方法文章

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法表征合成聚合物

DOI：

10.3791/57174

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2018年6月10日

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1Department of Chemistry, Tulane University

本文内容

摘要

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本文描述了一种用于合成聚合物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）表征的实验方案，包括样品制备、谱图采集和数据分析的优化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表征合成均聚物的方法有多种，但很少有技术能像基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）那样为端基分析提供如此有用的信息。本教程演示了使用 MALDI-TOF MS 对合成聚合物进行样品制备、谱图采集和数据分析的优化方法。样品制备过程中的关键参数包括基质的选择、合适的阳离子化盐的确定，以及基质、阳离子和分析物相对比例的调节。采集参数同样重要，例如模式（线性或反射）、极性（正离子或负离子）、加速电压和延迟时间。若已知聚合物合成所涉及的化学反应，并对数据采集参数和样品制备条件进行优化，则应能获得具有足够分辨率和质量准确度的谱图，从而明确鉴定大多数均聚物（质量低于 10,000）的端基，同时确定其重复单元质量和整体分子量分布。尽管本教程仅以有限种类的聚合物为例进行演示，但这些通用技术可广泛应用于更多类型的合成聚合物以测定其质量分布；然而，端基鉴定仅适用于分散度较窄的均聚物。

引言

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随着活性聚合技术的进步，带有定量官能化端基的精密聚合物正变得日益可得1。同时，叠氮-炔烃和硫醇-烯烃点击化学的发展实现了大分子与其他官能团之间近乎定量的偶联，从而能够获得多种杂化材料2，3，4。然而，要表征这些聚合物偶联反应的起始原料和产物，需要精确的分析技术。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种有价值的软电离分析技术，可用于聚合物表征，因其能够以单一电荷态生成聚合物离子，并产生极少的碎片5，6。相较于其他常规聚合物表征方法，MALDI-TOF MS 具有显著优势，能够提供聚合物质量分布中各个 n 聚体的分辨质谱。因此，此类质谱可提供关于数均分子量、重复单元质量及分子量分散度的精确信息7，进而揭示诸如链转移等竞争性聚合机理8。此外，MALDI-TOF MS 在提供聚合物端基信息方面尤为强大9，10，可用于确认端基修饰10，11及其他转化反应12，例如聚合物环化反应11，13。同样重要的是，质谱分析所需的样品量极小（亚微克级），使得该技术在仅有痕量材料可供使用时仍可用于表征。

聚合物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析可分为四个明确步骤：样品制备、仪器校准、谱图采集和数据分析。样品制备是获得优化MALDI-TOF质谱图的最关键步骤，需在将样品引入仪器之前完成14,15。选择与聚合物分析物具有相似溶解度参数的合适基质，对于获得高质量的MALDI-TOF质谱图至关重要，有关基质选择的指导原则已有文献报道14,15,16,17。此外，已有在线发布的聚合物MALDI样品制备"配方"数据库18。对于新型聚合物，可通过首先了解其溶解性，并选择具有相似溶解度参数的基质来确定合适的基质14,19。具有高质子亲和力的聚合物可被大多数基质（通常含有羧酸基团）质子化14，但其他聚合物则需要使用阳离子化试剂14。碱金属离子易与含氧物种（例如聚酯和聚醚）形成加合物，而不饱和烃类（例如聚苯乙烯）则倾向于与银、铜等过渡金属离子形成加合物14,19。由于本实验中的聚合物样品主链含有氧原子，因此选用三氟乙酸钠或三氟乙酸钾（TFA）作为阳离子化试剂。在选定基质和阳离子化试剂后，必须仔细优化分析物、阳离子试剂与基质之间的相对比例，以确保获得高信噪比信号。本实验中样品制备的参数已经过优化，但采用一种经验性的样品优化方法（步骤1.4.1，图1），系统性地改变三种组分（分析物、基质和阳离子）的浓度，可有效快速确定其最佳比例。

数据采集还需要优化多个参数。最重要的参数包括质谱仪的正离子或负离子模式、仪器工作模式（线性模式与反射模式）、加速电压以及提取延迟时间。另一种提高分辨率的方法是采用"反射式飞行时间"模式20,21,22,23。反射式模式通过在飞行管末端将离子反射回靠近离子源的检测器，实质上使离子的飞行路径长度增加一倍，同时对具有不同动量的离子进行重新聚焦，从而提高分辨率，但会降低信号强度。此外，通过降低激光功率可以获得更高分辨率的谱图，因为较低的激光功率可减少碰撞的数量和能量，从而最小化信噪比，减少碎片化和动能不均一性24。通过调节所有这些参数，可以使离子聚焦，以最小化激光解吸过程中初始位置或速度不均一所带来的影响。当采集参数被优化后，通常可实现质量超过10,000 Da离子的同位素分辨，尽管这还取决于飞行管的长度和仪器设计。大多数含有至少一个杂原子的有机化合物容易与锂、钠和钾等碱金属阳离子形成配合物。许多碱金属为单一同位素或同位素种类有限，因此不会导致同位素分布变宽。

