从人牙槽骨膜中分离间充质干细胞及维生素D对骨膜来源细胞成骨活性的影响

摘要

我们提出了一种研究维生素C和1,25-二羟基维生素D[1,25-(OH)₂D₃]诱导的骨膜来源细胞（PDCs）中mRNA表达生物标志物的实验方案。此外，我们评估了PDCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。

摘要

间充质干细胞（MSCs）存在于多种组织中，可分化为多种细胞类型，包括成骨细胞。在牙源性MSCs来源中，骨膜是一种易于获取的组织，其生发层已被证实含有MSCs。然而，这一来源尚未得到广泛研究。

维生素D₃ 和 1,25-(OH)₂D₃ 已被证明可刺激 体外 间充质干细胞向成骨细胞的分化。此外，维生素C有助于胶原蛋白的形成和骨细胞的生长。然而，目前尚无研究探讨维生素D的作用₃ 以及维生素C对MSCs的影响。

本文介绍了一种从人牙槽骨膜中分离间充质干细胞（MSCs）的方法，并检验了1,25-(OH)₂D₃ 可能对这些细胞产生骨诱导作用的假设。我们还研究了人牙槽骨膜中MSCs的存在情况，并评估了干细胞的黏附性与增殖能力。为评估维生素C（作为对照）以及不同浓度的1,25-(OH)₂D₃（10⁻¹⁰、10⁻⁹、10⁻⁸ 和 10⁻⁷ M）对分离获得的MSCs中关键mRNA生物标志物的影响，采用实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测碱性磷酸酶（ALP）、骨唾液酸蛋白（BSP）、核心结合因子α-1（CBFA1）、I型胶原蛋白（collagen-1）和骨钙素（OCN）的mRNA表达水平。

引言

尽管近年来已开发出多种相关技术，骨重建仍受到多重限制，且常常无法准确评估所需重建的范围。为了实现美学效果、功能需求以及良好的长期成功率，必须进行硬组织增量。此类手术常用的方法包括自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植和人工合成骨移植。在各种骨移植类型中，自体骨移植被认为是最有效的。然而，供区并发症、血供受损以及可获取组织量有限¹一直是自体骨移植的主要缺点。此外，同种异体骨移植和异种骨移植存在疾病传播的风险。目前，合成骨移植材料被广泛用于解决上述问题。但由于缺乏成骨潜能，其临床效果差异较大。诸如纤维素等材料还存在体积不稳定、感染风险以及机械强度不足等问题。

利用组织工程技术进行骨增量已引起广泛关注。该技术首先使用间充质干细胞（MSCs）促进成骨细胞分化，随后将分化后的细胞移植至骨缺损部位以实现骨修复。目前该方法已应用于细胞治疗领域。与其他方法相比，通过获取少量组织来实现骨重建的操作更为简便且侵入性更小。

间充质干细胞（MSCs）作为基于细胞治疗手段用于牙体再生的潜在工具，正受到多个研究团队的广泛关注。研究表明，MSCs可来源于以下组织类型：骨髓、脂肪组织、滑膜、周细胞、松质骨、人脐带以及牙源性组织^2,3。MSCs的常见来源包括骨髓、脂肪组织和牙源性组织。与来源于脂肪组织和骨髓的MSCs相比，牙源性干细胞的优势在于获取便捷且采集后并发症较少。与胚胎干细胞相比，来源于牙组织的MSCs似乎不具有免疫原性，且不涉及复杂的伦理问题³。

