系列软件工具和自定义脚本进行处理，以解析蛋白质晶体结构。该技术避免了传统晶体学实验中常用冷冻保存所导致的诸多假象。
我们比较了三种利用芯片上生长的约10–20 µm大小晶体解析得到的蛋白质靶标结构，其分辨率均优于2 Å。通过在芯片上进行结晶和衍射 原位，从而最大限度地减少对脆弱晶体的操作和机械扰动。该方案适用于高分辨率和低分辨率（1.7 Å 至 3.0 Å）的蛋白质晶体。由于几乎每一颗晶体都可用于衍射实验，样品浪费极少，因此这是一种非常高效的晶体递送方法。
本方案详细介绍了如何制备用于原位蛋白质结晶及衍射数据收集的X射线透明微流控芯片。in situ 微流控技术经过精心设计，可在无需实验室配备复杂设备的情况下，充分利用微流控系统的精确性。此外，在同步辐射光束线上进行数据采集时，无需使用专用的测角仪或加湿器，从而便于非专业人员重复实验结果。该技术可用于室温下进行毫秒级序列晶体学数据采集，在最大限度减少辐射损伤的同时，避免因冷冻保护或晶体操作在晶体生长后引入应力。因此，所述方法适用于任何蛋白质结晶研究项目。
方案
1. 芯片设计与母版制备
- 掩膜设计
- 使用合适的CAD绘图软件绘制所需的通道几何形状。针对每一层光刻胶，准备单独的掩膜。本方案中使用的所有设计均在结果部分详细讨论，并以AutoCad的“.DWG”格式提供于补充文件1中。
注意：在构建全PDMS器件时，通道高度与宽度的纵横比不应超过1:10，以防止通道塌陷。聚酰亚胺薄膜和固化环氧树脂更为坚固，原则上可允许更高的纵横比。然而，我们有意未超过1:10的比例，以便初始设计可作为传统的PDMS器件进行原型制作。 - 将CAD文件转换为乳胶膜光刻掩膜。使用标称64k DPI分辨率，以确保可精确呈现约5 µm大小的特征。
注意：此步骤可通过商业服务完成。成像服务提供商可能偏好不同的绘图规范，以简化文件转换过程。请提前咨询其推荐的绘图规范，以避免在转换过程中出现繁琐的故障排查。具有透明特征的黑色背景掩膜将在晶圆上形成SU8光刻胶结构，从而在复制成型过程中产生功能性的PDMS微通道。相反，透明背景上的黑色特征掩膜则用于制备适用于X射线芯片制造的PDMS模具。我们建议同时订购两种极性的掩膜，以便在将设计转化为X射线芯片之前，能够早期进行原型制作和设计验证。
- 使用合适的CAD绘图软件绘制所需的通道几何形状。针对每一层光刻胶，准备单独的掩膜。本方案中使用的所有设计均在结果部分详细讨论，并以AutoCad的“.DWG”格式提供于补充文件1中。
- SU8母版制作
注意：这是唯一需要在洁净室中进行的步骤。若缺乏关键洁净室设备，可将整个步骤外包给提供已图案化SU8母版的MEMS代工服务公司。请按照产品说明书中的指导处理SU8。步骤1.2.1至1.2.4总结了通用的SU8母版制作流程，三层X射线芯片设计的完整参数列于表1中。多层SU8对准技术的介绍此前已有发表29。- 将约1 mL SU8光刻胶倒入3英寸晶圆上，并根据表1中指定的转速和时间进行旋涂，以达到所需厚度（图1，步骤1）。根据光刻胶层厚度，在65 °C和95 °C下分别预烘数分钟。进行预烘以固化SU8，防止其粘附到光刻掩膜上，并提高光刻胶与基底的附着力（图1，步骤2）。
- 按照表1中指定的条件对光刻胶进行紫外光曝光，随后在95 °C下进行曝光后烘烤，以催化完成曝光过程中引发的光化学反应（图1，步骤3）。
- 对后续每一层重复上述步骤。然后使用掩膜对准仪和游标卡尺对准标记，将后续层的光刻掩膜与母版对准29。
- 使用丙二醇甲醚醋酸酯（PGMEA）显影晶圆，洗去所有未曝光的SU8光刻胶，直至异丙醇冲洗不再出现乳白色沉淀为止（图1，步骤4）。用加压氮气吹干晶圆。
注意：异丙醇对SU8溶解性较差，其沉淀现象表明存在未完全固化的残留物。
- PDMS模具制作
- 将一块铝箔（15 × 15 cm）放入培养皿（10 cm）中，并将SU8母版放置于铝箔上，以便PDMS固化后易于取出母版。
- 将硅胶基体与固化剂按10:1比例混合，总量为25 g，在容器中用刮刀或机械搅拌器充分搅拌。一个置于10 cm培养皿中的3英寸晶圆约消耗25 g PDMS，形成厚度为5 mm的片状结构。
- 将预混好的PDMS浇注到SU8母版上（图1，步骤5），高度约为4 mm。将PDMS置于真空环境中脱气5分钟，以去除气泡，直至PDMS表面无气泡或仅剩少量气泡。
- 在70 °C烘箱中固化PDMS 1小时。随后用手术刀切割固化后的PDMS，并小心地将PDMS模具从SU8母版上剥离（图1，步骤6）。切割应直达母版表面，以防止剥离过程中PDMS开裂。
- 可选：制备PDMS模具的横截面切片，以确认母版上所有SU8层均达到预期厚度（图1）。早期的微流控通道布局测试可在全PDMS芯片中进行。
注意：在PDMS上打孔形成通路（步骤3.3）后，可通过O2等离子体活化（20 s，0.4 mbar O2，50 W，13.56 MHz）将复制成型的PDMS直接键合至玻璃基底。如第1.2节所述，X射线芯片制造需要相反极性的掩膜，因此晶圆轮廓也需相应调整。
2. 原位 X射线芯片制备
- 将两种环氧树脂前体分别用乙醇稀释，使乙醇的最终质量分数为40 wt%。每种环氧树脂前体在乙醇中的总质量为0.25 g，足以用于一个面积为1 cm2的芯片。
注意：这可以降低所得5分钟固化环氧树脂的黏度，便于无气泡混合和复制模塑，并最小化最终固化环氧层的厚度。乙醇在固化过程中会通过PDMS蒸发。 - 将PDMS模具置于真空干燥器中脱气30分钟，使其在模塑过程中能够吸收环氧树脂中的微小气泡。
- 将聚酰亚胺薄膜裁剪至约70 × 70 mm，并用胶带将其固定在75 × 50 mm的玻璃载片上，使薄膜背面贴有胶带，从而获得平整且刚性的表面。使用50 W、13.56 MHz、0.4 mbar氧气（O2）等离子体对薄膜处理20秒进行等离子活化，然后将整个薄膜-载片组合浸入体积分数为1 vol%的(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷（APTS）或(3-缩水甘油基氧丙基)三甲氧基硅烷（GPTS）水溶液中，在20 °C下孵育5分钟。
- 充分混合两种经乙醇稀释的环氧前体溶液，以确保最佳的固化性能。从真空腔中取出PDMS模具并放置在平坦表面上。然后使用移液器迅速将混合后的树脂滴加到模具上每个微结构区域（每1 cm2微结构约10 µL）（图1，步骤7a）。
