结合细胞表面靶受体的抗体可引起构象变化和受体聚集。这些动态变化对于表征靶细胞中药物开发具有重要意义。本方案利用共聚焦显微镜结合ImageJ/FIJI中的图像相关光谱学方法，定量分析细胞表面受体聚集的程度。
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本文内容
摘要
摘要
共聚焦显微镜提供了一种便捷的方法，用于捕获用荧光探针标记的临床前药物在表征和进一步开发过程中所涉及的关键亚细胞相互作用。随着基于抗体的细胞毒性药物递送系统的最新进展，理解这些药物在受体聚集和内化方面所诱导的变化变得至关重要。本实验方案结合了成熟的荧光免疫细胞化学方法，以及开源的ImageJ软件FIJI发行版，利用其内置的自相关和图像数学函数，进行空间图像相关光谱分析（ICS）。该方案通过共聚焦显微镜的光束面积来定量测定标记受体的荧光强度，从而对靶分子在细胞表面的聚集状态提供定量评估。本方法侧重于静态细胞的表征，未来可扩展至受体聚集的时间动态研究。本方案提供了一种易于实施的方法，利用成熟的技术和非专用成像设备，实现对细胞表面聚集事件的量化分析。
引言
治疗性抗体的开发在多种肿瘤类型的治疗中已取得显著成功1。近年来，抗体-药物偶联物（ADC）作为细胞毒性化合物递送手段的进展，进一步提高了对细胞表面抗体：受体相互作用动态特性理解的要求2。当抗体成功靶向细胞表面受体后，这些复合物可诱导产生与配体：抗体相互作用中所观察到的相似的聚集模式3。受体聚集状态的改变可引发细胞膜的变化，导致受体内化并从细胞表面被清除。在抗体-药物偶联物的背景下，该过程随后将细胞毒性载荷释放到内化的内体中，并进一步释放至细胞质，从而实现有效的细胞杀伤。
共聚焦显微镜为观察抗体与其靶受体之间这些重要相互作用提供了有效手段4。为了研究靶分子在细胞表面聚集状态的变化，本方案采用空间图像相关光谱法（spatial image correlation spectroscopy, ICS）对共聚焦显微镜图像进行后期处理5,6,7。
图像相关光谱学的基础在于观察到空间荧光强度波动与标记结构的密度及其聚集状态之间存在关联。这种关联关系在计算所捕获....
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方案
1. 成像实验用贴壁细胞系的接种
- 在8孔成像载玻片（适用于高分辨率油浸物镜，例如 NuncTM Lab-TekTM chambered coverglass）中，每孔接种10,000个A431表皮样癌细胞，加入300 µL含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% GlutaMAX的杜尔贝科改良伊格尔培养基/F-12营养混合物（DMEM/F-12），过夜培养（O/N）。
- 在室温下，向培养基中加入100 ng/mL EGF配体，刺激A431细胞受体聚集，作用10分钟。
2. 一抗孵育
- 移除培养基，用 PBS 洗涤细胞 300 µL 室温（RT）磷酸盐缓冲液（1× PBS）洗涤两次。
- 用固定剂固定细胞 200 µL 在室温下用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛固定 10 分钟。
注意：为了研究目标蛋白聚集的时间动态变化，此固定步骤必须省略。 - 去除PFA，用PBS洗涤细胞 300 µL 室温 PBS 洗涤两次。
- 将细胞与孵育 200 µL 含有一抗的 PBS，其浓度为 10 µg/mL 至少 2 小时 4 °C.
注意：为了确保ICS计算的有效性，细胞表面存在的所有受体必须用一抗进行标记。这需要针对每种一抗进行预实验，设置一系列稀释梯度（1....
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结果
成功的图像相关光谱实验依赖于正确设置处理对照组。这些处理组包括对无一抗和无二抗处理组的荧光情况进行检测。一旦确定了实验所需的最优共聚焦激光参数，就必须采集这些对照组的图像，以确认样本中不存在非特异性荧光。对于许多贴壁癌细胞系而言，适合进行图像相关光谱分析（ICS）的区域往往受限于缺乏平坦的表面。这一问题可通过单张共聚焦图像中捕获大视野内多个癌细胞的能力得到补偿，从而提供足够的采样数据，实现不同处理组之间的统计学比较。
在本代表性实验中，使用100 ng/mL EGF配体在室温下刺激A431 EGFR阳性表皮样癌细胞10分钟，以诱导EGFR聚集。对EGF刺激组（图1A）以及未刺激的（图1D) 细胞在与靶向EGFR的人源化单克隆抗体西妥昔单抗孵育后，选取细胞膜内某一区域（黄色框）的64×64像素裁剪图像
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讨论
本方案中描述的图像相关光谱学（image correlation spectroscopy, ICS）技术可使用标准共聚焦显微镜实现，无需专用探测器。所介绍的ICS技术结合了成熟的免疫细胞化学方法，能够快速采样多种处理条件，从而增强统计分析能力。与基于荧光涨落相关性的单分子技术（如荧光相关光谱法，fluorescence correlation spectroscopy, FCS）相比，该方法在绝对精度上略有降低，后者通过分析移动分子在共聚焦体积内扩散时产生的荧光波动来进行相关分析15。更为专业的FCS方法需要高灵敏度的光子计数探测器，例如雪崩光电二极管（avalanche photodiode, APD）或GaAsP探测器，以及专用软件，而这些设备通常不在标准共聚焦仪器上配备。对ICS技术精度的综合分析表明，该技术能够准确测量激光扫描显微镜聚焦光斑内含有>1个粒子的簇的数量7。
获取适当的荧光图像对于成功的图像相关光谱（ICS）分析至关重要。感兴趣区域必须具有较高的信噪比荧光信.......
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披露
Andrew M Scott 获得来自 AbbVie Pharmaceutics、EMD Serono 和 Daiichi-Sankyo Co 的研究资金支持，并持有 Life Science Pharmaceuticals 的咨询职务和股票所有权。除上述披露外，作者无其他与任何组织或实体在本稿件所讨论主题或材料方面存在经济利益或财务冲突的相关从属关系或财务参与。
致谢
作者感谢以下机构提供的经费支持：澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC，Fellowship 1084178 及项目资助 1087850、1030469、1075898（AMS））、澳大利亚癌症基金会（Cancer Australia）、路德维希癌症研究（Ludwig Cancer Research）、John T Reid 信托基金、治愈脑癌基金会（Cure Brain Cancer Foundation）、拉筹伯大学（La Trobe University）以及维多利亚癌症署（Victoria Cancer Agency）。同时感谢澳大利亚维多利亚州政府提供的运营基础设施支持计划（Operational Infrastructure Support Program）的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nunc Lab-Tek II 八孔腔室盖玻片 | ThermoFisher Scientific | 155409 | |
| 不含钙、不含镁的 DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| TrypLE Express 酶（1x），不含酚红 | ThermoFisher Scientific | 12604021 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| GlutaMAX 补充剂 | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| 山羊抗人 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | ThermoFisher Scientific | A11013 | |
| TetraSpeck 荧光微球标准品 0.1µm | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| 西妥昔单抗 | Merck Serono | 3023715501 | |
| Parafilm M 38 m × 100 mm | Merck Millipore | BRND701605 | |
| 16% 多聚甲醛（甲醛）水溶液 | ProSciTech | C004 | |
| 重组人 EGF | R&D System | 236-EG |
参考文献
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
- Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14(2016).
- Sorkin, A., Waters, C. M.
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重印与许可