2006年，国际细胞治疗学会建议采用以下标准来鉴定间充质干细胞（MSCs）：第一，MSCs必须具有贴附于塑料表面的能力；第二，MSCs必须表达表面抗原CD105、CD73和CD90，且不表达单核细胞、巨噬细胞和B细胞的标记物，以及造血抗原CD45和CD34。⁴最后一项标准是，间充质干细胞在标准条件下必须能够分化为以下三种类型的细胞： 体外 分化：成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞⁴迄今为止，已分离并鉴定出六种人类牙源性干细胞。第一种是从人类牙髓组织中分离出来的，称为出生后牙髓干细胞⁵随后，又分离并鉴定出三种其他类型的牙源性间充质干细胞：脱落乳牙来源的干细胞⁶牙周膜⁷，以及顶端乳头⁸最近，牙囊来源的⁹，牙龈组织来源的¹⁰牙蕾干细胞（DBSCs）¹¹以及根尖囊肿间充质干细胞（hPCy-MSCs）¹² 也已鉴定出。

Friedenstein 首次定义了间充质干细胞（MSCs）¹³。MSCs 具有较高的增殖潜能，并可在移植前被诱导分化，这表明它们是再生医学治疗的理想候选细胞¹⁰。

尽管大多数研究使用骨髓作为干细胞来源，但近年来也已开始使用骨膜来源的细胞（PDCs）¹⁴。骨膜比骨髓更容易获取。因此，在本技术中，我们采用牙槽骨膜，以避免手术过程中额外切口的需要，并减少患者术后的并发症。骨膜是形成长骨外层的结缔组织，由两个不同的层次组成：外层为由成纤维细胞、胶原蛋白和弹性纤维构成的纤维层¹⁵，内层为富含细胞的生发层，直接与骨表面接触。生发层包含多种细胞群体，主要包括成纤维细胞¹⁶、成骨细胞¹⁷、壁细胞¹⁸，以及被确认为间充质干细胞（MSCs）的关键亚群^19,20,21。多数研究报道，PDCs在骨愈合与再生方面与骨髓来源的干细胞（bMSCs）相当，甚至更优^22,23,24。骨膜易于获取且表现出优异的再生能力。然而，目前针对骨膜的研究仍较少^25,26,27。

在骨组织修复方面，目前的临床实践是将扩增于支持性支架中的骨膜祖细胞进行移植。近期研究集中于获取缺损区域的干细胞，并利用祖细胞促进组织再生²⁰。牙科医生也期待未来能将牙周骨再生技术应用于牙周治疗和牙种植中。就供体部位而言，骨膜可由普通牙科外科医生方便地获取。与骨髓基质细胞相比，骨膜在常规口腔手术中即可获取，具有明显优势。因此，本研究的目的是建立一种获取PDCs的方案，并评估人骨膜干细胞的形态、贴附性、活力及增殖能力。

维生素D代谢物影响的 体内 骨矿物质动态平衡。一项研究报道，24R,25-(OH)₂D₃ 维生素D的活性形式对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向成骨细胞的分化至关重要²⁸骨稳态与修复受维生素D网络的调控₃ 代谢物，其中1,25-(OH)₂D₃ （骨化三醇）是生物学活性最强且在调节骨骼健康中最为重要的维生素D形式。₃ 对钙化至关重要²⁹在一项使用2日龄昆明小白鼠的研究中，小鼠体内的类胚体表明，维生素C和维生素D补充剂能有效促进胚胎干细胞来源的成骨细胞分化³⁰在其其他生物学活性中，1,25-(OH)₂D₃ 刺激 体外 hMSCs向成骨细胞的分化，可通过碱性磷酸酶（ALP）活性的增加或OCN基因表达来监测。

很少有研究检测到维生素C与1,25-(OH)₂D₃联合治疗的剂量-反应关系₂D₃ 在人PDCs中，特别关注骨组织工程。因此，在本研究中，我们考察了1,25-(OH)₂D₃单用或联合处理的最佳浓度₂D₃ 以及维生素C以诱导人PDCs的成骨分化。本实验方案的目的是确定从牙槽骨膜分离的细胞群体是否含有具有MSC表型的细胞，以及这些细胞是否可在体外培养中扩增（体外）并分化形成目标组织。此外，我们评估了PDCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。研究的第二部分评估了维生素C和10⁻¹⁰, 10⁻⁹, 10⁻⁸，以及10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃ 关于PDCs的成骨活性，本研究的主要目的是评估维生素C和1,25-(OH)₂D₃的功能。₂D₃ 通过检测碱性磷酸酶（ALP）活性以及成骨相关基因（如ALP、胶原蛋白-1、OCN、BSP和CBFA1）的表达，评估PDCs的成骨分化过程。此外，本研究基于上述结果确定了人源PDCs的最佳成骨诱导条件。

