一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

摘要

本实验的总体目标是提供一种高度可重复的技术，用于在缺血性脑卒中大鼠模型中进行血脑屏障破坏的体内评估。

摘要

缺血性脑卒中可导致血管源性脑水肿及继发的原发性脑损伤，其机制与血脑屏障（BBB）破坏有关。本研究建立并使用了诱导性缺血性脑卒中大鼠作为体内模型，以评估血脑屏障的功能完整性。通过分光光度法检测缺血损伤脑组织中伊文思蓝（EB）的含量，可为新型治疗策略的研发提供可靠依据。该方法结果可重复，且无需特殊设备，适用于任何实验室。本文提供了在大鼠缺血性脑卒中诱导后检测伊文思蓝外渗的可视化技术操作指南。

引言

由于血脑屏障（BBB）破坏所导致的血管源性脑水肿仍是缺血性卒中的重要并发症，并且是影响卒中患者生存率的主要因素^1,2。血脑屏障（BBB）由脑毛细血管内皮细胞（BCECs）构成，并包含特定的神经血管组分（例如，BCECs之间的紧密连接、周细胞、星形胶质细胞和神经元细胞³），在中枢神经系统（CNS）与外周血液循环之间形成一个特化的动态界面^4,5。缺血-再灌注损伤等损害可破坏BBB的功能完整性，导致循环中的白细胞继而侵入脑实质，最终引发脑部炎症和原发性脑损伤^6,7。为了精确检测卒中发生后BBB功能障碍，需要借助动物模型。这类模型对于研究潜在的病理生理机制以及开发新的神经保护策略具有重要意义。体外基于细胞培养的BBB模型已得到高度发展，并广泛用于BBB病理生理学的分子研究^8,9,10。然而，能够产生类似于人类临床状况下BBB缺血性损伤的体内动物模型，在此领域同样具有重要价值。伊文思蓝（Evans blue, EB）外渗的定量检测是一种被广泛认可且敏感的技术，已用于评估包括缺血性卒中在内的神经退行性疾病中BBB的完整性和功能^11,12,13,14。该方法成本低、可行性强、可重复，并且完全适用于任何实验实验室。其实施无需依赖其他方法所必需的高级设备，例如放射性示踪剂¹⁵或磁共振成像（MRI）¹⁶。本文全面展示了在缺血性卒中大鼠模型中利用EB外渗评估BBB功能的基本技术流程。

方案

所有操作均按照阿尔达比尔医科大学研究委员会关于动物实验的指南进行（伦理编号：IR.ARUMS.REC.1394.08）。在本可视化研究中，我们使用了来自伊朗德黑兰巴斯德研究所的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（300-350克）。

1. 麻醉与血流测定

1. 使用4%异氟烷诱导麻醉，并在手术期间通过一氧化二氮（70% v/v）和氧气（30% v/v）的混合气体中维持1-1.5%的异氟烷浓度以维持麻醉状态。
2. 将麻醉后的动物俯卧于反馈控制的加热毯上，并通过连接该加热装置的直肠探针将体温维持在37±0.5 °C。
3. 在双眼上涂抹少量眼用软膏，以防角膜干燥。
4. 使用电动剃刀剃除颅骨左侧手术区域的毛发，然后用浸有聚维酮碘溶液的纱布擦拭皮肤进行消毒；再用含70%乙醇的无菌纱布擦拭该区域，上述两步操作重复三个循环¹⁷。
5. 为实现镇痛，于手术区域皮下注射0.2 mL的0.5%布比卡因¹⁷。
6. 在颅骨上做一条长约1 cm的皮肤切口（从左眼外眦延伸至左耳根部），分离左侧颞肌以暴露颅骨。随后，在前囟外侧5 mm、后方1 mm处钻一小孔¹⁸，以便放置多普勒血流仪笔式探头的尖端。
7. 将大鼠由俯卧位转为仰卧位，然后将激光笔式探头插入先前钻好的颅骨盲孔中，以监测局部脑血流量（rCBF）。
8. 记录每只动物的基础rCBF值，并将其设定为100%。值得注意的是，一旦检测到rCBF下降超过80%，即开始中动脉闭塞（MCAO）操作^19,20。

2. 局灶性脑缺血的诱导

1. 剃除颈部区域的毛发，并用聚维酮碘溶液和70%乙醇对皮肤进行消毒。在手术部位皮下注射0.2 mL的0.5%布比卡因以进行镇痛¹⁷。
2. 在颈部腹侧做一条长约2 cm的手术切口，以暴露左侧颈总动脉（LCCA）。分离LCCA与其周围的筋膜及迷走神经，以显露颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）的分叉处。
3. 使用5-0丝线永久结扎LCCA或ECA，并游离ICA至翼腭动脉水平。
4. 在LCCA周围松松地打一个结（5-0丝线），然后用血管微夹暂时夹闭ICA。
5. 在先前放置的松结之前，于LCCA上做一个小切口，随后将一根4-0硅胶包被的尼龙线经此切口插入ICA管腔内，并收紧LCCA周围的结扎线以固定尼龙线，防止血液渗漏。
6. 移除ICA上的血管微夹，然后推进硅胶包被的管腔内纤维，直至观察到局部脑血流（rCBF）显著下降，表明大脑中动脉（MCA）起始段已被阻塞。缺血期结束（90分钟）后，通过撤出管腔内尼龙线开始再灌注²¹。

