通过手动晶状体拉伸装置模拟晶状体调节的力学机制

摘要

我们介绍了一种利用手动晶状体拉伸装置研究晶状体调节的高效方法。该方案通过牵拉连接在晶状体囊膜周围的悬韧带，从而拉伸晶状体，以模拟生理状态下的调节过程。

摘要

本实验方案的目标是以一种经济实用的方式模拟生理性调节的生物力学过程。调节是通过睫状体收缩和悬韧带纤维松弛实现的，从而导致晶状体增厚，以满足近视力的需求。本文介绍了一种新颖且简便的方法，通过手动晶状体拉伸器（MLS）对连接于晶状体囊的悬韧带施加张力，以复制调节过程。该方法可监测在恒定外力作用下晶状体产生的径向拉伸程度，从而实现对可拉伸的调节性晶状体与不可拉伸的非调节性晶状体进行比较。重要的是，拉伸器直接与悬韧带耦合，而非与眼球的巩膜连接，因此仅需使用晶状体、悬韧带和睫状体，而无需完整的 globe 样本。与获取完整眼球相比，这一差异可使供体尸体晶状体的采购成本降低约62%。

引言

调节是指人眼通过动态改变晶状体形状，使远距离或近距离物体均能清晰聚焦的过程。调节本质上是一种生物力学过程。在神经刺激作用下，睫状肌对睫状体及附着于晶状体囊膜周缘的悬韧带纤维施加力的作用^1,2。尽管关于调节生物力学机制存在多种理论，但目前最广为接受的是赫尔姆霍兹假说。根据该假说，晶状体处于自然拉伸状态，此时晶状体最薄，适合远距离物体的聚焦。当需要将焦点调整至近距离物体时，睫状肌收缩，悬韧带纤维松弛，导致晶状体增厚，前、后表面曲率增加。这对应于屈光力的增强，从而实现近视力所需的更短焦距¹。

随着年龄增长，人眼的调节能力会因一种名为老视的状况而逐渐受损。到50岁时，所有人都会受到老视影响，导致眼睛无法动态地在远距离和近距离之间切换焦点³。目前矫正老视的方法主要是被动式矫正，如使用矫正镜片和双焦点眼镜。尽管这些方法可在有限的焦平面上提升近距离聚焦能力，但无法恢复晶状体原有的动态调焦功能^4,5。为了更有效地治疗老视，甚至可能预防其发生，目前仍需进一步深入理解眼的调节机制。

为了研究晶状体的调节功能，人们已开发出多种设备以在离体条件下模拟这一现象ex vivo^4,6,7,8,9。最早引入旋转盘装置，利用离心力监测晶状体的拉伸情况⁸。为了更真实地模拟该现象，晶状体拉伸装置逐步被引入并不断改进。Manns et al. 利用晶状体拉伸器，测定了实现晶状体调节所需的力，并将其与晶状体屈光力和赤道直径相关联⁹。目前的研究认为，晶状体会随年龄增长而变硬，导致在受到睫状体施加的相同作用力时，其形状变化减小^3,10,11,12。

目前的眼球晶状体拉伸装置通常结构复杂，需要集成电子元件和可编程的拉伸速率控制，并且要求使用完整的眼球遗体^6,7,10,13。这一要求使每次实验的成本超过500.00美元，并降低了样本的可获得性。本文介绍一种低成本复制晶状体调节功能的方法，其中眼球后段的成本约为200.00美元。尽管该方法在复杂性上不及当前许多设备，但其成本效益显著更高，且更易于推广应用，同时不牺牲实验结果的可靠性。本方法基于一种手动晶状体拉伸装置（MLS），如图1所示，采用独特的悬韧带纤维夹持系统以及径向扭转方法来扩大晶状体的直径。该实验方案的生理准确性得到了Bernal et al. 研究的支持，他们阐明了前部与后部悬韧带纤维连接至晶状体囊膜的通路¹⁴。通过设计仅需晶状体、悬韧带和睫状体的定制化夹具，我们旨在通过模拟生理性调节过程来研究晶状体的生物力学特性。

方案

以下方案已获得马里兰大学机构动物护理和使用委员会以及机构审查委员会的批准。这些方案遵循联邦、州和地方标准，以及马里兰大学生物安全政策所规定的指南。

1. 眼部样本解剖

1. 从当地屠宰场或组织库获取眼球样本。若获得完整的眼球，应立即取出晶状体、附着的悬韧带和玻璃体。
   ​注意：以下所述具体步骤适用于猪眼和人眼。
   1. 使用消毒的手术剪刀和镊子，剪除并去除巩膜周围的所有多余组织。
   2. 牢固地将眼球侧置，用刀片在距角膜3 mm处沿眼球侧面做一小切口，切口需足够深以进入眼内的玻璃体。
   3. 使用剪刀沿切口继续小心地环绕眼球一周进行剪开，避免刺破晶状体。代表性图像见图2A。
   4. 完成眼球外周的切割后，用镊子移除眼球后部组织，用镊子分离出晶状体、悬韧带、睫状体及附着的玻璃体。代表性图像见图2B。
   5. 使用剪刀和镊子去除多余的玻璃体，使晶状体能够平整地放置在MLS上。
      注意：在角膜移植手术中，角膜圆片用于临床手术，其余眼球组织可用于科研。然而，这种部分眼球仍可用于晶状体拉伸装置的组织制备。若仅获得眼球后部组织，则仅执行步骤1.1.4–1.1.5。
2. 解剖后，将所有使用过的器械置于15%次氯酸钠溶液中消毒30分钟。