尽管可以通过调整仪器参数来优化数据的精密度，但只有通过适当的校准才能实现数据的准确性11。蛋白质和多肽最初被用作校准物，因其具有单一分散性和易得性，但其稳定性易变且常含有杂质25。更具成本效益且更稳定的替代物包括无机簇和多分散性聚合物26,27,28,29。然而，这些替代物存在质量分布较宽的问题，使质荷比归属变得复杂，且整体分子量较小，仅适用于10,000 Da以下的校准。为解决这些问题，Grayson et al.25 开发了一种基于树状大分子的聚酯质谱校准体系，该体系具有单一分散性，且具备广泛的基质和溶剂兼容性、长期储存稳定性（> 8年）以及较低的生产成本。基于该体系的诸多优势，本实验选择其作为校准物。

校准主要有两种类型：内标法和外标法30。进行外标校准时，将质量范围涵盖待测物的标准品置于与待测物不同的样品位置上，点样于MALDI靶板，从而获得独立的质谱图，用于生成校准文件。相比之下，内标校准通常可实现更高的准确性，该方法是将校准物与待测物混合，获得同时包含校准物和待测物信号的混合谱图。在下述实验流程中，采用的是外标校准法。在完成质谱标度的正确校准后，即可获取准确的待测物质量数据。为确保校准结果尽可能准确，应在校准完成后尽快进行数据采集。

最后，获取经过优化和校准的数据集后，对数据进行分析以获得聚合物样品的结构信息。聚合物分布中n聚体之间的间距可提供重复单元质量的精确测量。数均分子量（Mn）以及其他质量分布计算（例如，Mw （重均分子量）和 Đ （分散度）也可以通过质谱信号分布来确定（计算方法见步骤4.2）。或许最为独特的是，对于均聚物，可通过测定聚合物分布相对于仅由重复单元质量推算出的质量偏移量，来确认端基总质量。信息丰富的MALDI-TOF质谱提供了有价值的表征数据，可与尺寸排阻色谱、傅里叶变换红外光谱和核磁共振等传统聚合物表征技术相互补充。

方案

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注意：所有反应均应在通风橱中进行。请阅读所用化学品的全部材料安全数据表（MSDS），并采取适当的预防措施。

1. 样品制备

  1. 基质储备溶液的制备
    1. 将 20 mg 的 α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）溶解于 1 mL 未稳定化的四氢呋喃（THF）中，涡旋振荡至完全溶解。
    2. 将 20 mg 的 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶解于 1 mL THF 中，涡旋振荡至完全溶解。
  2. 碱金属阳离子储备溶液的制备
    1. 将 2 mg 的三氟乙酸钠（NaTFA）溶解于 1 mL THF 中，涡旋振荡至完全溶解。
    2. 将 2 mg 的三氟乙酸钾（KTFA）溶解于 1 mL THF 中，涡旋振荡至完全溶解。
  3. 分析物储备溶液的制备
    1. 样品 1：将 2 mg 的聚乙二醇 2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）溶解于 0.5 mL THF 中，涡旋振荡至完全溶解。
    2. 样品 2：将 2 mg 的双叠氮基聚氧乙烯（Mn = 2000）溶解于 0.5 mL THF 中，涡旋振荡至完全溶解。
    3. 样品 3：将 2 mg 的巯基封端聚（L-丙交酯）（Mn = 2500）溶解于 0.5 mL THF 中，涡旋振荡至完全溶解。
  4. 用于分析的样品混合物的制备
    1. 通过混合基质、分析物和阳离子溶液，同时改变各组分的相对比例，制备一系列溶液，共制得九种不同的样品混合物。例如，在保持加入的基质储备溶液体积恒定（例如，10 µL）的情况下，将分析物溶液体积按三倍比例变化（例如，45、15 和 5 µL），同时将阳离子溶液体积也按三倍比例变化（例如，9、3 和 1 µL）。这些样品在二维坐标系中形成一个 3 × 3 的样品矩阵，两个浓度变量分别对应于 x 轴和 y 轴（图 1）。
    2. 以代表性示例为例，将 15 µL 聚（L-丙交酯）溶液、15 µL DHB 溶液和 1 µL NaTFA 溶液混合。
    3. 用移液器将每种溶液混合物各取 1 μL，逐滴加入 MALDI 目标靶板的各个样品孔中（图 2）。应分次少量加入样品，防止样品溢出样品孔，并在每次加样后等待前一份样品完全蒸发干燥，再加入下一份样品。
      注：对于沸点较高的溶剂，可使用吹气装置加速溶剂蒸发，但需注意避免加热样品靶板，以防靶板发生翘曲。
  5. 校准用标准样品的制备
    1. 按照推荐供应商的操作规程制备校准标准品。
      注：本研究选用树枝状大分子校准物，该类校准物可作为纯品获得，也可预先与基质、校准物和阳离子按优化比例混合后获得。

