我们提出了一种研究维生素C和1,25-二羟基维生素D[1,25-(OH)2D3]诱导的骨膜来源细胞（PDCs）中mRNA表达生物标志物的实验方案。此外，我们评估了PDCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）存在于多种组织中，可分化为多种细胞类型，包括成骨细胞。在牙源性MSCs来源中，骨膜是一种易于获取的组织，其生发层已被证实含有MSCs。然而，这一来源尚未得到广泛研究。
维生素D3 和 1,25-(OH)2D3 已被证明可刺激 体外 间充质干细胞向成骨细胞的分化。此外，维生素C有助于胶原蛋白的形成和骨细胞的生长。然而，目前尚无研究探讨维生素D的作用3 以及维生素C对MSCs的影响。
本文介绍了一种从人牙槽骨膜中分离间充质干细胞（MSCs）的方法，并检验了1,25-(OH)2D3 可能对这些细胞产生骨诱导作用的假设。我们还研究了人牙槽骨膜中MSCs的存在情况，并评估了干细胞的黏附性与增殖能力。为评估维生素C（作为对照）以及不同浓度的1,25-(OH)2D3（10−10、10−9、10−8 和 10−7 M）对分离获得的MSCs中关键mRNA生物标志物的影响，采用实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测碱性磷酸酶（ALP）、骨唾液酸蛋白（BSP）、核心结合因子α-1（CBFA1）、I型胶原蛋白（collagen-1）和骨钙素（OCN）的mRNA表达水平。
引言
尽管近年来已开发出多种相关技术，骨重建仍受到多重限制，且常常无法准确评估所需重建的范围。为了实现美学效果、功能需求以及良好的长期成功率，必须进行硬组织增量。此类手术常用的方法包括自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植和人工合成骨移植。在各种骨移植类型中，自体骨移植被认为是最有效的。然而，供区并发症、血供受损以及可获取组织量有限1一直是自体骨移植的主要缺点。此外，同种异体骨移植和异种骨移植存在疾病传播的风险。目前，合成骨移植材料被广泛用于解决上述问题。但由于缺乏成骨潜能，其临床效果差异较大。诸如纤维素等材料还存在体积不稳定、感染风险以及机械强度不足等问题。
利用组织工程技术进行骨增量已引起广泛关注。该技术首先使用间充质干细胞（MSCs）促进成骨细胞分化，随后将分化后的细胞移植至骨缺损部位以实现骨修复。目前该方法已应用于细胞治疗领域。与其他方法相比，通过获取少量组织来实现骨重建的操作更为简便且侵入性更小。
间充质干细胞（MSCs）作为基于细胞治疗手段用于牙体再生的潜在工具，正受到多个研究团队的广泛关注。研究表明，MSCs可来源于以下组织类型：骨髓、脂肪组织、滑膜、周细胞、松质骨、人脐带以及牙源性组织2,3。MSCs的常见来源包括骨髓、脂肪组织和牙源性组织。与来源....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究方案已获长庚纪念医院机构审查委员会批准。所有参与者均签署了书面知情同意书。
1. 组织制备
- 在牙科手术期间从患者身上采集骨膜组织（图1）。在局部麻醉下翻瓣后，使用骨膜剥离器从牙槽骨上取下一小块骨膜组织31。
- 采集后，将大小约为5 mm × 2 mm的骨膜组织片置于含300 U/mL青霉素和300 mg/mL链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中保存，并在24小时内转移至实验室。
- 用手术刀将牙槽骨骨膜组织切碎至细小碎片，并将样本置于传代0代培养基中（含300 U/mL青霉素、300 mg/mL链霉素、α-MEM和5%胎牛血清[FBS]），在37 °C、加湿空气（5%二氧化碳）的培养箱中培养。培养箱内需放置水盘以维持湿度。
- 3天后首次换液，之后每周更换两次培养基。
- 当细胞达到亚汇合状态（80%）时，在培养箱（37 °C）中加入200 µL 0.25%胰蛋白酶消化3分钟，随后加入4.5 mL培养基终止反应。
- 将细胞重新接种于新鲜的第1代培养基中（α-MEM、10% FBS、100 单位/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），接种密度为5 × 103 个细胞（通过血细胞计数板计数确定）。
- 每次后续传代均在细....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
所有定量实验的数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。所有统计分析均采用 Student t 检验进行。共获取34份样本，参与者平均年龄为48.1 ± 12.3岁。其中11份样本来自男性患者，23份来自女性患者。28份样本取自磨牙区，6份取自前牙区；26份来自上颌，8份来自下颌。牙科操作至接种培养的平均时间为0.5 ± 0.1小时。在34份被检测的样本中，20份成功获得了间充质干细胞（MSC）克隆，成功分离率为58.8%。在成功与未成功分离的PDCs之间，各项参数均未观察到显著差异（平均年龄：48.8 ± 13.0 vs. 47.1 ± 11.5岁；性别：男性7例[35%] vs. 4例[28.6%]；取材部位：磨牙区15例[75%] vs. 13例[92.9%]，上颌15例[75%] vs. 11例[78.6%]）。
细胞分离与形态学：成骨、成软骨及成脂分化
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
一种近期开发的治疗方式，即包含间充质干细胞（MSCs）的组织工程，具有多种优势。MSCs存在于多种组织类型中，是一类多能细胞，可分化为多种功能性中胚层组织细胞37以及其他细胞，如成骨细胞。
