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确定用花青染料染色的DNA是否可被限制性酶消化

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DOI：

10.3791/57141

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2018年2月2日

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1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

本文内容

摘要

对DNA分子进行荧光显微镜染色可使科研人员在实验过程中观察到它们。在本方法中，DNA分子首先用荧光染料进行预染色，然后用对甲基化和非甲基化敏感的限制性内切酶进行消化。

摘要

荧光显微镜下DNA的可视化依赖多种染料，例如氰基染料。这些染料因其对DNA具有高亲和力和高灵敏度而被广泛使用。为了在实验结束后判断DNA分子是否保持全长，需要采用一种方法，通过限制性内切酶消化DNA来确认染色后的分子是否完整。然而，染色后的DNA可能会抑制酶活性，因此需要一种方法来确定哪些限制性内切酶可用于荧光染料标记的DNA。本方法中，DNA与氰基染料在夜间孵育，以使染料与DNA充分平衡。随后，将染色的DNA用限制性内切酶进行消化，上样至凝胶并进行电泳。通过将实验所得的DNA消化条带与in silico（计算机模拟）预测的消化图谱进行比较，以评估限制性内切酶的活性。如果观察到的条带数量与预期一致，则表明反应完全；条带数量多于预期提示部分消化，少于预期则表明消化不完全。该方法的优势在于操作简便，并且仅需科研人员常规用于限制性内切酶分析和凝胶电泳的设备。该方法的局限性在于大多数科研人员可获得的酶为商业化酶；但理论上，任何限制性内切酶均可用于此方法。

引言

TOTO 系列（TOTO-1、YOYO-1、POPO-1、BOBO-1、TOTO-3、YOYO-3、POPO-3 和 BOBO-3；表1）广泛应用于需要对 DNA 进行可视化的多种实验中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。由于其量子产率高、灵敏度高以及对 DNA 分子具有强亲和力，花青素二聚体染料家族被广泛应用18,19,20。花青素二聚体染料对双链 DNA 具有高度选择性，当其插入 DNA 后，荧光强度可增强 100 至 1000 倍21。吡啶𬭩类染料（YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3 和 TOTO-3）的发射波长比相应的喹啉𬭩类染料（BOBO-1、POPO-1、BOBO-3 和 POPO-3）更短（表1）22。此外，花青素二聚体插入 DNA 后的量子产率较高（0.2–0.6）22。然而，在利用酶来测定已用荧光染料染色的 DNA 分子的甲基化谱型2或拉伸状态23时，需要一种方法来确定哪些酶能够消化染色后的 DNA。任何能够插入 DNA 的染料，或任何能够对 DNA 底物产生可辨识模式的酶，均可用于该方法。

Meng et al. 首次通过凝胶电泳，使用多种不同的染料测定预染DNA的消化速率24。Maschmann et al. 进一步深入研究了TOTO系列染料。两者均测定了染色DNA的消化速率，以判断用特定染料染色的DNA是否可被限制性内切酶消化25。其他方法则利用光镊26或核磁共振（NMR）27研究染料插入DNA后的结合效应。这些方法均需要专用设备；而本方法则可利用大多数分子生物学实验室常见的设备，判断染料是否干扰限制性内切酶消化反应。

此外，在其他测量特定分子长度的方法中，光学作图技术通过将未染色的DNA分子在表面拉伸并进行消化，以确定片段的伸展程度和大小。已有研究表明，染料的嵌入会导致荧光染色的DNA分子轮廓长度增加，且根据所用染料的不同，其轮廓长度也有所差异21。该方法已被应用于多种基因组的研究1,3,4,6,13,28,29,30,31。然而，若分子预先染色，则根据染料和酶的种类不同，酶可能无法切割已被特定染料染色的DNA。因此，本方法旨在确定经特定染料染色的DNA是否仍可被酶消化。此外，根据染料的种类及其浓度，DNA条带在凝胶中的迁移速率会比天然DNA更慢，这是由于染料插入碱基对之间时导致DNA骨架部分解旋，从而影响其迁移能力32。

然而，这些染料有时会部分或完全抑制某些限制性内切酶的作用7,24。这可能是由于荧光染料与DNA结合后引起DNA结构改变，从而阻碍了酶对其特异性序列的识别。了解这些染料对限制性内切酶的影响，有助于需要分析DNA甲基化谱或染色DNA片段的实验。

在本方法中，DNA 用感兴趣的荧光染料染色后，经限制性内切酶消化。随后将 DNA 在凝胶中进行电泳，成像并测定限制性内切酶的消化率。限制性内切酶的选择依据其在凝胶上的切割模式。条带过多会导致 DNA 条带重叠，而条带过少则无法完整反映 DNA 分子的情况。因此，需找到一个合适的平衡点，以确定消化后 DNA 分子的图谱；该平衡点取决于所用的 DNA 和酶。该方法的优点在于其简便性，仅需使用限制性消化和凝胶电泳所需的常规设备。

