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方法文章

共聚焦显微镜通过图像相关光谱法揭示细胞表面受体聚集现象

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DOI：

10.3791/57164

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2018年8月2日

 ,  ,  , 
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

本文内容

摘要

结合细胞表面靶受体的抗体可引起构象变化和受体聚集。这些动态变化对于表征靶细胞中药物开发具有重要意义。本方案利用共聚焦显微镜结合ImageJ/FIJI中的图像相关光谱学方法，定量分析细胞表面受体聚集的程度。

摘要

共聚焦显微镜提供了一种便捷的方法，用于捕获用荧光探针标记的临床前药物在表征和进一步开发过程中所涉及的关键亚细胞相互作用。随着基于抗体的细胞毒性药物递送系统的最新进展，理解这些药物在受体聚集和内化方面所诱导的变化变得至关重要。本实验方案结合了成熟的荧光免疫细胞化学方法，以及开源的ImageJ软件FIJI发行版，利用其内置的自相关和图像数学函数，进行空间图像相关光谱分析（ICS）。该方案通过共聚焦显微镜的光束面积来定量测定标记受体的荧光强度，从而对靶分子在细胞表面的聚集状态提供定量评估。本方法侧重于静态细胞的表征，未来可扩展至受体聚集的时间动态研究。本方案提供了一种易于实施的方法，利用成熟的技术和非专用成像设备，实现对细胞表面聚集事件的量化分析。

引言

治疗性抗体的开发在多种肿瘤类型的治疗中已取得显著成功1。近年来，抗体-药物偶联物（ADC）作为细胞毒性化合物递送手段的进展，进一步提高了对细胞表面抗体：受体相互作用动态特性理解的要求2。当抗体成功靶向细胞表面受体后，这些复合物可诱导产生与配体：抗体相互作用中所观察到的相似的聚集模式3。受体聚集状态的改变可引发细胞膜的变化，导致受体内化并从细胞表面被清除。在抗体-药物偶联物的背景下，该过程随后将细胞毒性载荷释放到内化的内体中，并进一步释放至细胞质，从而实现有效的细胞杀伤。

共聚焦显微镜为观察抗体与其靶受体之间这些重要相互作用提供了有效手段4。为了研究靶分子在细胞表面聚集状态的变化，本方案采用空间图像相关光谱法（spatial image correlation spectroscopy, ICS）对共聚焦显微镜图像进行后期处理5,6,7。

图像相关光谱学的基础在于观察到空间荧光强度波动与标记结构的密度及其聚集状态之间存在关联。这种关联关系在计算所捕获图像的空间自相关函数后得以确立5。

所有图像相关光谱技术的变体都需要计算图像自相关函数。随后，通过将该函数拟合到二维高斯曲线，以提取图像中包含的定量聚集状态参数。简而言之，图像自相关的计算涉及比较图像中所有可能的像素对，并计算两个像素亮度相同的概率，该结果以像素间距的距离和方向为函数进行可视化8。

图像相关光谱学的理论框架由 Petersen 和 Wiseman 等人建立并定义et al.5,6。在本实验方案中，自相关计算在 Fiji/ImageJ 以及电子表格应用程序中进行，强度波动空间自相关函数的基础可描述为（公式 1）：

figure-introduction-1     

其中，F 表示傅里叶变换；F−1 表示逆傅里叶变换；F* 为其复共轭；ε 和 η 为空间滞后变量。在本实验方案所述的空间 ICS 中，可利用二维快速傅里叶变换算法7,9 计算自相关函数。零空间间距下的自相关函数，即零滞后自相关 g11(0,0)，表示显微镜光束截面内单位面积的平均粒子数的倒数。该值可通过将空间自相关函数拟合至二维高斯函数获得 (公式 2)：

figure-introduction-2     

由于图像中捕获的像素包含在固定区域内，而这些测量值不会延伸至无穷远，因此使用术语 g∞ 作为偏移量，以校正图像中包含的长程空间相关性。对于分子尺度的聚集体，ω 是显微镜的点扩散函数，由空间自相关函数的半高全宽描述。仪器点扩散函数所包含的区域可通过使用亚分辨率荧光微珠进行校准。