骨膜为祖细胞提供生态位，同时为其包绕的骨组织提供丰富的血管供应38在本研究中，34个被检测样本中有20个成功获得了间充质干细胞（MSC）集落，成功分离率为58.8%。本研究选择来源于骨膜的MSCs，依据为其增殖能力及成骨分化能力。骨膜来源细胞的增殖速率明显高于骨髓基质细胞。22关于骨膜的成骨能力，Ousual24 有研究认为，骨膜来源干细胞（PMSCs）的成骨能力逊于骨髓间充质干细胞（BMSCs）。然而，Yoshimura 证实 PMSCs 的成骨能力优于 BMSCs39. Hayashi 等证明骨膜来源的成体间充质干细胞是骨组织再生的理想候.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究方案已获得长庚纪念医院临床研究机构审查委员会批准（IRB99-1828B、100-3019C、99-3814B、102-1619C、101-4728B 和 103-4223C）。本研究由长庚纪念医院资助（CMRPG392071、CMRPG3A1141、CMRPG3A1142 和 NMRPG3C0151）。本手稿由 Wallace Academic Editing 进行编辑。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐 | Sigma | 49752 | |
| 35 mm 培养皿 | 康宁 | 430165 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma | I5879 | |
| 6 孔板 | 康宁 | 3516 | |
| 碱性磷酸酶 | ABI | Hs01029144_m1 | |
| 碱性磷酸酶活性比色法检测试剂盒 | BioVision | K412-500 | |
| 禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶 | 罗氏 | 10109118001 | |
| CD146 | BD | 561013 | |
| CD19 | BD | 560994 | |
| CD34 | BD | 560942 | |
| CD44 | BD | 561858 | |
| CD45 | BD | 561088 | |
| CD73 | BD | 561014 | |
| CD90 | BD | 561974 | |
| 细胞冻存液1 | ZEAOAQ | 11888 | |
| 核心结合因子α-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
| HLA-DR | BD | 562008 | |
| 吲哚美辛 | Sigma | I7378 | |
| 胰岛素 | sigma | 91077C | |
| 胰岛素–转铁蛋白–硒-A | Sigma | I1884 | |
| MicroAmp 快速 96 孔反应板（0.1 ml） | 生命 | 4346907 | |
| MicroAmp 光学粘性膜 | 生命 | 4311971 | |
| 最低必需培养基1X α修改型 | HyClone | SH30265.02 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 透化缓冲液 | eBioscience | 00-8333-56 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360070 | |
| STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
| SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
| TaqMan Master Mix | 生命 | 4304437 | |
| 转化生长因子-β | Sigma | T7039 | |
| Trizol试剂（用于RNA提取） | 生命 | 15596018 | |
| β-甘油磷酸盐 | Sigma | G9422 | |
| 胶原蛋白-1 | Invitrogen | 上游引物 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 反向引物 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |
| OCN | Invitrogen | 上游引物 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' 反向引物 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |
| 骨唾液酸蛋白 | Invitrogen | 上游引物 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'' 反向引物 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |
| 商用 ALP 引物 | |||
| 商用 CBFA1 引物 |
参考文献
- Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
- Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Or....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
