本实验的总体目标是提供一种高度可重复的技术，用于在缺血性脑卒中大鼠模型中进行血脑屏障破坏的体内评估。
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摘要
摘要
缺血性脑卒中可导致血管源性脑水肿及继发的原发性脑损伤，其机制与血脑屏障（BBB）破坏有关。本研究建立并使用了诱导性缺血性脑卒中大鼠作为体内模型，以评估血脑屏障的功能完整性。通过分光光度法检测缺血损伤脑组织中伊文思蓝（EB）的含量，可为新型治疗策略的研发提供可靠依据。该方法结果可重复，且无需特殊设备，适用于任何实验室。本文提供了在大鼠缺血性脑卒中诱导后检测伊文思蓝外渗的可视化技术操作指南。
引言
由于血脑屏障（BBB）破坏所导致的血管源性脑水肿仍是缺血性卒中的重要并发症，并且是影响卒中患者生存率的主要因素1,2。血脑屏障（BBB）由脑毛细血管内皮细胞（BCECs）构成，并包含特定的神经血管组分（例如，BCECs之间的紧密连接、周细胞、星形胶质细胞和神经元细胞3），在中枢神经系统（CNS）与外周血液循环之间形成一个特化的动态界面4,5。缺血-再灌注损伤等损害可破坏BBB的功能完整性，导致循环中的白细胞继而侵入脑实质，最终引发脑部炎症和原发性脑损伤6,7。为了精确检测卒中发生后BBB功能障碍，需要借助动物模型。这类模型对于研究潜在的病理生理机制以及开发新的神经保护策略具有重要意义。体外基于细胞培养的BBB模型已得到高度发展，并广泛用于BBB病理生理学的分子研究8,9,10。然而，能够产生类似于人类临床状况下BBB....
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方案
所有操作均按照阿尔达比尔医科大学研究委员会关于动物实验的指南进行（伦理编号：IR.ARUMS.REC.1394.08）。在本可视化研究中，我们使用了来自伊朗德黑兰巴斯德研究所的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（300-350克）。
1. 麻醉与血流测定
- 使用4%异氟烷诱导麻醉，并在手术期间通过一氧化二氮（70% v/v）和氧气（30% v/v）的混合气体中维持1-1.5%的异氟烷浓度以维持麻醉状态。
- 将麻醉后的动物俯卧于反馈控制的加热毯上，并通过连接该加热装置的直肠探针将体温维持在37±0.5 °C。
- 在双眼上涂抹少量眼用软膏，以防角膜干燥。
- 使用电动剃刀剃除颅骨左侧手术区域的毛发，然后用浸有聚维酮碘溶液的纱布擦拭皮肤进行消毒；再用含70%乙醇的无菌纱布擦拭该区域，上述两步操作重复三个循环17。
- 为实现镇痛，于手术区域皮下注射0.2 mL的0.5%布比卡因17。
- 在颅骨上做一条长约1 cm的皮肤切口（从左眼外眦延伸至左耳根部），分离左侧颞肌以暴露颅骨。随后，在前囟外侧5 mm、后方1 mm处钻一小孔18，以便放置多普勒血流仪笔式探头的尖端。
- 将大鼠由俯卧位转为仰卧位，然后将激光笔式探头....
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结果
假手术组大鼠右侧半球与左侧半球的伊文思蓝（EB）水平之间无显著差异（分别为 1.06 ± 0.1 µg/g 和 1.1 ± 0.09 µg/g）。如图2A-2B所示，短暂性缺血诱导（90 分钟缺血/24 小时再灌注）导致缺血组大鼠左侧半球 EB 水平显著升高（10.41 ± 0.84 µg/g，p <0.001），与假手术组大鼠相应半球相比具有显著差异。综上所述，这些结果表明，在正常情况下，EB 不能轻易穿过血脑屏障（BBB）进入脑实质，而脑缺血损伤则通过增加血脑屏障通透性，诱导 EB 渗出（图2A 和 2B）。
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讨论
迄今为止，已有多种方法被用于评估血脑屏障损伤，包括放射自显影和放射性示踪剂检测24,25、免疫荧光显微镜技术26,27以及伊文思蓝（EB）外渗技术20,23。伊文思蓝染料可强烈结合血清白蛋白，常被用作检测血管渗漏和量化血脑屏障破坏的示踪剂11,28,29。作为一种广泛接受且可靠的方法，伊文思蓝外渗技术可直接评估受不同脑损伤（包括缺血性脑卒中）影响的血脑屏障完整性。
体内评估血脑屏障（BBB）可使研究人员研究缺血诱导的血管源性脑水肿可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢伊朗阿尔达比勒医科大学研究副校长提供的资金支持（资助编号：9607）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Piramal | AWN 34041100 | 20 - 25 °C |
| 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC） | Molekula | 31216368 | 4年 |
| Sprague–Dawley大鼠 | 伊朗德黑兰Pasture研究所 | 300-350g | |
| 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| 三氯乙酸 | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | 2年 |
| 盐酸布比卡因（0.5%） | Delpharm Tours | 低于 25 °C | |
| 丁丙诺啡 | Exir（伊朗） | ||
| 碳酸钠 | Sigma-Aldrich | 497-19-8 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 磷酸氢二钠 | EMD Millipore | 231-448-7 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| 硅胶（Xantopren） | Heraeus | EN ISO 4823 | |
| 通用活化剂Plus | Heraeus | 66037445 | |
| 显微解剖镊 | Stoelting | 52100-41 | |
| 弹簧剪 | Stoelting | 52130-00 | |
| 手术剪 | Roboz | 52140-70 | |
| 脑组织切片模具 | Stoelting | 51390 | |
| 小动物麻醉机 | Kent Scientific | SS-01 | |
| Power Lab系统 | AD Instruments | ML880 | |
| 激光多普勒血流仪 | AD Instruments | ML191 | |
| 加热反馈系统 | Harvard Apparatus | 72-7560 | |
| 血管微夹 | FineScience Tools | 18055-03 | |
| 5-0丝线缝合线 | Ethicon | 682G | |
| 4-0尼龙缝合线 | Ethicon | EH6740G |
参考文献
- Jin, G., et al. Protecting against cerebrovascular injury: contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia. Stroke. 39 (9), 2538-2543 (2008).
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mecha....
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重印与许可