- 从水相硅烷（APTS或GPTS）溶液中取出聚酰亚胺薄膜-载片夹层结构，用加压空气或氮气吹干薄膜。
- 将已准备好的聚酰亚胺薄膜-玻璃载片夹层结构放置在已涂布的环氧树脂上（图1，步骤7b）。用力将连接聚酰亚胺薄膜的玻璃载片压向PDMS模具。在玻璃载片上放置金属板，再施加重物，以在室温下对环氧树脂施加最高达1.4 N/cm2的压力并保持1小时，使其完成固化。
注意：理想情况下，在模具中结构高度最大的区域，薄膜上不应残留树脂。这些 对应 后续进行结晶反应的结晶井。- 可选：如果对微小特征的精确复制至关重要，可在模塑过程中使用铝制框架加固PDMS模具31。
- 通过从PDMS模具上剥离的方式，取下带有聚酰亚胺薄膜和图案化环氧树脂的玻璃载片（图1，步骤8）。使用50 W、13.56 MHz、0.4 mbar氧气（O2）等离子体对图案化环氧树脂面处理20秒进行等离子活化。
- 将聚酰亚胺薄膜从等离子体腔中取出后，将其浸入体积分数为1 vol%的水相APTS（或GPTS）溶液中，在20 °C下孵育5分钟。同样地，准备另一片未图案化的聚酰亚胺薄膜，并用互补的1 vol% GPTS（或APTS）硅烷进行活化处理。孵育完成后，用加压空气吹干图案化和未图案化的两片薄膜。
- 将图案化环氧树脂面朝上放置在平坦表面上，利用其下方水滴的表面张力作为媒介，防止 薄膜卷曲，并确保最大程度的平整度。然后将第二片已活化的聚酰亚胺薄膜覆盖其上，从一角向对角方向轻轻用手指抹平，使其粘合，并避免气泡产生。
3. 用于液体输送的接入端口
- 按照步骤 1.3.1 至 1.3.3 在培养皿中制备 4 mm 厚的 PDMS 板，但不使用 SU8 模板。将该板切割成适当尺寸的 PDMS 块，以覆盖芯片上的所有进样口，但不得覆盖芯片的各个结晶腔室。
- 将芯片和 PDMS 块置于 50 W、13.56 MHz、0.4 mbar O2 的等离子体中活化 20 秒。为实现化学键合，随后将各部分在 1 vol% 的水相 APTS 或 GPTS 溶液中于 20 °C 下孵育 5 分钟。用加压空气吹干各部分，并将 PDMS 板压合到薄膜芯片上。
- 为增强键合效果，将芯片置于一块平整的 PDMS 板上，覆盖一层塑料膜，再放上一块洁净的玻璃片和一个金属块。最后施加重物，以提供约 1.4 N/cm2 的压力，持续约 1 小时。
- 使用 0.75 mm 的活检打孔器在芯片设计中标记的每个进样口和出样口位置打孔，并用胶带密封背面。此时，芯片可通过外径与孔径匹配的任意管路进行连接（如步骤 4.2 所述）。
4. 表面处理
- 将9 wt%氟聚合物储备液用氟溶剂稀释至1:20，得到终浓度为0.45 wt%的溶液。将储备液及稀释液避光保存于4 °C冰箱中。
- 将1:20稀释的氟聚合物溶液装入1 mL鲁尔锁式注射器中。在注射器上安装27G × 5/8"针头，再将聚四氟乙烯（PTFE）管路连接至针头。
- 将管路连接至X射线芯片的出口，注入步骤4.1中制备的氟聚合物工作液，直至所有通道完全填充。
- 将芯片平面向下放置于190 °C加热板上加热5分钟，以完全蒸发溶剂，使氟聚合物沉积形成一层薄膜涂层。
注意：当使用新的芯片结构时，需检查此涂层过程中通道是否被氟聚合物堵塞。若发生堵塞，应进一步稀释储备液。
5. 蛋白质制备
- 称取冻干的索马甜，并将其溶解于表2所列缓冲液中，定容至适当体积，使终浓度为40 mg mL-1。
- 根据制造商说明书，将葡萄糖异构酶用表2所列缓冲液进行透析。
- 参照Schubert et. al.30先前描述的方法制备硫氧还蛋白（thioredoxin）蛋白。
- 使用ProtParam软件32计算得到的消光系数（见表2），通过光度法测定最终蛋白浓度。
- 所有溶液均使用超纯水配制，并用0.2 µm滤膜过滤。
- 将蛋白溶液在20 °C、16100 x g条件下离心15分钟，取上清液用于结晶实验。
6. X射线芯片中的蛋白质结晶
- 为了在微流控芯片中结晶蛋白质，将等量的蛋白质溶液与沉淀剂溶液混合。蛋白质浓度、缓冲液组成和沉淀剂组成详见表2。准备约20 µL的总体积以填充一个微流控芯片。
- 混合后立即通过连接有27G × 5/8"针头和外径为0.75 mm的聚四氟乙烯（PTFE）管的注射器，将溶液注入芯片的进样口（详见步骤4.2）。
注意：串联结构的填充过程需要预先用氟化油对芯片进行引液，最简便的方法是在通过进样口注入结晶溶液之前，先从出样口加载氟化油。所有加样步骤均应使用显微镜监测，以控制注射器施加的压力和相应的流速。 - 芯片填充完成后，通过向芯片的进样口注入氟化油来分隔各个独立的结晶单元。通过封闭芯片的所有进样口和出样口来密封芯片，可使用回形针插入实现密封。
注意：由于结晶单元已被蛋白质/沉淀剂溶液填充，氟化油仅填充芯片的进样通道，不会影响结晶单元内的溶液。 - 为了模拟蒸汽扩散结晶动力学，将密封后的芯片置于室温和正常大气条件下，使结晶单元中的液滴通过聚酰亚胺薄膜蒸发水分而逐渐缩小。
- 当通过显微镜或动态光散射（DLS）测量观察到晶体形成后（见步骤7），将整个微流控芯片转移至相应的沉淀剂溶液中，以停止结晶孔中进一步的蒸发，直至进行X射线衍射实验。
7. 芯片中结晶孔的动态光散射测量
注意：DLS 测量使用 100 mW 的激光输出功率，波长为 660 nm，散射光的检测角度为 142°。由于所有被研究的样品溶液均为水溶液，因此在所有计算中均采用水的折射率（n = 1.33）。
- 使用第8.1步中描述的适配器，将微流控芯片放入DLS仪器的SBS格式板架中。将适配器插入设备。
- 使用电动x、y、z载物台，仔细调节激光焦点至微流控芯片的某一腔室内部。由于微流控芯片非常薄，需以微小步进方式调节z轴位置。
注意：正确的调节可通过DLS测量得到的自相关函数具有较高的截距值和光滑的尾部来确认。可创建校准文件，以匹配微流控芯片中各个结晶孔的位置，从而实现随时间对多个腔室进行自动化的DLS测量。 - 在293 K条件下，每次DLS测量持续30秒，并每5分钟重复一次测量，直至结晶实验结束。
注意：可通过DLS测量随时间变化的粒径分布来监测初始成核过程，同时可利用DLS板式读取仪内置的显微镜平行观察晶体是否成功形成。
8. 衍射数据收集
- 用于光束线测角仪的适配器
- 打印用于晶体学数据收集过程中定位和旋转X射线芯片的平板测角仪适配器。