对于本文所述的图像相关光谱学方案，完成ICS所需的自相关和数学函数通过开源图像处理平台Fiji10实现，该平台是ImageJ程序11,12的一个发行版本。Fiji/ImageJ利用FFT数学函数中预装的快速傅里叶变换。该函数通过在每个维度上将数据范围减少一半，显著降低了此计算所需的运算时间13。由于二维自相关函数在x、y轴上近似对称，因此可通过自相关图像的单条线轮廓图来测量作为空间滞后函数的原始自相关。在进一步计算之前，需去除任何零滞后噪声，随后使用公式（公式3）对背景校正后的自相关幅度（峰值，g(0)T）进行修正：

figure-introduction-3     

其中，Ib 是来自排除细胞区域的背景的平均强度。簇密度，即荧光物体的密度，由（公式 4）定义：

figure-introduction-4    

在本方案中，我们进一步简化了簇密度（CD）的计算方法，其依据是观察到归一化的自相关函数随着空间滞后距离的增加，其值将衰减至接近1.0。当空间滞后距离达到最大时，荧光强度值之间不再存在任何相关性，因此在此区域的计算相当于一个强度值乘以自身强度，再除以该强度的平方，根据定义，其结果恒等于1.0。因此，可通过在取归一化自相关函数的倒数之前，先减去1.0，来计算归一化自相关函数的簇密度 (公式 5)：

figure-introduction-5     

可进一步校准光束面积，以定量测定仪器点扩散函数区域内所包含的簇数量。此校准必须在与图像相关光谱分析相同的光学条件下进行。

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方案

1. 成像实验用贴壁细胞系的接种

  1. 在8孔成像载玻片（适用于高分辨率油浸物镜，例如 NuncTM Lab-TekTM chambered coverglass）中，每孔接种10,000个A431表皮样癌细胞，加入300 µL含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% GlutaMAX的杜尔贝科改良伊格尔培养基/F-12营养混合物（DMEM/F-12），过夜培养（O/N）。
  2. 在室温下，向培养基中加入100 ng/mL EGF配体，刺激A431细胞受体聚集，作用10分钟。

2. 一抗孵育

  1. 移除培养基，用 PBS 洗涤细胞 300 µL 室温（RT）磷酸盐缓冲液（1× PBS）洗涤两次。
  2. 用固定剂固定细胞 200 µL 在室温下用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛固定 10 分钟。
    注意：为了研究目标蛋白聚集的时间动态变化，此固定步骤必须省略。
  3. 去除PFA，用PBS洗涤细胞 300 µL 室温 PBS 洗涤两次。
  4. 将细胞与孵育 200 µL 含有一抗的 PBS，其浓度为 10 µg/mL 至少 2 小时 4 °C.
    注意：为了确保ICS计算的有效性，细胞表面存在的所有受体必须用一抗进行标记。这需要针对每种一抗进行预实验，设置一系列稀释梯度（1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1,000）， 等等。通过分析荧光强度与簇密度的关系来确定最佳一抗浓度。当簇密度随一抗浓度增加而达到平台期，且在非特异性抗体结合导致簇密度进一步上升之前，所对应的一抗浓度即为选定浓度。若进行时间序列成像实验，一抗可使用无血清培养基稀释。
  5. 在完成所需的孵育时间后，用缓冲液洗涤细胞 300 µL RT PBS 洗涤两次。
  6. 用含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭样本，至少2 h，于 4 °C.
    注意：固定后的样本通常在4°C下封闭过夜（O/N） 4 °C.

3. 二抗孵育

  1. 制备 10 µg/mL 荧光标记的二抗储备液（例如 PBS中的Alexa Fluor 488 IgG 2 µg/mL 可在此稀释液中加入Hoechst 33342，以便在显微镜下更易定位样本。
    注意：对于延时实验，可用无血清培养基替代 PBS。
  2. 除去细胞中的 5% BSA/PBS，加入二抗溶液，于室温孵育 2 h 4 °C同时避免样品暴露于环境光下。
  3. 二抗孵育结束后，用缓冲液洗涤细胞 300 µL PBS（两次）并储存于 4 °C避光保存，防止环境光影响。
  4. 为防止蒸发，用封口膜包裹腔室载玻片的边缘。

4. 样品的共聚焦显微镜观察

注意：共聚焦分析所使用的设置会因具体实验中采用的设备和荧光染料的不同而有所差异。现代共聚焦仪器能够将实验中使用的所有成像参数保存在其原生图像文件格式中。重要的是，必须记录这些设置，以便在不同时间段的数据采集过程中准确重现实验条件。