方案

本研究方案已获长庚纪念医院机构审查委员会批准。所有参与者均签署了书面知情同意书。

1. 组织制备

1. 在牙科手术期间从患者身上采集骨膜组织（图1）。在局部麻醉下翻瓣后，使用骨膜剥离器从牙槽骨上取下一小块骨膜组织³¹。
2. 采集后，将大小约为5 mm × 2 mm的骨膜组织片置于含300 U/mL青霉素和300 mg/mL链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中保存，并在24小时内转移至实验室。
3. 用手术刀将牙槽骨骨膜组织切碎至细小碎片，并将样本置于传代0代培养基中（含300 U/mL青霉素、300 mg/mL链霉素、α-MEM和5%胎牛血清[FBS]），在37 °C、加湿空气（5%二氧化碳）的培养箱中培养。培养箱内需放置水盘以维持湿度。
4. 3天后首次换液，之后每周更换两次培养基。
5. 当细胞达到亚汇合状态（80%）时，在培养箱（37 °C）中加入200 µL 0.25%胰蛋白酶消化3分钟，随后加入4.5 mL培养基终止反应。
6. 将细胞重新接种于新鲜的第1代培养基中（α-MEM、10% FBS、100 单位/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），接种密度为5 × 10³ 个细胞（通过血细胞计数板计数确定）。
7. 每次后续传代均在细胞达到80%汇合度时进行³¹。
   注意：初期培养基呈橙红色，大约三天后颜色应变为微黄色。细胞倍增时间约为30–40小时，完成3–5代增殖约需7天。
8. 将分离获得的PDCs在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的α-MEM培养基中，于培养箱（37 °C，5% CO₂）中进行培养。
9. 每日观察细胞生长情况，每周更换两次生长培养基。所有后续实验均使用第3至第5代细胞。

2. 流式细胞术

1. 通过胰蛋白酶消化收集 1 × 10⁶ 个细胞：
   1. 加入 200 µL 0.25% 胰蛋白酶。3 分钟后，使用含胎牛血清（FBS）的 4.5 mL 培养基终止胰蛋白酶反应，并通过离心（1500 rpm，5 分钟，22 °C）收集细胞。
   2. 用 1× DPBS 洗涤细胞沉淀三次。将细胞重悬于 200 µL 1× 透化缓冲液 中，并用血细胞计数板计数细胞。
2. 通过流式细胞术（荧光激活细胞分选）³² 检测 PDCs 表达的表面标志物。使用针对 CD19（异硫氰酸荧光素 [FITC]）、CD34（FITC）、CD44（藻红蛋白 [PE]）、CD45（FITC）、CD73（PE）、CD90（别藻蓝蛋白 [APC]）、CD146（PE）、STRO-1（Alex）和 HLA-DR（FITC）的单克隆抗体³²。
   1. 将抗体加入样品中，在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
   2. 用 1× DPBS 洗涤细胞三次。
   3. 使用 2% 甲醛固定细胞，随后进行流式细胞术分析³²。