- 使用制造商推荐的默认参数设置，通过 hobby-grade 3D 打印机打印基座测角仪的适配器。
注意：适配器使用 3D-CAD 系统设计，适配器的坐标文件为 以“.STL”文件格式附在补充材料中。 - 使用双面胶带将X射线芯片固定在适配器上。
- 原位 X射线晶体学
- 在 296 K 条件下，使用 10 × 5 µm（高斯轮廓的半高全宽）的光束尺寸收集衍射数据。采用能量为 12.8 keV、通量为 2.2 · 10¹² 光子/秒的 X 射线。11 光子 · 秒-1 使用 Pilatus 6M 混合像素探测器在衰减光束中记录衍射图样。
注意：含有甜蛋白、葡萄糖异构酶或硫氧还蛋白晶体的微流控装置用于 原位 在PETRA III同步辐射光源EMBL P14光束线上进行的X射线晶体学实验。其他X射线源的可用光束聚焦尺寸和通量可能有所不同。所曝光的蛋白质晶体数量、从每颗晶体记录的衍射图谱数量、每次曝光的振荡角度范围以及曝光时间汇总于 表3. - 使用 XDS 程序分别处理两两连续的衍射图样数据集33使用 bash 脚本 "xds.sh" 见补充材料。
- 使用软件 XSCALE 为来自所有晶体的每套数据集创建 HKL 文件并进行标度校正33. 使用 bash 脚本 "xscale.sh" 在补充材料中 用于生成 XSCALE 的输入文件。
注意：仅应缩放相关系数大于 90% 的晶体数据集，该值表明具有高度同晶性。保守标准 ‹I/σ(I)›（>2）应用于确定最高分辨率壳层。使用程序 MOLREP 进行分子置换34 来自 CCP4 套件35 可用于通过蛋白质数据库（PDB）中所示的三维坐标获取相位，以进行后续的模型构建 表3. - 使用 Refmac5 对所有结构进行同位素精修35,36 并使用 COOT37 用于对最终模型进行视觉检查。
注意：在精修过程中，溶剂分子应自动添加，并需检查以确认其化学位置合理。必须检查所有模型，以识别拉氏图（Ramachandran）异常值。
- 在 296 K 条件下，使用 10 × 5 µm（高斯轮廓的半高全宽）的光束尺寸收集衍射数据。采用能量为 12.8 keV、通量为 2.2 · 10¹² 光子/秒的 X 射线。11 光子 · 秒-1 使用 Pilatus 6M 混合像素探测器在衰减光束中记录衍射图样。
9. 数据评估
- 辐射损伤
- 使用 Owen 描述的方法分析衍射强度随时间的衰减 等38为此，计算 I/σ(I) 的总和（由 XDS 提供）33每个评估的衍射数据集（连续2个衍射图样）所有索引反射的）作为参考值。使用 bash 脚本 "ISigma.sh" 来自补充材料。
- 将每组数据集的衍射强度归一化至第一组数据集的平均衍射强度。
- 通过提取随时间变化的 Rmeas 值来分析 Rmeas 值的变化情况 正确。LP XDS 获得的文件33 （bash 脚本） "Rmeas.sh" 来自补充材料）。
- 晶体取向
- 确定欧拉角，以获取晶体晶格取向相对于实验室坐标系分布的信息。根据输出文件 XPARM 中给出的 XDS 取向矩阵计算欧拉角。39 使用软件 Matlab。使用 bash 脚本 "rotation_matrix.sh" 从XPARM文件中提取每个晶体的旋转矩阵。将输出文件作为输入在Matlab中使用Matlab函数rotro2eu.m（补充文件）计算欧拉角。
注意：Zarrine-Afsar 已发表关于该计算方法的详细描述 等40. - 将获得的欧拉角从弧度转换为度。将三个旋转平面（xy、xz 和 zy）的欧拉角以 10° 为间隔分组，并使用 Origin9 软件绘制图表。
- 确定欧拉角，以获取晶体晶格取向相对于实验室坐标系分布的信息。根据输出文件 XPARM 中给出的 XDS 取向矩阵计算欧拉角。39 使用软件 Matlab。使用 bash 脚本 "rotation_matrix.sh" 从XPARM文件中提取每个晶体的旋转矩阵。将输出文件作为输入在Matlab中使用Matlab函数rotro2eu.m（补充文件）计算欧拉角。
结果
环氧树脂是X射线芯片制备的优良填充材料。它成本低、加工简单且稳定，无需使用专用工具（图1）。通过加入40 wt%乙醇稀释以降低环氧树脂的黏度，有助于去除结晶井上方多余的树脂，从而形成清晰的X射线窗口。乙醇浓度过高会导致固化树脂出现缺陷。通过分析X射线芯片的横截面，我们确定两侧窗口的总厚度约为19 µm，与所用聚酰亚胺薄膜的标称厚度2 × 7.5 µm非常接近（图2）
采用毛细管阀机制，将结晶试验分隔至多个纳升级反应腔室中，每个腔室独立进行，具体方法如前所述41。这种“先储存后生成”的加样技术可避免因通道死体积造成的样品损失，且可完全手动操作，无需使用泵或其他流体驱动设备42。在加载水相样品前，芯片需先用氟化油预处理。预加载的氟化油与水相样品在油-水界面处产生的表面张力，导致界面两侧形成压力差。该拉普拉斯压力取决于界面的曲率半径和表面张力。为使体系能量最小化，界面会趋向于减小其表面积，这相当于在体积恒定的情况下最大化其主曲率半径。在较宽的通道中，低曲率界面所产生的拉普拉斯压力低于狭窄通道段中高曲率界面所产生的压力。因此，样品液柱优先进入并流经宽的旁路通道，而非通过狭窄的毛细阀限制区域。最后，以氟化油跟随样品推进，将各样品孔分隔为彼此独立的液滴。
在串联和并联的孔道布局中（图3），均实现了在流速高达1 mL/h时稳定且可靠的加样。在“串联”布局中，孔道入口与毛细阀狭窄段通过一条旁路通道依次连接31。相比之下，在“并联”布局中，两条独立的主通道分别连接所有孔道入口或所有毛细阀43。这两种布局设计此前已与组分调控相结合，用于筛选配方组成，这在蛋白质结晶中具有重要应用价值43,44。串联设计仅有两个液体端口，即一个入口和一个出口，液体端口较少，因此结构更简单，易于构建和操作。并联布局则具有4个液体端口，其中2个用于连接孔道的主通道，另外2个用于连通毛细阀，以便空气或过量油相排出。因此，加样可从主通道两侧同时进行。由于其旁路较短，并联布局在相同数量的孔道下整体流动阻力更低，因此更适用于孔道数量较多的放大装置。此外，样品孔的排列更为紧凑，有利于自动化成像操作。