  1. 进行荧光信号成像时，避免信号过饱和。使用提供像素饱和度伪彩表示的图像查找表，并相应降低探测器增益和激光功率。大多数共聚焦仪器的采集软件中均包含“范围指示器”设置或类似选项。
  2. 尽量减少目标荧光染料暴露于激光功率的时间。使用如Hoechst 33342等DNA标记染料，可在采集前方便地检测并定位样品视野中的位置。
  3. 初始扫描样品时采用低分辨率，若软件允许，使用较快的扫描速度。这将有助于限制样品可能发生的光漂白。
  4. 准备采集图像数据时，提高捕获分辨率并降低扫描速度。
  5. 如果共聚焦仪器支持，使用光子计数模式采集数据。
    注意：若仪器不支持光子计数，请确保图像采集过程中灰度级别呈线性。
  6. 将每条所用激光线的针孔设置为1艾里单位（Airy unit, AU）。
  7. 在图像采集过程中使用线平均或帧平均（×4），以降低探测器相关噪声。
    注意：在此种ICS变体中，仅采集一个时间点，因此采集时间并非实验的限制因素。
  8. 图像采集时选择高放大倍数、高数值孔径的物镜，例如平场复消色差物镜（Plan-Apochromat），以提供最大分辨率，并校正球面像差和色差（例如Plan-Apochromat 100X或63X /1.40油镜）。
  9. 对图像中捕获的像素尺寸进行过采样。建议每个像素对应50 × 50 nm的区域。为有效进行ICS分析，像素尺寸必须小于0.1 × 0.1 µm2/像素。可通过放大扫描区域（zoom in）以扫描相对较小的区域，并选择相对较大的图像格式（例如 1024 × 1024 或 2048 × 2048 像素）来实现。
  10. 聚焦于细胞顶面或底面尽可能平坦的区域。单幅图像中可包含多个细胞，在ICS分析过程中可对各个感兴趣区域分别处理。
  11. 使用与样品采集相同的仪器设置，采集无细胞区域的背景信号，用于后续样品归一化处理。

5. 图像相关光谱的计算

注意：需要使用开源图像处理平台 Fiji（ImageJ 程序的一个发行版本）来执行 ICS 所必需的自相关和数学函数。推荐使用该 ImageJ 发行版，因为它包含大量预安装的插件以及更便捷的更新架构，可跨多个成像实验执行操作。

  1. 安装 Fiji 程序（http://fiji.sc/Downloads）。
  2. 加载获取的数据集。
  3. 确定顶膜或基底细胞表面膜的目标区域，并将其复制为 2n 像素尺寸（256 × 256、128 × 128、64 × 64）。“菜单：图像 > 复制…”
  4. 计算裁剪后目标区域的平均强度。“菜单：分析 > 测量。”
  5. 确定一个背景区域，并将其复制为与捕获的细胞表面膜相同的像素尺寸（2n：256×256、128×128、64×64）。“菜单：图像 > 复制…”
  6. 计算背景裁剪区域的平均强度。“菜单：分析 > 测量。”
  7. 从包含目标区域的图像中减去背景的平均强度。“处理 > 图像计算器 > 减法。”
  8. 执行自相关计算。该计算位于菜单结构中：“处理 > FTT > FD Math”。
    1. 在 FD Math 对话框中选择：图像 1：裁剪后的图像名称，操作方式为相关性，图像 2：裁剪后的图像名称，逆变换开启。
  9. 通过除以总像素数对结果图像进行归一化处理。“菜单：处理 > 数学 > 除法…”（即：64×64 像素 = 4096）
  10. 再次通过除以归一化后裁剪区域平均强度的平方进行归一化。“菜单：处理 > 数学 > 除法…”
    注：可通过将图像连续两次除以平均强度值实现此操作。 
  11. 穿过点扩散函数绘制一条直线。
  12. 绘制该直线的轮廓以计算峰值。“菜单：分析 > 轮廓图。”
  13. 通过将峰值（步骤 5.12 的结果）输入电子表格并执行以下计算（公式 6），计算每束光面积内的簇数量：
    figure-protocol-1

6. ICS 数据集的批量处理

注意：建议建立 FIJI/ImageJ 宏，以重复执行上述方案中描述的操作步骤。这有助于在图像相关光谱分析期间对多个图像文件进行一致且快速的分析。

  1. 通过记录 ICS 方案中的每个菜单命令，建立宏 ICS 工作流程
    "菜单：插件 > 宏 > 记录…".
  2. 选择 "创建" 生成巨噬细胞。
  3. 选择 "语言 > IJ1 宏"
  4. 保存宏
  5. 在宏的各个步骤中添加对话框，以提醒操作人员每项功能的用途。对话框还可用于暂停分析过程，以便在继续处理前进行适当的选项设置。即， 裁剪区域
    1. 对话框宏代码
      标题 = "对话框标题";
      msg = "对话框/实验步骤提示信息";
      等待用户（标题，消息）；
      注意：通过在 FIJI 更新器中订阅 BAR 更新网站（说明见 https://imagej.net/BAR），可获得额外功能。这将为 FIJI 提供 "一系列广泛适用的常规方法" 14一种此类常规操作是“Find Peaks”。菜单结构： "BAR > 数据分析 > 寻找峰" 该脚本提供了一种快速计算点扩散函数轮廓中峰值的方法。