2. 数据采集优化

  1. 启动数据采集
    1. 开源数据采集软件“FlexControl”。
    2. 弹出平台以加载目标板，方法是按下“Static equilibrium concept, ΣF=0 symbol, diagram; equilibrium system, force balance, physics education.“按钮。
    3. 将已加入校准品和待测样本的目标板轻轻放置在平台上的适当位置。
    4. 使用采集软件，通过按下“平台上的目标板注入”按钮来注入目标板Static equilibrium concept, ΣF=0 symbol, diagram; equilibrium system, force balance, physics education.“按钮。
    5. 选择合适的数据采集方法（正离子模式采集方法），通过按下 文件 | 选择方法.
      注意：对于大多数聚合物样品，包括本研究的代表性分析物，预期通过与阳离子形成复合物而实现电离，因此应采用正离子模式进行检测。根据仪器型号，若检测质量范围较低（500–10,000 Da）或需要更高分辨率，应选择反射模式的方法文件；对于分子量较高的样品，或需要更高信号灵敏度且可接受较低分辨率的情况，应选择线性模式的方法文件。
    6. 在采集数据之前，请确保已选择合适的数据采集质量范围——理想情况下，该质量范围应包含预期分布中最低质量的一半以及预期分布中最高质量的两倍。可通过点击 检测 标签与查看 质量范围.
      注意：这有助于确保包含样品中可能存在的低分子量降解片段或高分子量聚集体（如二聚体）所产生的信号。此外，需注意在大多数MALDI-TOF质谱图中，基质寡聚物常以高强度信号出现，产生高达1,000 Da的质量范围内的高强度噪声，从而干扰该质量范围以下的分析。尽管在获得最终数据集之前需要进行校准，但只有在使用针对特定分析物优化的相同采集参数时，才能获得准确的校准文件。因此，在校准前必须首先对分析物的质谱进行初步优化，随后重新采集经校准的分析物质谱。
  2. 初步数据采集
    1. 从采集软件中选择与目标分析物相对应的靶板位置。
    2. 在移动激光靶以最大化信号的同时，开始采集数据。要启动数据采集，请按下 开始.
      注意：激光在某一位置重复取样后可能会耗尽基质。
    3. 使用相机窗口左侧的滑动条调节激光功率，使达到同位素分辨所需的最低功率。
      注意：在分析多个样品以确定分析物、阳离子和基质的最佳比例时，应对每个分析物样品使用相同的激光功率，以确定在该采集参数下哪个样品表现出最佳的信噪比。后续的采集参数优化应继续使用信噪比表现最佳的样品进行。
  3. 数据采集优化
    1. 在感兴趣的质量范围中间选择一个单独的峰进行放大，通过调整加速电压差（对于本研究中的仪器，涉及调整“IS2”值）来优化分辨率，该值位于 光谱仪 表。
      注意：通过以较大幅度调整IS2值并观察哪个值能产生最佳分辨率，可最快完成优化（即，即半峰全高信号强度下的最小峰宽），然后以更小的步长进一步优化IS2值。通常，低分子量聚合物的最优IS2值较高（更接近IS1），而高分子量聚合物的最优IS2值较低。
    2. 必要时，可使用反射模式提高分辨率。
      注意：反射器模式可补偿相同离子初始速度的差异 m/z 通过迫使相同种类中速度较高的离子 m/z 值进入检测器的更长路径。这种到检测器路径的增加使得具有相同质荷比的较慢离子能够 m/z 使离子同时到达检测器，从而实现离子聚焦以提高分辨率。尽管反射模式通常可改善信号分辨率，但对于信号强度较弱的样品，可能需要采用线性模式才能观察到数据。
    3. 最后，通过将激光功率降低至尽可能低，同时仍能产生合理的信噪比，来优化激光功率。例如信噪比约为10。
      注意：由于较高的激光功率通常会降低分辨率并可能引起碎片化，因此应采用较低的激光功率和较多的扫描次数来获得质量最佳的质谱图。
    4. 一旦采集参数优化完成，通过选择保存未校准的质谱图 文件 然后 将光谱保存到文件为进行外部校准时，在启动新的采集之前，必须在相同的优化参数下重新采集校准物的信号，以获得待测物的校准后质谱。