无论是采用双层高度设计还是三层高度设计，两种布局均观察到样品孔完全加载。在双层高度设计中，样品孔与旁路通道高度相等。三层高度设计则需要第三个掩模、额外的SU8层以及一次对准步骤，以进一步确保样品孔高于前方的旁路通道。这种高度差异利用相同的毛细阀控原理促进样品液体进入孔内，该原理通过在狭窄处阻止流动实现控制。此处，较高的孔顶对应于前进弯月面更低的拉普拉斯压力，只有当孔完全充满后，阀的狭窄结构才会阻断进一步的流动，并将液体引导至旁路方向。然而，成功加载并不严格依赖于样品孔高于旁路通道，因为通过适当调节通道宽度，也可实现有效的毛细阀控。尽管如此，根据我们的经验，三层高度设计中的较高样品孔表现出显著更稳定可靠的加载性能，在所有三层设计中，其无缺陷加载的流速可达相应双层设计的十倍。该效应在并行布局中更为显著。
为了模拟气相扩散结晶动力学，利用聚酰亚胺箔的有限渗透性来控制随时间推移的水分蒸发。通过将液滴表面积与孔深关联，监测液滴体积随时间的变化，从而定量测定实验蒸发速率（图4C）。X射线芯片中结晶孔的蒸发过程并非线性进行，因为液滴表面积逐渐缩小，同时溶质浓度升高，导致蒸发速率随时间逐渐降低45。在串联布局结构的孔中，初始蒸发速率约为0.5 nL h-1，近似呈线性。
为了更好地理解结晶动力学，我们在微流控芯片的结晶孔中进行了动态光散射（DLS）测量。初始的DLS测量使用了键合在玻璃载片上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片，以在光散射实验中提供更优的光学性能。该芯片的孔尺寸与X射线芯片相同。PDMS的水蒸气渗透性高于X射线芯片中聚酰亚胺窗口的聚酰亚胺45。由于通量与距离呈线性关系，因此可以通过适当厚度的PDMS窗口来匹配聚酰亚胺窗口孔的蒸发轨迹。
DLS 结果显示，半径分布随时间发生变化（图 4A-B），表明 DLS 测量能够在观察到首批晶体颗粒之前检测到初始成核过程。该信息可用于在成核早期通过外部调节蒸发速率，从而控制过饱和度水平，实现每孔中单晶的成核与生长46。
X射线芯片被固定在3D打印的适配器上，该适配器用于PETRA III同步辐射P14光束线EMBL线站的SBS兼容板式测角仪图 5A）。或者，可使用较小的3D打印框架将X射线芯片安装到标准光束线测角仪上21. 仙茅蛋白晶体的尺寸为 10 - 20 µm (图 5B）并衍射至2.0 Å的分辨率（图5C）。如预期所示，来自X射线芯片的两层薄聚酰亚胺箔窗所产生的X射线背景贡献仅限于聚酰亚胺聚合物在11 Å（2θ ~ 5°）和 33 Å（2θ ~ 1.7°) 对应于0.97 Å的X射线波长。这两个环不会干扰数据处理。共收集了83个甜蛋白（thaumatin）晶体的完整数据集，每个晶体在每帧1°旋转下记录了10张衍射图样。甜蛋白数据集的数据处理与精修参数，以及统计信息已列出，并与同时收集的另外两个葡萄糖异构酶（glucose isomerase）和硫氧还蛋白（thioredoxin）数据集进行了比较 原位 列于 表3 和 表4.
通过将硫胺素蛋白酶（thaumatin）数据集分为五个子数据集（每个子集使用两张衍射图样以保持数据完整性），研究了归一化衍射强度随时间的衰减情况。如图6B所示，衍射能力从第一个子数据集开始下降，在第四个子数据集中已低于50%。因此，各子数据集的Rmeas值也随时间逐渐升高，表明在数据收集中出现了X射线辐射损伤。我们推测，在X射线照射过程中产生的自由基会迅速降解同一反应腔室内邻近的晶体。例如，在一种相关实验方法中，晶体被分散分布于聚酰亚胺夹层中更大的区域，此类次级X射线损伤则较不明显21。为最小化整体X射线损伤，在室温下应仅从特定晶体收集少量衍射图样。此外，微流控芯片的每个腔室应仅暴露一个单一蛋白质晶体。尽管如此，所有使用处理后数据集精修的结构模型均表现出优良的立体化学性质和合理的统计参数（表4）。此外，所有最终的电子密度图质量均非常高。
在以往基于X射线透明芯片的晶体学研究中，必须人为操控晶体的取向与排列，以获得晶体取向的随机分布40，或依赖晶体在液层中的运动实现该目的21。为了评估本实验方案所述X射线透明微流控芯片中晶体的取向，我们确定了所有暴露晶体相对于实验室坐标系的晶胞取向。对于双锥形的甜蛋白（thaumatin）晶体，观察到轻微的取向偏好（图7A），而葡萄糖异构酶晶体则呈现出较宽泛的取向分布（图7B）。我们推测，在纳米尺度上，大多数材料表面具有显著的粗糙度，因此晶体可在表面自发成核，并以显著降低的取向偏差随机取向。这种微小的晶体核可能被固定在某一取向上，并在后续生长过程中保持相对于表面法线方向不变，持续生长至合适尺寸。事实上，表面诱导的晶体成核长期以来一直是晶体学家面临的问题——在尝试将附着于表面的晶体用环状工具挑起时，极易损伤晶体。而在此，我们可直接利用此类晶体进行衍射数据收集。然而，该系统存在特定限制：硫氧还蛋白（thioredoxin）晶体在xy、xz和yz平面均表现出对特定取向的强烈偏好（图7C）。这些实例表明，晶体取向分布不仅取决于生长环境，还与晶体形态有关。硫氧还蛋白晶体呈细长形状，倾向于沿特定取向生长；而四方双锥形的甜蛋白晶体或正交晶系的葡萄糖异构酶晶体则未表现出此类行为。但在所有情况下，即使存在取向偏好，晶体可实现的旋转范围仍足以充分覆盖倒易空间，从而获得所有被研究蛋白的完整数据集。因此，在选择用于X射线照射的晶体时，无需采取额外措施。
图1：微流控X射线芯片制备示意图。 （1）将SU-8滴涂于硅基底上，并通过旋涂获得所需厚度的涂层。（2）通过掩膜对光刻胶进行紫外光曝光。（3）随后依次用PGMEA和异丙醇洗涤，去除未曝光区域的光刻胶，从而得到（4）用于后续复制步骤的SU-8母版。（5）将PDMS浇注到母版上，（6）固化后从SU-8母版上剥离，形成PDMS模具。（7a）在PDMS模具上滴加环氧胶，（7b）将活化的聚酰亚胺薄膜与环氧树脂进行化学键合。（8）固化后，将带有图案化薄环氧层的聚酰亚胺薄膜从PDMS模具上剥离。（9）最后一步，用第二片聚酰亚胺薄膜封合装置，得到封闭的低X射线背景微流控芯片。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 最终芯片的实物照片（左）及其横截面显微图像。中间为一个典型的通道片段，右侧为来自两个不同芯片的结晶微孔。箭头指示测量的距离。所有尺寸单位均为 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：从顶部和侧面观察的结晶井结构示意图，[A] 为并行布局或 [B] 为串行布局，尺寸以 µm 标注。 