7. 实验方案扩展：显微镜光束面积的计算

注意：显微镜的光学传递函数确保即使分子尺度的物体在 x-y 平面上也会呈现为半径约 200-300 nm 的图像。通过在亚分辨率荧光微球上执行步骤 4-5，ICS 协议可用于测定点扩散函数。具体如下：

  1. 将亚分辨率（即 直径 <100 nm）的荧光微球固定到8孔成像载玻片上。
  2. 按照所述方案，使用用于ICS实验的共聚焦显微镜对微球进行成像。
  3. 根据步骤5.1–5.13所述方案，从所得图像计算ICS函数。
  4. 从绘制的曲线图中，将光束半径（r）计算为ICS函数半高全宽值。
  5. 按（公式7）计算光束面积（BA）：figure-protocol-2

8. 方案扩展：单位面积内簇数的计算

  1. 计算单位面积的簇密度（CD），公式见（公式 8）：
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  2. 将每束斑面积内的簇数量（步骤 5.13 的结果）除以束斑面积（步骤 7.5 的结果）。

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结果

成功的图像相关光谱实验依赖于正确设置处理对照组。这些处理组包括对无一抗和无二抗处理组的荧光情况进行检测。一旦确定了实验所需的最优共聚焦激光参数，就必须采集这些对照组的图像，以确认样本中不存在非特异性荧光。对于许多贴壁癌细胞系而言，适合进行图像相关光谱分析（ICS）的区域往往受限于缺乏平坦的表面。这一问题可通过单张共聚焦图像中捕获大视野内多个癌细胞的能力得到补偿，从而提供足够的采样数据，实现不同处理组之间的统计学比较。

在本代表性实验中，使用100 ng/mL EGF配体在室温下刺激A431 EGFR阳性表皮样癌细胞10分钟，以诱导EGFR聚集。对EGF刺激组（图1A）以及未刺激的（图1D) 细胞在与靶向EGFR的人源化单克隆抗体西妥昔单抗孵育后，选取细胞膜内某一区域（黄色框）的64×64像素裁剪图像

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讨论

本方案中描述的图像相关光谱学（image correlation spectroscopy, ICS）技术可使用标准共聚焦显微镜实现，无需专用探测器。所介绍的ICS技术结合了成熟的免疫细胞化学方法，能够快速采样多种处理条件，从而增强统计分析能力。与基于荧光涨落相关性的单分子技术（如荧光相关光谱法，fluorescence correlation spectroscopy, FCS）相比，该方法在绝对精度上略有降低，后者通过分析移动分子在共聚焦体积内扩散时产生的荧光波动来进行相关分析15。更为专业的FCS方法需要高灵敏度的光子计数探测器，例如雪崩光电二极管（avalanche photodiode, APD）或GaAsP探测器，以及专用软件，而这些设备通常不在标准共聚焦仪器上配备。对ICS技术精度的综合分析表明，该技术能够准确测量激光扫描显微镜聚焦光斑内含有>1个粒子的簇的数量7。

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披露

Andrew M Scott 获得来自 AbbVie Pharmaceutics、EMD Serono 和 Daiichi-Sankyo Co 的研究资金支持，并持有 Life Science Pharmaceuticals 的咨询职务和股票所有权。除上述披露外，作者无其他与任何组织或实体在本稿件所讨论主题或材料方面存在经济利益或财务冲突的相关从属关系或财务参与。

致谢

作者感谢以下机构提供的经费支持：澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC，Fellowship 1084178 及项目资助 1087850、1030469、1075898（AMS））、澳大利亚癌症基金会（Cancer Australia）、路德维希癌症研究（Ludwig Cancer Research）、John T Reid 信托基金、治愈脑癌基金会（Cure Brain Cancer Foundation）、拉筹伯大学（La Trobe University）以及维多利亚癌症署（Victoria Cancer Agency）。同时感谢澳大利亚维多利亚州政府提供的运营基础设施支持计划（Operational Infrastructure Support Program）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Nunc Lab-Tek II 八孔腔室盖玻片ThermoFisher Scientific155409
不含钙、不含镁的 DPBSThermoFisher Scientific14190144
胎牛血清ThermoFisher Scientific10099141
TrypLE Express 酶（1x），不含酚红ThermoFisher Scientific12604021
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）ThermoFisher Scientific15140122
GlutaMAX 补充剂ThermoFisher Scientific35050061
山羊抗人 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记ThermoFisher ScientificA11013
TetraSpeck 荧光微球标准品 0.1µmThermoFisher ScientificT7279
西妥昔单抗Merck Serono3023715501
Parafilm M 38 m × 100 mmMerck MilliporeBRND701605
16% 多聚甲醛（甲醛）水溶液ProSciTechC004
重组人 EGFR&D System236-EG

参考文献

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