3. 基质辅助激光解吸电离校准

  1. 获取校准质谱
    1. 使用已为分析物优化的采集参数，采集质量标准样品的优化质谱。
      注意：理想情况下，校准标准品应包括一个高于目标范围、一个低于目标范围，以及至少一个位于目标范围内的标准品。若两个样品的采集参数完全相同，则校准的准确性最佳。
  2. 创建校准文件
    1. 确保通过点击 校准无效（Invalidate Calibration）按钮，在 质谱仪 选项卡下清除任何现有校准或使其可被覆盖。
    2. 使用相同的采集参数（例如，激光功率、IS2电压），通过光标选择含有校准物的样品孔（例如，树枝状聚合物标准品、肽段），将激光移至该孔位，并点击 开始 以采集质谱。
  3. 当获得足够信号后，点击 开始 以结束数据采集。
  4. 在校准物质的质谱采集完成后，在 校准 选项卡中选择与该校准标准品对应的 质量控制列表 下拉菜单。适当的质量控制列表应包含所选校准物的参考质量及其相应的阳离子形式。
    注意：这些信息通常由校准物供应商提供。当实现同位素分辨时（例如，反射模式下 m/z < 5000），应使用单一同位素质量值；当无法实现同位素分辨时（例如，线性模式下 m/z > 5000），应使用平均质量值。
  5. 在将每个选定的校准峰与相应的参考峰匹配之前，通过选择 处理 选项卡，确保使用了适当的峰提取方法。
    注意：峰提取方法可能因谱图分辨率而异。对于平均质量计算，软件应计算整个同位素峰系列的质量平均值；对于单一同位素质量计算，软件应设置为仅计算第一个同位素峰的精确质量。
  6. 通过选择目标峰左侧区域，然后点击质量控制列表中对应的参考质量，将质量控制列表中的参考质量应用到校准物质质谱中相应的信号峰上。对剩余的校准峰重复此过程。
    注意：为获得最准确和精确的校准，应将分析物和校准物样品尽可能靠近地点样于靶板上，因为靶板高度的微小差异可能影响校准的准确性。
  7. 在校准优化采集参数下的质量标度后，重新采集分析物的质谱。

4. 数据分析与解释

  1. 峰提取
    1. 在数据分析软件（FlexAnalysis）中打开分析物谱图。
    2. 通过点击 Zoom in X-Range 按钮，放大某个峰，以判断是否已实现同位素分辨。
    3. 按下 Mass List | Find 以选择峰。如果单一同位素峰已被分辨，则首先选择同位素分布中的该单一同位素峰，并使用单一同位素峰提取方法确定其质量。如果单一同位素峰未被分辨，则使用平均质量峰提取方法，确定整个同位素分布的平均质量。
    4. 对聚合物分布中的每个 n-聚体重复上述峰提取过程。
  2. 聚合物表征与端基分析计算
    注：若使用得当，MALDI-TOF 质谱可为聚合物质量分布计算提供有价值且准确的数据。需注意的是，仅当聚合物样品的分散度相对较低时（例如，约 Đ = 1.3 或更低），质量分布数据才具有准确性。
    1. 使用以下公式计算数均分子量，即相对于各质量组分摩尔数的质量平均值：
      数均分子量公式；高分子化学方程
      其中 Ni = 特定分子量的分子数量，Mi = 这些分子的特定分子量。
    2. 使用以下公式计算重均分子量，即相对于各质量组分质量的质量平均值：
      分子量计算公式，ΣNiMi²/ΣNiMi，用于高分子科学研究。
      其中 Ni = 特定分子量的分子数量，Mi = 这些分子的特定分子量。
    3. 在计算出 Mw 和 Mn 后，通过比值 Mw/Mn 来量化分子量分布的宽度，该比值称为分散度 Đ。
    4. MALDI-TOF 质谱数据分析最独特且强大的功能之一是能够确定或验证均聚物的端基。可通过重新整理以下公式来确定端基：质量谱图中 n-聚体的观测质量（Mn-mer）：
      Mn-mer = n(MRU) + MEG1 + MEG2 + Mion
      其中 n = 聚合度，
      MEG1 = α-端基的质量，
      MEG2 = ω-端基的质量，
      MRU = 聚合物重复单元的质量，
      以及 Mion = 与聚合物形成复合物的离子质量。

结果

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样品1：采用三氟乙酸钾作为阳离子化试剂，以HCCA为基质，对聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）样品（图3）进行分析。质谱图中出现了预期的K+加合物，以及由残留Na+产生的加合物峰。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）证实了聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）具有较窄的分子量分布（图3）。由于单一同位素峰（仅由最丰富的元素同位素组成，即12C、1H、16O和14N）未能充分分辨以实现准确识别，因此采用峰选取分析方法，该方法通过测定每个n聚体峰在整个同位素分布范围内的平均质量来确定其质量。同样，所有理论计算也均基于各元素的平均质量而非单一同位素质量进行。根据步骤4中的公式，使用分析软件计算出该聚合物分子量分布的以下特征参数：Mn：4700，Mw：4710，Đ：1.00。

为了确认端基的结构，选取了一个单独的104聚体（104-mer）进行进一步分析（图4）。与质量分布计算类似，由于无法分辨单一同位素峰，后续计算使用了平均质量值。聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸104聚体的理论质量值由重复单元的质量（44.0530 × 104）加上α-氨基端基的质量（+16.02300）和ω-羧基端基的质量（+59.0440），再加上钾阳离子的质量（+39.09775）组成，总质量为4695.67675。实测得到的104聚体加钾离子（104-mer + K+）质量值为4695.5，考虑到平均质量计算的精度，该值与理论值相符。谱图中一系列较小且偏移的峰对应于与钠离子结合的聚合物离子，其104聚体的理论质量值由重复单元的质量（44.0530 × 104）加上α-氨基端基的质量（+16.02300）、ω-羧基端基的质量（+59.0440）以及钠阳离子的质量（+22.98922）组成，总质量为4679.56822。实测得到的104聚体加钠离子（104-mer + Na+）质量值为4679.4，仅比理论值低0.2 Da。通过测量多个峰的平均值，可更准确地确定端基质量，相关内容已在其他文献中讨论过11。

聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）样品在与2,4-二硝基氟苯（DNFB）选择性反应功能化后（图5），仍保持其较窄的分布。该谱图显示了钠加合物，并使用HCCA作为基质（图6）。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）证实了聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）经DNFB修饰后具有较窄的分子量分布（图6）。根据步骤4中的公式，使用分析软件计算出该聚合物分子量分布的以下特征参数：Mn：4940，Mw：4950，Đ：1.00。

为了确定聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）是否已与DNFB完全发生功能化反应，选取了该分布中的一个特定n-聚体进行分析（图7）。经2,4-二硝基氟苯反应后的聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸104-聚体的理论质量由以下部分组成：44.0530 × 104（重复单元的质量）+ 182.115（α-氨基与2,4-二硝基氟苯反应后的质量）+ 59.044（羧基质量）+ 22.98922（钠阳离子质量）= 4845.66022。当n = 104时，实测质量值为4845.8，与理论值相差-0.1 Da。理论值与实测值之间的高度吻合表明起始原料已完全转化为产物；更重要的是，在该质荷比范围内未检测到与起始材料相关的信号（如4811.72722和4855.78022）或任何其他副产物，进一步证实了氨基的定量选择性功能化。在4823.8处观察到第二个峰，对应于功能化聚合物的103-聚体，但其羧酸末端失去一个质子并与另一个钠离子形成复合物，其理论质量为4823.58899，与实测值相差-0.2 Da。

样品2：使用三氟乙酸钠作为阳离子化试剂，HCCA作为基质，对聚氧乙烯双(叠氮化物)（Mn = 2000）样品（图8）进行分析，结果仅观察到预期的Na+加合物。

由于在该较低质荷比范围内实现了较高的分辨率，每种n聚体的单一同位素峰均可被轻松分辨，因此选择采用单一同位素峰提取方法（仅对同位素分布中第一个峰的质量信号进行平均），且所有相应的计算均使用各元素的单一同位素质量。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）证实了聚氧乙烯双（叠氮化物）具有较窄的分子量分布（图8）（Mn = 2000）。根据第4步中的公式，利用分析软件计算出该聚合物分子量分布的以下特征参数：Mn：1940，Mw：1950，Đ：1.01。

为了确认端基官能化，选取了一个特定的n聚体（42）进行分析（图9）。与上述质量分布的测定方法相同，使用单一同位素质量，因为在每个n聚体的同位素分布中，单一同位素峰均能被清晰分辨。聚氧乙烯双（叠氮）42聚体的理论质量值为：44.02621 × 42（重复单元的质量）+ 42.00922（叠氮端基的质量）+ 70.04052（叠氮乙基端基的质量）+ 22.98922（钠阳离子的质量）= 1984.13978。实验测得n = 42时的质量值为1983.95，与理论值相差0.19 Da。需要注意的是，尤其在较高激光功率下，叠氮官能团可能产生亚稳态碎片；但在本实验中未观察到此类现象31。

聚氧乙烯双(叠氮化物) (Mn = 2000) 样品在通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应进行选择性功能化后，仍保持其窄分布特性图10）与1-乙炔基-4-氟苯（EFB） (图11) 生成一个4-氟苯基三唑基（FPT）基团。谱图显示了预期的Na+ 使用三氟乙酸钠作为阳离子化试剂、HCCA 作为基质时形成的加合物。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）证实了聚氧乙烯双（叠氮化物）（Mn = 2000）在用 EFB 进行官能化后具有较窄的分子量分布(图 11)。根据步骤 4 中的公式，使用分析软件计算出以下聚合物特性：Mn: 2240，Mw: 2250，Đ: 1.00。

为确认样品功能化的完全性，采用单同位素质量分析选定的单个n聚体（42）图12）。聚氧乙烯双(叠氮化物)的42聚体与1-乙炔基-4-氟苯反应后的理论质量值对应于44.02621 × 42（重复单元的质量）+ 162.04675（FPT端基的质量）+ 190.07805（ FPT 乙基端基（1-乙炔基-4-氟苯）+ 22.98922（钠离子质量）= 2224.21484。当 n = 42 时观测到的质荷比为 2224.16，与理论值相差 0.05 Da。

样品3：采用三氟乙酸钠作为阳离子化试剂对一种端巯基聚(L-丙交酯)（Mn = 2500）样品（图13）进行分析，结果仅观察到预期的Na+加合物，基质为DHB。

MALDI-TOF 质谱确认了聚L-丙交酯巯基封端（Mn = 2500) (图13). 使用第4步中的方程，通过程序分析计算以下聚合物特性：Mn：2310，Mw: 2360, Đ: 1.02.