典型的通道高度为：50 µm 旁路，50–60 µm 结晶井，5–10 µm 毛细阀，对应的井体积约为 2.5 nL（并行布局）和 8 nL（串行布局）。使用食用染料展示了典型的井加载行为。芯片先用含 12 wt% 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇的 FC-43 预填充，然后将食用染料注入储存井中。白色箭头指示流动方向。加载后器件的概览图像显示所有井均无缺陷地完成加载，表明样品加载的可靠性。并行布局以三级高度设计示意，其中结晶井高于旁路；而串行布局以两级高度设计表示，井与旁路高度相等。加载过程中典型流速约为 150 µL/h，但在三级高度设计中，流速高达 1 mL/h 时仍可实现无缺陷加载。请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：结晶井随时间变化的原位动态光散射（in situ DLS）。 [A] 结晶井的显微图像序列。储存的液滴因水分随时间蒸发而持续缩小。4 小时后可首次观察到甜蛋白（thaumatin）微晶。[B] 在与 [A] 相同的结晶过程中，通过动态光散射（DLS）测得的甜蛋白颗粒对应的流体动力学半径分布。约 1–2 小时后可观察到第二个半径组分的形成，表明初始成核事件的发生。[C] 两个参考液滴体积因蒸发失水随时间推移而减少的代表性曲线。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：原位 衍射数据收集。 [A] 通过3D打印的适配器（蓝色）将单个微流控芯片安装在平板测角仪上。[B] 在P14线站，通过线内显微镜成像观察微流控芯片中甜蛋白（thaumatin）晶体在X射线照射下的状态。[C] 甜蛋白晶体的衍射数据记录至2.0 Å的分辨率，背景信号极低。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：在微流控芯片中于室温下记录的甜蛋白晶体衍射数据的评估。 [A] 仅使用第1-2帧数据集精修的甜蛋白模型的电子密度图（蓝色轮廓线，1.5 σ）。[B] 甜蛋白晶体衍射强度随X射线剂量的衰减情况。[C] Rmeas值随X射线剂量的变化。[B]和[C]中的箱线图显示了四分位数（上四分位数75%，中位数50%，下四分位数25%）以及均值，须线表示95%置信区间，反映了所有受照射晶体（n = 83）的衍射强度和Rmeas值的衰减趋势。请点击此处查看该图的高清版本。
图7：微流控芯片箔中晶胞取向相对于实验室坐标系的分布情况。 [A] 双锥形甜蛋白晶体在xy平面（蓝色）、xz平面（绿色）和yz平面（红色）均表现出广泛的取向分布，覆盖范围接近180°。[B] 葡萄糖异构酶同样表现出较宽的取向分布，而[C] 硫氧还蛋白则对某些特定取向表现出明显偏好。请点击此处查看该图的高清版本。
| SU8层 | 旋涂 | 预烘烤 | 暴露 | 后烘烤 |
| [65 / 95 °C] | [65 / 95 °C] | |||
| 1st 层：孔板 | 1000 RPM | 0 / 10 分钟 | 200 mJ/cm2 | 1 / 4 分钟 |
| 15 µm SU8-3010 | ||||
| 2nd 层：Bypass | 2000 RPM | 0 / 16 分钟 | 220 mJ/cm2 | 1 / 5 分钟 |
| 35 µm SU8-3025 | ||||
| 3rd 层：瓣膜 | 3000 RPM | 0 / 3 分钟 | 150 mJ/cm²2 | 1 / 2 分钟 |
| 5 µm SU8-3005 |
表1：三层平行X射线芯片设计的SU8工艺示例。 这种层序将允许浇铸用于X射线芯片制造的PDMS模具。在原型制作过程中若需直接对PDMS进行 molding，应在制作母模时反转层序，从第3层开始rd 以完成 1st 层替代。
| 蛋白质 | 蛋白质浓度 | 蛋白质缓冲液 | 沉淀剂 | 空间群，PDB 条目 | 消光系数 [M-1 cm-1] |
| 甜蛋白（Thaumatococcus daniellii） | 40 mg mL-1 | 50 mM Bis-Tris, pH 6.5 | 1.1 M 酒石酸钠, 50 mM Tris, pH 6.8 | I4222, 1LR2 | 29420 |
| 葡萄糖异构酶（Streptomyces rubiginosus） | 25 mg mL-1 | 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.0 | 100 mM Bis-Tris, 2.7 M 硫酸铵, pH 5.7 | I222, 4ZB2 | 46410 |
| 硫氧还蛋白（Wuchereria bancrofti） | 34 mg mL-1 | 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0 | 27.5 % PEG1500, 100 mM SPG 缓冲液, pH 6.3 | P41212, 4FYU | 24075 |
表2：所制备蛋白质晶体的结晶条件、空间群，包括消光系数和pdb代码。
| 蛋白质 | 每颗晶体的曝光次数 | 每颗晶体的衍射图样数量 | 每次曝光的振荡范围 [°] | 曝光时间 [ms] | 分子置换所用PDB编号 |
| 甜蛋白（Thaumatococcus daniellii） | 103 | 10 | 1 | 40 | 1LR2 |
| 葡萄糖异构酶（Streptomyces rubiginosus） | 69 | 100 | 0.1 | 80 | 4ZB2 |
| 硫氧还蛋白（Wuchereria bancrofti） | 68 | 10 | 1 | 40 | 4FYU |
表3：X射线衍射数据收集参数。
| 数据收集统计a | thaumatin （第1-20帧） | 葡萄糖异构酶（第1-100帧） | 硫氧还蛋白 （第1-10帧） |
| 光束线 | P14 | ||
| 波长 [Å] | 0.96863 | ||
| 空间群 | P41212 | I222 | P42212 |