3. 成骨、成脂和成软骨分化过程中的细胞黏附与活力

通过将骨膜细胞在三个传代中分别接种于六孔板，并使用特定的成骨、成脂和成软骨分化培养基进行培养，诱导细胞向成骨、成脂和成软骨谱系分化。

1. 进行成骨分化时，将细胞以每孔5000个细胞的密度接种于六孔培养板中，在α-MEM培养基中培养。
   1. 当细胞达到80%融合度时，将细胞培养于含有α-MEM、5%胎牛血清（FBS）、β-甘油磷酸钠（10 mM）、10⁻⁷ M 地塞米松（0.1 mM）和5 mL抗坏血酸（100 uM）的培养基中。阴性对照组使用仅含α-MEM和5% FBS的培养基进行培养。
   2. 每周更换培养基两次。
   3. 培养4周后，通过冯科萨（von Kossa）染色法检测细胞向成骨谱系分化的潜能，该方法可识别培养物中钙化沉积物的存在³³。
      1. 加入10%甲醛进行固定。30分钟内加入5%硝酸银，并在室温下置于紫外光（UV）下照射1小时。
      2. 加入5% Na₂SO₄ 四次，每次反应持续3分钟。最后用蒸馏水洗涤细胞两次。
         注：冯科萨染色是一种沉淀反应，其中银离子在酸性物质存在下与磷酸盐发生反应；该染色技术对钙并不特异。在本研究中，当待测细胞经硝酸银溶液处理后，钙在强紫外光作用下被还原，并被银取代，最终以金属银的形式显现。
2. 进行成脂分化时，将细胞以每孔5000个细胞的密度接种于含α-MEM的六孔培养板中。
   1. 当细胞达到80%融合度时，将细胞培养于含有α-MEM、5% FBS、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（100 mg/mL）、1%青霉素、10⁻⁶ M 地塞米松（1 mM）、胰岛素（5 mg/mL）和吲哚美辛（60 mM）的培养基中。
   2. 阴性对照组使用仅含α-MEM和5% FBS的培养基进行培养。
   3. 培养6–9周后，使用油红O对细胞进行染色以显示脂滴，从而判断是否存在成脂分化³³：
      1. 加入10%甲醛进行固定。30分钟内于室温下用0.5%油红O染色10分钟，然后用60%异丙醇洗涤三次，每次3分钟；最后用蒸馏水洗涤细胞。
         注：油红O是一种溶脂染料（脂溶性）偶氮染料，用于中性脂质（主要是甘油三酯、脂蛋白和胆固醇酯）的染色。该染料溶解于细胞内的脂滴中，使脂滴呈现红色。
3. 进行软骨细胞分化时，将细胞接种于六孔培养板中，每孔含5000个细胞。
   1. 加入含α-MEM、5% FBS、10⁻⁷ M 地塞米松（0.1 mM）、丙酮酸钠（100 µg/mL）、胰岛素-转铁蛋白-硒-A（1 × ITS）、转化生长因子-β（10 ng/mL）和5 mL抗坏血酸（100 µM）的分化培养基。
   2. 阴性对照组使用仅含α-MEM和5% FBS的培养基进行培养。
   3. 培养4–5周后，使用阿利新蓝（Alcian blue）染色法对细胞软骨中的酸性多糖（如糖胺聚糖或某些类型的黏多糖）进行染色，以判断是否存在软骨细胞分化³³。
      1. 加入10%甲醛进行固定。30分钟内加入3%乙酸，反应2分钟。随后用蒸馏水洗涤三次，加入1%阿利新蓝8GX孵育30分钟，再用蒸馏水洗涤。最后加入3%乙酸洗涤3分钟，再用蒸馏水洗涤结束染色。
         注：细胞中被该染料特异性染色的部分在染色后呈现蓝色至蓝绿色，称为“阿利新蓝亲和性”区域。

4. 25-二羟基维生素D₃（1,25-(OH)₂D₃）对成骨作用的影响

1. 将第3至第5代PDCs分为六组，分别接种于6孔板中，并使用不同的培养基进行培养：
2. 阴性对照组（α-MEM + 5% FBS）；
3. 维生素C组（α-MEM、5% FBS、10 mM β-甘油磷酸钠、10⁻⁷ M 地塞米松 + 100 uM 维生素C）；
4. 和10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃组（α-MEM、5% FBS、10 mM β-甘油磷酸钠、10⁻⁷ M 地塞米松 + 10⁻⁷ M 1,25-(OH)₂D₃）。
5. 每孔加入2 mL培养基，置于37 °C培养箱中培养，每周更换两次培养基。