为确认样品的完全功能化，采用单同位素质量分析了选定的单个n聚体（26）（图14）。聚（L-丙交酯）26聚体（硫醇封端，Mn = 2500）的理论质量值为72.02113 × 26（重复单元的质量）+ 17.00274（羟基的质量）+ 61.0112（ω-硫醇端基的质量）+ 22.98922（钠阳离子的质量）= 1973.55254。当n = 26时，观测到的质量值为1973.62，与理论值相差-0.07 Da。在2045.74处观察到一个较弱的信号，对应于72.02113 × 27（重复单元的质量）+ 17.00274（羟基端基的质量）+ 61.0112（ω-硫醇端基的质量）+ 22.98922（钠阳离子的质量）。其理论质量为2045.57367，与观测质量相差0.17 Da。该微弱信号对应的奇数重复单元表明在乳酸的开环聚合过程中发生了酯交换反应。在2057.73处还观察到第三个极微弱的峰，其值比具有羧酸端基（而非硫醇端基）的聚（L-丙交酯）的理论质量低0.14 Da，该理论质量为72.02113 × 27（重复单元的质量）+ 17.00274（羟基端基的质量）+ 73.02895（羧酸的质量）+ 22.98922（钠阳离子的质量）= 2057.59142。这一额外的微量杂质可能是由于丙交酯单体在开环聚合过程中由水分子引发所致。

聚(L-丙交酯)、巯基封端（Mn = 2500）样品在通过巯基-烯反应与马来酰亚胺选择性功能化后，仍保持其较窄的分子量分布（图15，图16）。质谱图中出现了使用三氟乙酸钠作为阳离子化试剂、DHB 作为基质时预期的 Na+ 加合物峰。

MALDI-TOF 质谱确认了聚(L-丙交酯)硫醇封端（Mn = 2500）在与马来酰亚胺发生巯基-烯反应后（图16). 使用步骤4中的公式，通过分析软件计算以下聚合物特性：Mn：2310，Mw: 2340, 该源文本为空，无内容可翻译。：1.01。需要注意的是，M的减少n 和 Mw 与起始原料相比，这种差异是由于电离偏差所致（MALDI-TOF MS 的缺点之一）。当对起始原料的修饰程度相对较小（在此特定修饰中约为 97 Da）且修饰后分散度降低时，MALDI-TOF MS 对平均分子量的计算可能变得不够准确。

为了确认聚(L-丙交酯)（巯基封端，Mn = 2500）通过巯基-烯烃反应与马来酰亚胺完全功能化，采用单同位素质量对选定的单个n聚体（26聚体）进行了分析（图17）。聚(L-丙交酯)巯基封端26聚体的理论质量值为：72.02113 × 26（重复单元的质量）+ 17.00274（羟基端基质量）+ 158.02757（与马来酰亚胺连接的ω-巯基端基质量）+ 22.98922（钠阳离子质量）= 2070.56891。实验测得n = 26时的质量值为2070.54，与理论值相差0.03 Da。同时观察到该物种与钾离子结合的峰位于2086.49，与理论质量相差0.05 Da。在2167.58处观察到一个非常小的峰，其对应的质量为：72.02113 × 28（重复单元质量）+ 17.00274（羟基端基质量）+ 72.02168（羧酸根阴离子质量）+ 22.98922（钠阳离子质量）+ 38.96371（钾阳离子质量）。该物质的理论质量为2167.56844，与实测值相差-0.01 Da，表明其为起始原料中因水引发而产生的相同微量杂质。该聚合物表现出与一当量钠离子、一当量钾离子结合以及失去一个质子的电离行为。失去羧酸质子并同时与两个阳离子配位是单羧酸功能化聚合物常见的电离模式。值得注意的是，该羧酸封端化合物未出现巯基-烯烃反应产物中所观察到的相同质量偏移，进一步说明其缺乏巯基端基，因而无法发生功能化反应。

基质-反离子相互作用；浓度分析的体积变化图。
图 1：用于确定样品比例的 3 × 3 网格。通过使用 3 × 3 的样品网格，可系统性地改变阳离子化试剂-分析物-基质的相对浓度，从而通过实验确定最优的样品制备条件。通常做法是保持三个变量中的一个恒定（例如 15 µL 分析物溶液），同时以固定倍数（图示示例中为 3 倍）递增另外两个组分（阳离子化试剂（y 轴）和基质（x 轴））的用量。请点击此处查看该图的放大版本。

高通量筛选微孔板示意图；实验室研究中使用的384孔板。
图 2：MALDI-TOF 质谱靶板。 MALDI-TOF 质谱靶板是一种金属板，用于在独立的孔中承载 MALDI-TOF 质谱样品以进行分析。请点击此处查看此图的放大版本。