| 晶胞参数：a = b, c [Å] | 58.62, 151.48 | 93.91, 99.60, 103.04 | 58.45, 151.59 |
| 晶体数量 | 101 | 41 | 34 |
| 总摆动角度 [°] | 10 | 10 | 10 |
| 分辨率 [Å] | 30.1.1989 (1.95 – 1.89) | 30.1.1975 (1.80 – 1.75) | 30.3.2000 (3.20 – 3.00) |
| 温度 [K] | 296 | 296 | 296 |
| R p.i.m.b | 7.5 (25.5) | 8.8 (28.0) | 9.1 (33.2) |
| 测量的衍射点 | 1553200 | 690000 | 1111196 |
| 唯一衍射点 | 21850 | 48942 | 44449 |
| 平均 I/σ(I) | 6.07 (1.78) | 5.85 (1.66) | 4.08 (1.47) |
| Mn(I) 半集相关系数 CC(1/2) | 96.2 (72.2) | 95.8 (68.2) | 97.9 (75.3) |
| 完整度 [%] | 99.8 (100.0) | 100.0 (99.9) | 99.9 (100.0) |
| 冗余度 | 71.1 | 14.1 | 25 |
| 结构精修统计 | |||
| 分辨率范围 [Å] | 1/30/1989 | 1/30/1975 | 3/30/2000 |
| R / Rfree [%] | 18.8/23.9 | 18.1/20.5 | 18.9/23.1 |
| 蛋白质原子数 | 1550 | 3045 | 1129 |
| 水分子数 | 51 | 111 | 164 |
| 配体分子数 | 20 | 0 | 0 |
| 均方根偏差 | |||
| 键长 [Å] | 0.02 | 0.026 | 0.01 |
| 键角 [°] | 2.04 | 2.22 | 1.43 |
| B因子 [Å2] | |||
| 蛋白质 | 22.6 | 20 | 50 |
| 水 | 25.1 | 27.1 | 29.7 |
| 配体 | 20.4 | ||
| Ramachandran 图分析 | |||
| 最适构象区 [%] | 97.67 | 95.32 | 96.13 |
| 允许区 [%] | 2.44 | 4.16 | 3.64 |
| 宽松允许区 [%] | 0.49 | 0.52 | 0.23 |
| a：括号中的数值对应于最高分辨率区间。 | |||
b：( )，其中 I (hkl) 为 hkl 衍射点的平均强度，Σhkl 表示对所有衍射点求和，Σi 表示对衍射点 hkl 的 i 次测量求和。 | |||
表4：从甜蛋白、葡萄糖异构酶和硫氧还蛋白获得的数据集的数据收集统计信息。
补充文件 1：chip_geometry.dwg。 所用芯片几何结构的 CAD 文件。请点击此处下载该文件。
补充文件 2：goniometer_adapter.stl。 指定X射线芯片测角仪适配器的STL文件。请点击此处下载该文件。
补充文件 3：xds.sh。 用于为 XDS 处理衍射数据片段生成输入文件的 Bash 脚本。请点击此处下载该文件。
补充文件 4：xscale.sh。 用于合并衍射数据子集并生成 HKL 文件的 Bash 脚本。请点击此处下载该文件。
补充文件 5：ISigma.sh。 用于从所有独立子集中提取 ISigma 值的 Bash 脚本。请点击此处下载该文件。
补充文件 6：Rmeas.sh。 用于从所有单个子集中提取 Rmeas 值的 Bash 脚本。请点击此处下载该文件。
补充文件 7：rotation_matrix.sh。 用于准备输入文件的 Bash 脚本，以便在 Matlab 中通过旋转矩阵计算欧拉角。请点击此处下载该文件。
讨论
我们制备用于 原位 使用环氧树脂作为填充材料、聚酰亚胺薄膜作为窗口材料进行X射线衍射。我们的工艺在先前X射线芯片设计的基础上，优化了制造过程的多个步骤16,21我们通过减少窗口厚度，降低了背景散射，同时因所需工艺步骤减少而简化了制备过程。 原位 使用所述方案进行结晶具有显著优势。该方法可在室温下收集衍射数据，从而无需使用冷冻保护剂，而冷冻保护剂在某些情况下可能引入蛋白质结构的人工假象。此外，由于可避免将晶体从其原始环境中转移，晶体不会受到物理应力的影响。通过该流程，晶体能够保持最高品质，且免受任何处理带来的损伤。
根据我们的经验，实验方案中最关键的步骤集中在控制结晶过程。获得适合X射线衍射的、具有合适尺寸的晶体所需参数必须通过实验经验确定，不能直接从气相扩散实验中照搬。即使使用相同浓度的蛋白质和沉淀剂，在不同的芯片中，或有时在同一芯片的不同孔中，也并不总能形成晶体。这表明所有影响晶体成核与生长的因素都应被仔细考虑，例如母液组成或结晶动力学（通过蒸发轨迹体现）。由于较大的晶体可产生更高分辨率的衍射数据，因此理想情况下应培养出足够大的晶体。晶体成核与生长过程可通过动态光散射（DLS）测量进行监测。将激光聚焦于芯片内约50 µm厚的结晶腔室内部可能具有挑战性，通常需要仔细的手动对准。当使用深度超过100 µm的孔时，激光自动对准变得可行且可靠，从而可通过自动化采集方案监测多个孔。
基于聚酰亚胺的X射线芯片产生的背景信号极低，我们通过解析三种模式蛋白的结构，证明了这些器件适用于常规X射线衍射数据收集。与先前使用更大尺寸蛋白质晶体及传统X射线数据收集方法所达到的分辨率相比，芯片上获得的最佳分辨率存在差异。这种差异可能由多种因素导致，进一步优化结晶条件或可改善衍射质量。已成功实现数据收集 原位 分辨率达到1.8 Å，使用尺寸小于30 µm的晶体收集衍射数据。对甜蛋白（thaumatin）衍射数据的详细分析提供了关于辐射损伤的见解。为限制辐射损伤的程度，应在微流控装置的每个腔室中仅暴露一颗单晶，以避免自由基向邻近晶体扩散并造成影响。为提高数据采集速度，未来应实现该过程的自动化。
由于晶体形态的原因，在某些情况下可能会出现择优取向。例如硫氧还蛋白数据集就出现了这种情况，其晶体相对于芯片窗口具有明显的择优取向。即便如此，我们仍能够收集到完整的衍射数据集。如果晶体在芯片中表现出择优取向，特别是当相应的空间群对称性较低时，应在数据收集过程中监测数据集的完整性，以确保收集到足够数量的衍射图谱。