5. 逆转录/实时定量聚合酶链式反应

1. 成骨细胞分化培养 7 天后，使用商用试剂（参见材料表）在冰上提取总 RNA：
   1. 向每个孔中加入 1 mL 裂解试剂，再加入 200 µL 溴氯丙烷，静置 10 min 以形成分层的 RNA，然后在 4 °C 下以 10,000 rpm 离心 15 min。
   2. 离心后，向含有 RNA 的 500 µL 上清液中加入 500 µL 异丙醇。在冰上沉淀 RNA，并静置 15 min 进行反应。
   3. 操作完成后，在 4 °C 下以 12,000 rpm 离心 15 min，此时 RNA 位于管底。随后用 1 mL 75% 乙醇洗涤去除上清液，并在 4 °C 下以 7,500 rpm 离心 8 min。
   4. 弃去上清液，使用真空浓缩仪将管底残留液体中的 RNA 沉淀干燥，然后用水溶解回收 RNA。
2. 使用禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶对 RNA（1 μg）进行逆转录。设定聚合酶链式反应（PCR）程序：25 °C 反应 10 min，随后 50 °C 反应 60 min，再 85 °C 反应 5 min，最后维持在 4 °C。
3. 合成第一链互补 DNA（cDNA）。使用 1:10 稀释的 cDNA 各 5 μL 进行定量 PCR（qPCR）。采用 ALP、BSP、OCN、CBFA1 和胶原蛋白-1 的引物进行定量逆转录 PCR（qRT-PCR）。
   注意：为避免信号受到 DNA 污染，每对引物的正向和反向序列均设计于不同的外显子上。
4. 按照生产商说明书，使用商用 PCR 主混合液（参见材料表）进行 qPCR。设定热循环仪程序：50 °C 反应 2 min，随后 95 °C 反应 10 min，接着进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 s 和 60 °C 退火延伸 60 s。
   注意：SYBR 法还需进行熔解曲线分析，程序为 95 °C 15 s、60 °C 60 s，再 95 °C 15 s。
5. 将 ALP、BSP、CBFA1、胶原蛋白-1 和 OCN 的循环阈值（Ct 值）归一化至内参基因 GAPDH 的水平。³⁴
6. 引物序列列于材料表中。

6. 碱性磷酸酶活性

1. 使用先前所述的技术评估细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性³⁵，该酶可将 p硝基苯磷酸盐至 p-硝基苯酚； p对硝基磷酸盐是一种磷酸酶底物，在碱性磷酸酶（ALP）作用下脱磷酸后会变为黄色，于405 nm波长处测定。对总值进行归一化处理 p根据Bradford法测定的总蛋白量，计算形成的硝基苯酚。
2. 比较对照组（α-MEM，5% FBS）、维生素C组（α-MEM，5% FBS，10 mM β-甘油磷酸钠，10⁻⁷ M 地塞米松 + 100 uM 维生素C），1,25-(OH)₂D₃ （α-MEM，5% FBS，10 mM β-甘油磷酸钠，和10⁻⁷ M 地塞米松 + 10⁻⁸ M 1,25-(OH)₂D₃）以及维生素C + 1,25-(OH)₂D₃ （α-MEM，5% FBS，10 mM β-甘油磷酸钠，10⁻⁷ M 地塞米松 + 100 uM 维生素C + 1,25-(OH)₂D₃培养1、2、3和4周后各组
3. 在冰上进行蛋白质提取操作：
   1. 从6孔板中刮下细胞，并加入50 µL裂解缓冲液。随后将细胞置于冰上30分钟，以裂解细胞并释放蛋白。
   2. 30分钟后，在4 °C下以13000 rpm离心15分钟。离心后，收集上清液用于储存和使用。