质谱图分析聚合物的分子量分布，Mn 4700，Mw 4710。
图3：样品1的MALDI-TOF质谱图。该完整谱图显示了以Na+和K+共同离子化的聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）的整体分布情况。请点击此处查看此图的放大版本。

质谱图、聚合物分析、PEG、强度与m/z关系、理论质量与实测质量
图4：样品1单个重复单元的MALDI-TOF质谱图。 该图谱展示了用于端基分析的聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）的单个重复单元。请点击此处查看此图的放大版本。

聚合反应示意图，包含化学方程式；胺类与芳香族化合物发生反应。
图5：样品1修饰的反应路线图。 为确认起始材料的端基，将聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸与2,4-二硝基氟苯（又称桑格试剂）进行反应。 请点击此处查看该图的放大版本。

质谱结果；聚合物分析；m/z 5000 峰；分子结构；Mn 4940，Mw 4950。
图6：样品1修饰物的MALDI-TOF质谱图。 该完整谱图显示了以2,4-二硝基氟苯功能化的聚乙二醇2-氨乙基醚乙酸（Mn = 5000）的整体分布情况。 请点击此处查看此图的放大版本。

质谱图显示峰；PEG分析的平均理论质量和观测质量数据。
图7：样品1修饰后单个重复单元的MALDI-TOF质谱图。 为确认末端基团的功能化，该谱图显示了聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn = 5000）与2,4-二硝基氟苯反应后的单个重复单元。请点击此处查看此图的放大版本。

显示聚合物分子量分布的质谱图；m/z 轴，叠氮聚合物分子式。
图 8：样品 2 的 MALDI-TOF 质谱图。 该完整谱图显示了聚氧乙烯双(叠氮)（Mn = 2000）在与 Na+ 加合物离子化后的整体分布情况。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示 N3-(PEG)41-N3 和 N3-(PEG)42-N3 峰的质谱图，m/z 与强度关系。
图9：样品2单个重复单元的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱。 该图谱展示了聚氧乙烯双叠氮化物（Mn = 2000）的一个重复单元，用于确认端基结构请点击此处查看该图的放大版本。

使用 PMDETA 和 Cu(I)Br 的铜催化叠氮-炔基环加成聚合示意图。
图 10：样品 2 修饰的反应示意图。 为确认起始材料的端基，将聚氧乙烯双叠氮化物（Mn = 2000）通过铜催化的叠氮-炔基环加成反应（CuAAC）与1-乙炔基-4-氟苯反应。请点击此处查看此图的放大版本。

显示聚合物质量分布的MALDI-TOF质谱图；化学结构插图。
图11：样品2修饰后的MALDI-TOF质谱图。 该完整谱图显示了聚氧乙烯双(叠氮化物)（Mn = 2000）与1-乙炔基-4-氟苯功能化后的整体分布情况。请点击此处查看此图的放大版本。

显示单一同位素峰的质谱图；EFB-PEG化合物的理论质量与实测质量分析。
图12：样品2修饰后单个重复单元的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱。 该图谱显示了聚氧乙烯双(叠氮化物)（Mn = 2000）的一个单个重复单元，通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应与1-乙炔基-4-氟苯反应，以确认末端官能团的修饰。 请点击此处查看该图的放大版本。

聚合物结构、强度峰和分子量数据的质谱图。
图13：样品3的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱。 该完整图谱显示了端巯基聚（L-丙交酯）（Mn = 2500）的整体分布情况。 请点击此处查看此图的放大版本。

质谱结果；聚合物分析；单同位素质量数据；m/z 强度图；Δ 值。
图14：样品3单个重复单元的MALDI-TOF质谱图。 该谱图显示了端基为巯基的聚(L-丙交酯)（Mn = 2500）的单个重复单元，用于确认端基结构。请点击此处查看该图的放大版本。

化学合成反应示意图；试剂：TEA, Na₂S₂O₅, DCM；产物：环状酰胺形成。
图15：样品3修饰的反应路线图。 为确认起始原料聚(L-丙交酯)的端基结构，使用硫醇封端（Mn = 2500）的聚合物通过硫醇-烯烃偶联反应与马来酰亚胺反应。请点击此处查看该图的放大版本。

聚合物结构的质谱图，强度 vs. m/z，标注了聚合物质量值。
图16：样品3修饰的MALDI-TOF质谱图。 该完整谱图显示了聚(L-丙交酯)（硫醇封端，Mn = 2500）与马来酰亚胺反应产物的整体分布情况。请点击此处查看该图的放大版本。