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方案

1. 染料、缓冲液和琼脂糖凝胶的制备

  1. 准备用于DNA染色或消化已染色DNA的以下溶液。
    1. 使用10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）在量筒或容量瓶中配制1x TE（Tris-HCl与EDTA）缓冲液。室温（18 - 25 °C）保存。
    2. 分别分装每种染料：TOTO-1、YOYO-1、POPO-1、BOBO-1、TOTO-3、YOYO-3、POPO-3、BOBO-3（见表1）。将4 µL的1 mM染料用移液器加入避光的棕色或黑色1.5 mL离心管中，再加入36 µL的1x TE缓冲液，用移液器混匀；此浓度可得100 µM染料溶液（总体积40 µL）。对每种染料均完成此步骤。4 °C保存。
      注意：避免染料暴露于光线下，以防发生光漂白或降解。
    3. 配制缓冲液1：含10 mM Bis-Tris-Propane-HCl、10 mM MgCl2和100 µg/mL牛血清白蛋白（BSA）。配制缓冲液2：含50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2和100 µg/mL BSA。配制缓冲液3：含50 mM醋酸钾、20 mM醋酸-Tris、10 mM醋酸镁和100 µg/mL BSA。每种酶需使用其中一种特定缓冲液才能发挥功能。
  2. 准备用于凝胶电泳的以下溶液。
    1. 通过将0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青蓝和15% Ficoll溶于dH2O中，配制6x上样染料。室温保存。
    2. 配制0.7%琼脂糖凝胶：在锥形瓶中称取0.07 g高熔点（HGT）琼脂糖，加入100 mL 1x TAE缓冲液，并在瓶口倒置一个烧杯。
      1. 将溶液置于加热板上加热，直至瓶底开始产生气泡并上浮至液面。
      2. 将溶液从加热板上取下，冷却至用手可直接触摸瓶壁为止，然后将凝胶倒入带有梳子的24.5 cm × 21.8 cm凝胶模具中，以形成加样孔。
      3. 用移液器枪头刺破靠近梳子或凝胶表面的气泡，并使凝胶静置至少15分钟以完全凝固。凝胶可用保鲜膜包裹后于4 °C冰箱中保存1周，以防脱水或污染。有关凝胶电泳操作的更多信息，请参见Lee et al.33。
        注意：使用具有30个独立加样孔的梳子。每个加样孔宽度应为4.5 mm，深度为2 mm。加样孔的高度取决于倒入模具中的凝胶体积。
    3. 使用40 mM Tris-HCl、20 mM乙酸和1 mM EDTA配制1x TAE（Tris-醋酸-EDTA）缓冲液。室温（18 - 25 °C）保存。

2. 染色DNA的制备

  1. 使用不同等分试样的染料对λ DNA（300-800 ng）进行染色。每种染料（表1）将测试六种不同浓度，每种限制性内切酶共进行48个反应。以下步骤描述了一个反应的设置过程（图1）。
    1. 用1× TE缓冲液将λ DNA稀释至100 ng/µL，于4 °C保存。配制总体积为300 µL的溶液。
    2. 对未甲基化的λ DNA进行染色。根据酶切后预期出现的每条条带，估计每条带需要75–100 ng DNA。加入适量染料，使染料终浓度分别为1.9 µM、3.8 µM、19.4 µM、32.2 µM、48.3 µM和63.5 µM / 100 ng DNA。
    3. 在4 °C下孵育过夜（15 h–18 h）。
    4. 保留一个反应不加染料作为对照25。
      注意：消化反应应使用未甲基化的DNA。甲基化敏感的限制性内切酶无法切割DNA中的甲基化区域，可能导致消化不完全的假象。

3. 限制性内切酶反应体系的制备

  1. 用限制性内切酶消化染色的DNA，以确定该酶是否能够消化预染色的DNA（图1）。
    1. 次日，向样品中加入20 U限制性内切酶、3 µL相应的缓冲液（表2）以及去离子、高压灭菌并过滤的水，总体积为30 µL。对于每种酶切反应，应选择制造商官网推荐的、具有最高切割效率的缓冲液。
    2. 将反应体系置于水浴中，在Maschmann et al. 所用6种酶各自最适酶活性温度下孵育2–4小时（表2）25。
    3. 加入2 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）以终止反应。

4. 从琼脂糖凝胶中电洗脱染色的DNA

  1. 取下24.5 cm × 21.8 cm凝胶模具的侧板（步骤1.2.2），将凝胶放入凝胶电泳槽中。向槽中加入2.5 L的1×TAE缓冲液。小心移除凝胶中的加样梳，使加样孔暴露可用33。
  2. 将限制性内切酶反应液滴加到塑料膜上，并将每个反应液与6×上样染料混合。对于每份反应溶液，每5–6 µL DNA溶液加入1 µL的6×上样染料（终浓度为1×）。然后将反应液（含上样染料，<18 µL）上样至加样孔中。
  3. 取1 µL 1 kb DNA ladder、9 µL 1×TE缓冲液和2 µL 6×上样染料混合。将该混合液上样至其他样品两侧的加样孔中。
  4. 用深蓝色或黑色纸张或布料覆盖电泳槽。将电泳槽连接至电源，将电源设定为30 V，过夜运行（15–20 h）。电泳过程中关闭光源，以防止标记的DNA发生光解。
  5. 次日早晨关闭电源。用托盘取出凝胶，转移至含有45 µL溴化乙锭和1 L 1×TAE缓冲液的容器中。将容器置于室温避光处保存，或用铝箔包裹以避免光照。室温下染色至少45分钟。
    注意：使用溴化乙锭时需佩戴手套并佩戴护目镜。清洗含有溴化乙锭溶液的容器或丢弃凝胶时，请参照所在地区的废弃物处理指南处理使用过的溴化乙锭；此外，也可使用其他染料替代溴化乙锭。