2. 手动晶状体拉伸器的试组装

1. 将10 mm的鞋底和对应的鞋面插入MLS底板中，使鞋印后壁与鞋本身之间保持5 mm的间隙。
2. 对齐顶板和底板，将两板卡合在一起；此时装置处于未拉伸状态。
3. 将两块板插入板盒中，并将止动螺钉插入底板侧面的孔中。
4. 将板盒放入底座中，并将扳手放入对齐的凹槽内。
5. 顺时针旋转扳手直至接触到止动螺钉，以收缩鞋部；再逆时针旋转扳手，使鞋部恢复至原始未拉伸状态。

3. 晶状体的安装

1. 将10 mm的鞋底插入MLS的底板中，使鞋底后壁与鞋形凹槽之间保持5 mm的间隙。
2. 使用弯头镊子将取出的晶状体正面朝上放置在底板中央，使鞋形结构支撑晶状体覆盖中央孔洞。
3. 将相应的鞋形上部扣合到位，仅夹住悬韧带和玻璃体。目视确认晶状体尽可能保持在底板中央位置。
4. 重复步骤2.3–2.4。

4. 晶状体的测量

1. 将成像系统置于装置正上方，以拍摄拉伸过程的视频和图像。拍摄时务必在画面中包含一把刻度尺，以便在后期处理中准确地进行图像尺寸测量和比例换算。
   注：任何合适的成像系统均可满足此步骤要求；此处我们使用一部距离样品一英尺远的1200万像素自动对焦智能手机。
2. 平稳而牢固地顺时针旋转扳手以拉伸晶状体。图3展示了晶状体在未拉伸和拉伸状态下的代表性图像。
3. 拍摄拉伸后的晶状体图像后，逆时针旋转扳手，使样品恢复至静息状态。
   注：必须及时完成晶状体的测量，以尽量减少晶状体脱水。
4. 清晰拍摄晶状体最终的静息状态。

5. 数据分析

1. 将图像上传至 ImageJ 并使用 "点" 如图所示，在晶状体周长周围至少选择40个点 图4A. 使用 "分析" → "测量" 可选择输出每个选定位置的坐标。
2. 拟合（使用软件） 例如 MATLAB）中的位置点，以获得拟合的半径和卡方值，如图所示 图4B使用拍摄的标尺将像素半径和误差转换为实际度量单位。
3. 使用配对双尾 t 检验比较 MLS 拉伸前后单个晶状体的数据。

结果

猪眼是通过晶状体拉伸研究老视的常用样本^4,15，本研究从当地屠宰场获取了猪眼样本（n = 10），并采用该方案观察晶状体的调节能力。图5A展示了通过MLS对猪眼晶状体拉伸前后的比较。拉伸后晶状体半径平均增加了0.19 ± 0.07 mm（p <0.001），相当于原始半径增加了4.2 ± 1.62%。调节能力与晶状体弹性相关，因此，未拉伸与拉伸状态之间的径向差异反映了其调节潜力。我们发现拉伸后晶状体半径 consistently 增加，这与类似研究的结果一致^16,17。本研究中结果的一致性及相对较低的偏差进一步验证了本方案的有效性。

讨论

我们设计了一种新方法，通过采用双夹片夹持机制将拉伸装置与样品连接，从而提供一种准确且高效研究晶状体调节能力的途径。在调节过程中，晶状体松弛，其直径因悬韧带纤维的松弛而减小^1,2,4,19。该方法通过夹持并控制悬韧带纤维的张力，聚焦于这一现象。因此，必须特别注意将悬韧带准确夹持在夹具内，以精确模拟生理状态下晶状体的调节。为确保正确夹持，晶状体应平放于底部夹具中心位置，附着的玻璃体应尽可能少。在使用扳手操作时需格外小心，以保证晶状体周围受到均匀的径向拉伸。若发现晶状体拉伸不均，或悬韧带从夹具中脱落，则应尽可能重新安装样品。

目前，类似的晶状体拉伸方案正在被用于研究调节功能及老花眼^4,6,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手动晶状体拉伸器	Bioniko	MLS	不同动物物种需要不同尺寸的鞋码
猪眼样本	George G. Ruppersberger；屠宰场	N/A	获取了完整的眼球
人眼样本	国家疾病研究交换中心（The National Disease Research Interchange）	N/A	订购了不含角膜的后极部组织
解剖剪刀（5 1/2'' 直头）	Electron Microscopy Sciences	72960
组织镊子（4 1/2''）	Electron Microscopy Sciences	72960
iPhone 6s	Apple	N/A	任何分辨率达到约 0.1 mm 的成像系统均可使用
次氯酸钠	Clorox	Clorox Regular-Bleach	任何消毒剂均可使用