质谱图，单同位素质量分析，理论与实测质量数据对比。
图17：样品3修饰后单个重复单元的MALDI-TOF质谱图。 为确认端基官能化，该谱图显示了聚(L-丙交酯)单个重复单元在与马来酰亚胺发生巯基-烯反应后的结果，其为硫醇封端（Mn = 2500）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）是一种用于聚合物表征的极其重要的分析工具，因其能够产生单电荷态且几乎不发生碎片化的聚合物离子。这种软电离技术利用短脉冲激光，使嵌入基质化合物中的聚合物分析物固态样品脱附，从而在气相中生成聚合物离子。大分子通常通过与添加至基质中的阳离子形成复合物而实现离子化，从而使其能够通过质谱进行分析。这些大分子离子随后在提取电压作用下被加速，进入飞行管的无场区域，其质荷比（m/z）可根据离子源与检测器之间飞行时间的测定来确定5,32。

与其他聚合物表征技术相比，MALDI-TOF 质谱图的质量在很大程度上依赖于数据采集参数和样品制备方法。尽管样品制备没有固定的配方，但了解样品制备中各组分的作用有助于更快地进行经验性优化。MALDI 样品制备中最关键的因素是基质的选择，因为基质与聚合物分析物的相容性对于促使激发态基质产生单个脱附的大分子离子至关重要5,15,17,19。在选定合适的基质和阳离子化试剂后，必须确定分析物、基质和阳离子化试剂之间的正确比例。这可以通过在 MALDI-TOF 质谱靶板上（图2）构建一个二维样品阵列（图1）来经验性地实现，其中一个轴上基质浓度递增，另一个轴上阳离子化试剂浓度递增。

与MALDI样品制备类似，数据采集参数的设定并无固定公式，但应考虑某些趋势以加快谱图优化。反射模式可提高分辨率但降低总信号强度，通常用于较低质荷比范围（在本例中为4,000 Da以下），在此范围内可实现同位素分辨。在这些情况下，采用单一同位素质量计算和峰识别方法。对于质量高于4,000 Da的聚合物样品，则使用线性模式，并结合平均质量计算和峰识别方法。为提高信号分辨率，应以小幅度逐步调整离子源电压，总体趋势是质量较大的聚合物需要更大的电压差（IS1与IS2之间）。

尽管优化的样品制备和采集参数可以提高精确度，但只有通过有效的校准才能实现高质量准确性。对于给定质量的飞行时间会因不同的采集参数甚至靶板位置而发生细微变化，因此必须针对每组优化后的采集参数进行校准，以获得准确的质量测定结果5,30。在采集参数和样品制备条件优化完成后，应使用完全相同的条件对质谱图进行校准。

由于在优化后的聚合物MALDI-TOF质谱中观察到极高的分辨率和质量准确性，该技术已成为测定聚合物质量分布数据的一种重要补充工具。然而，与其他聚合物表征技术（如凝胶渗透色谱法（GPC）和核磁共振（NMR））相比，MALDI-TOF质谱在解析聚合物质量分布中各个重复单元方面具有独特优势，特别适用于端基分析。这对于确定端基官能化反应的保真度以及端基偶联反应的定量性质尤为有价值。本文已证明，该方法能够以高达小数点后两位的质量精度解析单个聚合物重复单元的质量，从而高置信度地确认端基修饰。随着近年来在精密聚合物合成领域取得的重大进展，MALDI-TOF质谱正日益成为确定大分子结构与功能的重要工具。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者与本研究中使用的SpheriCal校准品存在经济利益关系。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢由美国国家科学基金会根据合作协定 IIA-1430280 资助的智能材料设计、分析与加工联盟（Smart MAterials Design, Analysis, and Processing consortium，SMATDAP）以及路易斯安那州立大学理事会提供的研究生奖学金（MEP）。本实验所用聚合物样品由 MilliporeSigma（Sigma-Aldrich）提供。  本文的开放获取出版由 MilliporeSigma 资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚氧乙烯双叠氮化物（Mn=2000）MilliporeSigma (Aldrich)689696http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US
聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸（Mn=5000）MilliporeSigma (Aldrich)757918http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US
聚(L-丙交酯)，硫醇封端（Mn=2500）MilliporeSigma (Aldrich)747386http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US
SpheriCal® 肽低浓度MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS20http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US
SpheriCal® 肽中浓度MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS21http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US
SpheriCal® 肽高浓度MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS22http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US
2,4-二硝基氟苯TCIA5512
马来酰亚胺MilliporeSigma (Aldrich)129585http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US
1-乙炔基氟苯 Fisher Scientific766-98-3
三乙胺MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)471283http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US
N,N,N',N",N"-五甲基二亚乙基三胺MilliporeSigma (Aldrich)369497http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US
溴化亚铜(I)MilliporeSigma (Aldrich)254185http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US
冰醋酸Fisher ScientificA38212
亚硫酸氢钠MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)13459http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US
三氟乙酸钾MilliporeSigma (Aldrich)281883http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US
反式-2-[3-(叔丁基苯基)-2-甲基-2-丙烯叉]丙二腈MilliporeSigma (Aldrich)727881http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US
α-氰基-4-羟基肉桂酸MilliporeSigma (Sigma)C8982http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US
四氢呋喃Fisher ScientificT425-1
二氯甲烷VWR AnalyticalBDH1113-4LG

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