5. 琼脂糖凝胶成像

  1. 将凝胶置于蓝光透射仪上，该仪器在400-500 nm范围内发出最强光。使用连接到成像系统的相机拍摄图像。
    警告：开启光源前，务必使用透射仪的防护盖并佩戴护目镜。
    注意：此步骤也可使用任何紫外光源或标准凝胶扫描仪完成。
  2. 通过将文件拖拽至ImageJ状态栏，在ImageJ中查看图像，图像将自动弹出。
  3. 通过将凝胶上的条带与预期的in silico凝胶图谱进行比较，确定实验的消化率。计算消化率的方法是将实验中观察到的条带数量除以预期的DNA条带数量24,25。如果实验中消化后的DNA条带图谱与预期图谱一致，则消化率为1。如果图谱中的片段多于预期，则消化率大于1。如果图谱中的片段少于预期，则消化率小于1。

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结果

为了确定插入性染料是否会影响限制性内切酶对DNA的消化，必须遵循正确的操作步骤顺序（图1）。在DNA经染色并用特定酶消化后，可拍摄凝胶图像以确定片段的数量及其大小（图2）。为了评估酶的消化效率，需将预期可见条带的总数除以实际观察到的可见条带数。若预期条带数与实际观察到的条带数一致，则酶的效率等于1。若凝胶上的条带数多于预期，则该比值大于1，表明发生了部分消化。若条带数少于预期，则该比值小于1，表明消化不完全。在图2a中，第3和第4泳道显示条带的迁移率降低，导致条带向加样孔方向偏移。而在第1和第2泳道中，染料用量对条带迁移率无明显影响，因此条带与对照组一致。在图2a中，第5和第6泳道显示出比对照组更多的条带，表明发生了部分消化，说明染料影响了该酶在其识别位点对DNA的切割。在图2b

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讨论

为了消化荧光标记的 DNA (图 1)，需要进行一系列步骤。首先，DNA 需用荧光染料染色过夜。DNA 也可与氰化物二聚体孵育较短时间；然而，Carlsson et al. 发现，由于染色不完全，每种大小的 DNA 会出现双条带现象20。为解决此问题，可将 DNA 过夜染色，以避免双条带的产生。这是本实验方案中的关键步骤。如果染料孵育时间不足，染料与 DNA 的结合可能未达到平衡，从而导致双条带模式。若出现此情况，应延长 DNA 与染料混合物的平衡时间。

接下来，将限制性内切酶加入DNA-染料混合物中，在每种酶特定的温度下消化2 - 4小时。对于甲基化敏感的酶，DNA必须处于非甲基化状态。如果DNA被甲基化，则甲基化区域会抑制限制性内切酶对DNA的切割。此外，反应必须在适合该酶的缓冲液和温度条件下进行孵育。每种酶都附有推荐的缓冲液列表以及其在不同缓冲液中的活性数据。应尽可能选择酶活性为100%的缓冲液。关于温度，务必确保孵育...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所（NIGMS）（项目编号：5605100122001）、内布拉斯加大学卡尼尔分校（UNK）暑期学生研究项目（SSRP）以及内布拉斯加大学卡尼尔分校本科生研究奖学金（URF）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
未甲基化λ DNANEBN3013S
YOYO-1ThermoFisher ScientificY3601
TOTO-1ThermoFisher ScientificT3600
POPO-1ThermoFisher ScientificP3580
BOBO-1ThermoFisher ScientificB3582
YOYO-3ThermoFisher ScientificY3606
TOTO-3ThermoFisher ScientificT3604
POPO-3ThermoFisher ScientificP3584
BamHINEBR0136S
PmlINEBR0532S
ScaINEBR3122S
EcoRI NEBR0101S
HindIIINEBR0104S
SmaINEBR0141S
TrisFisherBP152-1刺激性物质
EDTAFisherS316-212有毒
HClFisherS25358腐蚀性和刺激性
缓冲液1NEBB7201SNEB 1.1
缓冲液2NEBB7202SNEB 2.1
缓冲液3NEBB7204SNEB Cutsmart
高凝胶温度琼脂糖凝胶Lonza50041
乙酸FisherS25118危险品
蓝光透射仪Dark ReaderDR196需佩戴合适护目镜 
溴化乙锭Fisher15585011致癌物；其他替代品包括Nancy 520、Gel Red等
Cannon EOS Rebel T3I 相机Cannon
Apogee Model H4Biorad1704510
Power Pac Basic 电源供应器Biorad1645050 
FicollFisher ScientificBP525-25
溴酚蓝Fisher ScientificB-392
二甲苯青EastmenT1579

参考文献

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