当采用泵浦-探测方法进行光诱导反应时，使用这些芯片可直接开展时间分辨研究。需要明确泵浦激光在聚酰亚胺薄膜中的透光性能，或者可选用光学透明的聚酰亚胺或环烯烃共聚物（COC）。目前的微流控结构不支持晶体生长后进行底物混合实验。然而，我们预计所描述的X射线芯片制备方案同样适用于此类混合设计，可用于时间分辨X射线衍射以及散射实验方法19。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了PIER种子基金PIF-2015-46、德国联邦教育与研究部（BMBF）资助项目05K16GUA和05K12GU3，以及德国研究基金会（DFG）卓越集群“汉堡超快成像中心——原子尺度上物质的结构、动力学与控制”的支持。隶属于自由电子激光科学中心的作者的工作由亥姆霍兹协会通过项目导向资金资助。同步辐射MX数据在PETRA III储存环（德国汉堡DESY）上由EMBL汉堡运行的P14光束线收集。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SU-8 3000 系列 | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | 光刻胶 |
| PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | 显影剂 |
| 异丙醇 | 溶剂 | ||
| 乙醇 | 溶剂 | ||
| 环氧胶 | UHU | Plus Schnellfest 5 min | 环氧胶 |
| PDMS | 道康宁 | Sylgard 184 | 硅橡胶 |
| 聚酰亚胺薄膜（Kapton 薄膜） | 杜邦 / American Durafilm | HN 级，30 号规格（7.5 μm） | 聚酰亚胺薄膜 |
| APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | 化学试剂 |
| GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | 化学试剂 |
| Cytop CTX-109AE | 旭硝子株式会社 | Cytop CTX-109AE | Cytop 氟聚合物涂层 |
| CT-Solv 100E | 旭硝子株式会社 | CT-Solv 100E | Cytop 氟系溶剂 |
| HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | 氟化油 |
| AutoCAD | 欧特克公司 | AutoCAD | CAD 软件 |
| 活检打孔器 | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
| 光刻掩模 | JD Photo Data | ||
| 3 英寸晶圆 | University Wafer | 硅晶圆 | |
| 掩模对准器 | SÜSS MicroTec | MJB4 | 掩模对准器 |
| PDMS 混合器 | Thinky | ARE-250 | |
| 等离子体处理仪 | Diener electronic | Zepto | |
| 索马甜 | Sigma Aldrich | T7638 | 蛋白质 |
| 葡萄糖异构酶 | Hamton Research | HR7-102 | 蛋白质 |
| Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | 化学试剂 |
| 酒石酸钠 | 默克 | 106664 | 化学试剂 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | 化学试剂 |
| HEPES | Carl Roth | 6763.2 | 化学试剂 |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | 208337 | 化学试剂 |
| 硫酸铵 | Sigma Aldrich | A4418 | 化学试剂 |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | 化学试剂 |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | 1064060250 | 化学试剂 |
| PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | 化学试剂 |
| SPG 缓冲液 | Jena Bioscience | CSS-389 | 化学试剂 |
| SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS 仪器 | |
| Nanodrop | 赛默飞世尔科技 | 分光光度计 | |
| 离心机 | Eppendorf | ||
| Ultimaker2 | Ultimaker | 3D 打印机 | |
| Form2 | Formlabs | 3D 打印机 | |
| Amicon 滤膜 | Sartorius Stedim | 0.2 µm 滤膜 | |
| 管路 | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE 管，内径 0.3 mm × 外径 0.76 mm |
| 注射器 | BD | 309628 | 1 ml 鲁尔锁头 |
| 针头 | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27G×5/8" |
参考文献
- Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K. Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).
- Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K. Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).
- Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals. Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).
- Huang, C. Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).
- von Dreele, R. B. Multipattern Rietveld refinement of protein powder data. J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Gati, C. Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , Dissertation, Hamburg (2015).
- Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- White, T. A., et al. CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography. J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).
- Perry, S. L., et al. A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction. Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).
- Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).
- Heymann, M., et al. Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction. IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).
- Schubert, R., et al. A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution. IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 5, 3309(2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Cohen, A. E., et al. Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).
- Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).
- Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index. J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).
- Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements. Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).
- Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles. Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).
- Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks. J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).
- Walker, J. M. The Proteomics Protocols Handbook. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
- Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).
- Murshudov, G. N., et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Owen, R. L., et al. Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography. Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).
- Kabsch, W. Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns. J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).
- Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
- Aghvami, S. A., et al. Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices. Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).
- Shemesh, J., et al. Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).
- Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition. Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).
- Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579(2017).
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