结果

所有定量实验的数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。所有统计分析均采用 Student t 检验进行。共获得 34 份样本，参与者的平均年龄为 48.1 ± 12.3 年。其中 11 份样本来自男性患者，23 份来自女性患者。28 份样本取自磨牙区，6 份取自前牙区；26 份来自上颌，8 份来自下颌。牙科操作与培养之间的平均时间为 0.5 ± 0.1 小时。在 34 份被检测的样本中，20 份成功获得了间充质干细胞（MSC）克隆，成功分离率为 58.8%。在成功与未成功分离的牙髓细胞（PDC）之间，各项参数均未观察到显著差异（平均年龄：48.8 ± 13.0 对 47.1 ± 11.5 年，性别：7 名男性 [35%] 对 4 名男性 [28.6%]，取材部位：磨牙区 15 例 [75%] 对 13 例 [92.9%]，上颌 15 例 [75%] 对 11 例 [78.6%]）。

细胞分离与形态学：成骨、成软骨及成脂分...

讨论

一种近期开发的治疗方式，即包含间充质干细胞（MSCs）的组织工程，具有多种优势。MSCs存在于多种组织类型中，是一类多能细胞，可分化为多种功能性中胚层组织细胞³⁷以及其他细胞，如成骨细胞。

骨膜为祖细胞提供生态位，同时为其包绕的骨组织提供丰富的血管供应³⁸在本研究中，34个被检测样本中有20个成功获得了间充质干细胞（MSC）集落，成功分离率为58.8%。本研究选择来源于骨膜的MSCs，依据为其增殖能力及成骨分化能力。骨膜来源细胞的增殖速率明显高于骨髓基质细胞。²²关于骨膜的成骨能力，Ousual²⁴ 有研究认为，骨膜来源干细胞（PMSCs）的成骨能力逊于骨髓间充质干细胞（BMSCs）。然而，Yoshimura 证实 PMSCs 的成骨能力优于 BMSCs³⁹. Hayashi 等证明骨膜来源的成体间充质干细胞是骨组织再生的理想候...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐	Sigma	49752
35 mm 培养皿	康宁	430165
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma	I5879
6  孔板	康宁	3516
碱性磷酸酶	ABI	Hs01029144_m1
碱性磷酸酶活性比色法检测试剂盒	BioVision	K412-500
禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶	罗氏	10109118001
CD146	BD	561013
CD19	BD	560994
CD34	BD	560942
CD44	BD	561858
CD45	BD	561088
CD73	BD	561014
CD90	BD	561974
细胞冻存液1	ZEAOAQ	11888
核心结合因子α-1	ABI	Hs00231692_m1
地塞米松	Sigma	D4902
DPBS	Gibco	14190250
FBS	Gibco	26140-079
GAPDH	ABI	Hs99999905_m1
HLA-DR	BD	562008
吲哚美辛	Sigma	I7378
胰岛素	sigma	91077C
胰岛素–转铁蛋白–硒-A	Sigma	I1884
MicroAmp 快速 96 孔反应板（0.1 ml）	生命	4346907
MicroAmp 光学粘性膜	生命	4311971
最低必需培养基1X α修改型	HyClone	SH30265.02
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
透化缓冲液	eBioscience	00-8333-56
丙酮酸钠	Gibco	11360070
STRO-1	BioLegend	340103
SYBER Green PCR Master Mix	AppliedBiosystems	4309155
TaqMan Master Mix	生命	4304437
转化生长因子-β	Sigma	T7039
Trizol试剂（用于RNA提取）	生命	15596018
β-甘油磷酸盐	Sigma	G9422
胶原蛋白-1	Invitrogen	上游引物 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 反向引物 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN	Invitrogen	上游引物 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' 反向引物 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
骨唾液酸蛋白	Invitrogen	上游引物 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'' 反向引物 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
商用 ALP 引物
商用 CBFA1 引物