3. 颈静脉插管与伊文思蓝（EB）注射

1. 在颈部中线左侧做一长约1 cm的纵行切口，钝性分离浅层筋膜以暴露左侧颈外静脉（LGV）。用5-0丝线永久结扎LGV的头端，在静脉上松松地绕两道结扎线，然后用血管微夹暂时夹闭LGV的心端。
2. 在两道结扎线之间的LGV上做一小切口，将充满肝素化血清的导管插入静脉管腔内并推进约10 mm。随后收紧静脉周围的结扎线以固定导管并防止出血。注入少量血清以避免静脉塌陷。
3. 在再灌注期开始时，缓慢注射伊文思蓝染料（2% EB溶液，1 mL/kg），持续5分钟。随后用0.5 mL生理盐水冲洗导管，并从静脉中撤出注射导管^12,22。
4. 最后缝合颈部和头部切口，并腹腔注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡（IP），在再灌注期间每6-8小时重复给药一次，以提供术后镇痛¹⁷。
5. 腹腔注射5 mL预温的生理盐水，以在恢复笼中提供水合支持¹⁷。
6. 将动物置于配备温控和空调系统的专用恢复笼中，并监测其从麻醉状态恢复的情况。

4. 血脑屏障通透性的评估

1. 在再灌注24小时后，使用硫喷妥钠对动物进行深度麻醉。随后，在胸骨下方打一个小孔以打开胸腔。
2. 在右心房做一个小切口，通过左心室以110 mmHg的压力注入250 mL预热至37 ˚C的0.9%生理盐水，持续15分钟，冲洗循环系统中的EB，直至从心房流出的生理盐水变为无色。²³.
3. 立即从颅骨中取出大脑并放入脑切片矩阵中。分离嗅球和小脑，然后使用洁净的剃刀刀片沿中线将大脑右半球与左侧（损伤侧）分开。
4. 称取每个半脑的重量，分别加入2.5 mL磷酸盐缓冲液进行匀浆，再加入2.5 mL三氯乙酸（60%），使用涡旋振荡器混匀2分钟。
5. 将脑组织样本在1,322 × g条件下离心30分钟，并置于4 °C冰箱中冷却10分钟。
6. 使用上清液在610 nm波长下通过分光光度计测定EB的吸光度²³.
7. 根据标准曲线计算EB浓度，并以每克脑组织中的微克数（µg/g）表示结果。

5. EB 标准曲线的制备

1. 配制10份EB样品溶液，每份含1-10 µg EB溶于5 mL磷酸盐缓冲液中。
2. 使用分光光度计在610 nm波长下测定各样品的吸光度值。
3. 利用电子表格绘制散点图，以EB浓度为X轴，吸光度值为Y轴（图1）。
4. 为曲线拟合线性趋势线并显示其方程，然后利用该方程计算样品中EB的浓度。
5. 以每克脑组织重量所含EB的µg数（µg/g）报告EB外渗的最终结果。

6. 假手术操作

1. 对假手术组大鼠执行相同的手术操作（包括在颈部区域做切口和EB注射），但不进行大脑中动脉阻塞（MCAO）。

结果

假手术组大鼠右侧半球与左侧半球的伊文思蓝（EB）水平之间无显著差异（分别为 1.06 ± 0.1 µg/g 和 1.1 ± 0.09 µg/g）。如图2A-2B所示，短暂性缺血诱导（90 分钟缺血/24 小时再灌注）导致缺血组大鼠左侧半球 EB 水平显著升高（10.41 ± 0.84 µg/g，p <0.001），与假手术组大鼠相应半球相比具有显著差异。综上所述，这些结果表明，在正常情况下，EB 不能轻易穿过血脑屏障（BBB）进入脑实质，而脑缺血损伤则通过增加血脑屏障通透性，诱导 EB 渗出（图2A 和 2B）。

讨论

迄今为止，已有多种方法被用于评估血脑屏障损伤，包括放射自显影和放射性示踪剂检测^24,25、免疫荧光显微镜技术^26,27以及伊文思蓝（EB）外渗技术^20,23。伊文思蓝染料可强烈结合血清白蛋白，常被用作检测血管渗漏和量化血脑屏障破坏的示踪剂^11,28,29。作为一种广泛接受且可靠的方法，伊文思蓝外渗技术可直接评估受不同脑损伤（包括缺血性脑卒中）影响的血脑屏障完整性。

体内评估血脑屏障（BBB）可使研究人员研究缺血诱导的血管源性脑水肿可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）	Molekula	31216368	4年
Sprague–Dawley大鼠	伊朗德黑兰Pasture研究所		300-350g
伊文思蓝	Sigma-Aldrich	314-13-6
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	76-03-9	2年
盐酸布比卡因（0.5%）	Delpharm Tours		低于 25 °C
丁丙诺啡	Exir（伊朗）
碳酸钠	Sigma-Aldrich	497-19-8
氯化钠	Sigma-Aldrich	7647-14-5
磷酸氢二钠	EMD Millipore	231-448-7
氯化钾	Sigma-Aldrich	7447-40-7
乙醇	Sigma-Aldrich	64-17-5
硅胶（Xantopren）	Heraeus	EN ISO 4823
通用活化剂Plus	Heraeus	66037445
显微解剖镊	Stoelting	52100-41
弹簧剪	Stoelting	52130-00
手术剪	Roboz	52140-70
脑组织切片模具	Stoelting	51390
小动物麻醉机	Kent Scientific	SS-01
Power Lab系统	AD Instruments	ML880
激光多普勒血流仪	AD Instruments	ML191
加热反馈系统	Harvard Apparatus	72-7560
血管微夹	FineScience Tools	18055-03
5-0丝线缝合线	Ethicon	682G
4-0尼龙缝合线	Ethicon	EH6740G