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方法文章

膜蛋白间去垢剂敏感性相互作用的检测

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DOI：

10.3791/57179

⸱

2018年3月7日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine

本文内容

摘要

我们以分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的第一个腔内环之间的结合为例，介绍了一种利用去垢剂敏感性检测膜蛋白间相互作用的实验方案。

摘要

研究蛋白质-蛋白质相互作用的能力是理解细胞内调控网络的关键。然而，在许多情况下，检测蛋白质-蛋白质相互作用面临显著的实验挑战。特别是分选受体与其蛋白货物在膜区室腔内的相互作用通常对去垢剂敏感，导致这些蛋白无法通过共免疫沉淀进行检测。分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的结合即为膜蛋白之间微弱腔内相互作用的一个实例。本文中，我们描述了一种快速、简便且经济的检测方法，用于验证sortilin与GLUT4之间的相互作用。为此，我们设计并化学合成了对应于GLUT4腔内区潜在sortilin结合表位的myc标签肽段。将带有六个组氨酸标签的sortilin在哺乳动物细胞中表达，并利用钴珠从细胞裂解液中分离获得。将珠上固定的sortilin与肽段溶液在不同pH条件下孵育，随后通过蛋白质印迹分析洗脱物。该方法可轻松适用于研究其他对去垢剂敏感的蛋白质-蛋白质相互作用。

引言

GLUT4 是一种葡萄糖转运蛋白，主要在脂肪细胞和骨骼肌细胞中表达，在其中介导胰岛素对餐后血糖清除的作用。1作为一种非常稳定的蛋白质，GLUT4在翻译后水平受到调控。在缺乏胰岛素的情况下，GLUT4主要被排除在质膜之外（因此葡萄糖的基础通透性较低），并主要定位于细胞内小的胰岛素响应性囊泡（IRVs）以及反式高尔基网络（TGN），后者很可能是IRV的供体区室。在给予胰岛素后，IRVs与质膜融合，将GLUT4运送至其功能位点，从而增加质膜对葡萄糖的通透性，使葡萄糖从血液进入脂肪细胞和骨骼肌细胞的摄取量升高10至40倍。胰岛素撤除后，GLUT4被内吞至早期内体/分选内体，随后被回收至TGN，在此IRVs重新形成。GLUT4转运途径中的这两个分选步骤， 即 从外周早期内体向核周反式高尔基网络（TGN）的逆向运输，以及在TGN供体膜上胰岛素响应性囊泡（IRVs）的形成，依赖于Vps10p家族成员sortilin的介导。sortilin是一种I型跨膜蛋白和分选受体。根据一种模型，sortilin作为跨膜支架蛋白发挥作用：它在早期内体和TGN腔内结合GLUT4，并在供体膜的胞质侧招募retromer或网格蛋白适配蛋白复合物。 通过 其C末端2,3这有助于将GLUT4分布到囊泡载体中，从而介导GLUT4在细胞内区室间的转位。

sortilin 的细胞质尾区与retromer及多种衔接蛋白之间的相互作用已有充分报道。然而，sortilin 与 GLUT4（及其若干其他蛋白配体）之间的结合一直难以证实。特别是，尝试通过共免疫沉淀检测 sortilin 与 GLUT4 的相互作用均未成功，这可能是由于这两种蛋白之间的相互作用对去垢剂敏感所致。此外，作为典型的转运蛋白，GLUT4 含有12个跨膜结构域和6个腔内环，其中任意组合均可能构成 sortilin 的结合位点。与此同时，大量间接证据（如在细胞内显著共定位、使用膜通透性交联剂 DSP 进行交联、以及酵母双杂交系统中的相互作用）表明，sortilin 能够与 GLUT4 结合。进一步地，我们先前结合丙氨酸扫描突变技术，利用酵母双杂交方法确定，sortilin 的 Vps10p 结构域主要与 GLUT4 的第一个腔内环结合。然而，此类相互作用在哺乳动物细胞中的直接证据一直缺失。在此，我们通过钴树脂从转染的 3T3-L1 细胞中分离出带有 His 标签的 sortilin，并证明其可在 pH 6 和 pH 8 条件下与化学合成的 GLUT4 第一腔内环肽段发生相互作用，这两种 pH 条件分别模拟了早期内体腔内的酸性环境和反式高尔基网络（TGN）膜腔内的中性环境。在对照实验中，将未转染细胞制备的提取物加样至相同树脂时，未检测到任何肽段结合信号。

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方案

1. 肽的处理

  1. 多肽的设计与订购
    1. 选择所需多肽的序列，并在其N端或C端添加标签，例如myc表位（EQKLISEED）。
    2. 使用多肽溶解度计算器 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php 预测多肽在水中的溶解度。如果溶解度较低，可尝试添加另一个水溶性标签以改变电荷平衡。
      注意：我们使用的多肽对应于GLUT4的第一个腔内环（fll），并在N端带有myc表位（粗体）（Myc-fll-GLUT4）：EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA，该序列预测在水中具有"良好"的溶解度。
    3. 订购纯度至少为75%的定制多肽，此纯度已足够用于检测，并向供应商索取溶解度测试报告。为防止多肽溶解过程中出现意外问题，应将订购的多肽分装为至少两份独立样品。
      注意：Myc-fll-GLUT4被分为两份独立样品订购，其在超纯水中的报告溶解度为≤10 mg/mL。
  2. 多肽的溶解
    注意：超纯水是最佳溶剂。如果多肽似乎不溶于水，请参考 http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html 获取操作说明。
    1. 用超纯水或所选缓冲液配制多肽的100倍工作液，浓度为100 μg/mL。
    2. 将溶液分装为每份50 - 100 µL，并于-20 °C保存。

2. 细胞处理

  1. 细胞培养
    1. 使用野生型（WT）细胞作为阴性对照，以及表达带有六个组氨酸标签（HisP）的目标蛋白的细胞。
      注意：我们使用了稳定转染 Sortilin-myc/His 的 3T3-L1 前脂肪细胞5.
    2. 在37 °C、10% CO₂条件下，将细胞培养于添加有10%胎牛血清、谷氨酰胺（2 mM）和青霉素/链霉素（5 μg/mL）的高糖 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中2.
    3. 将四皿10 cm培养皿中的细胞置于培养箱中，其中两皿转染HisP，另两皿转染对照质粒（WT）。转染48 h后，细胞应达到80–90%汇合度。
  2. 细胞裂解物的制备
    1. 配制裂解缓冲液（10 mM Hepes、30 mM NaCl、5% 甘油、10 mM 咪唑、0.5% Triton X-100 以及不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物，用于 His 标签蛋白的分离，pH 7.4），并于 4 °C 保存：
    2. 用 10 mL 4 °C 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 3 次。
    3. 将培养皿置于冰上，向每皿中加入 500 µL 裂解缓冲液。使用细胞刮刀收集细胞裂解物。
    4. 将每块培养皿中的细胞裂解液分别放入不同的1.5 mL离心管中。将离心管标记为WT-pH6、WT-pH8、HisP-pH6、HisP-pH8。
    5. 使用26G针头的注射器将细胞裂解液反复抽吸5次，以完成裂解。
    6. 在 4 °C 条件下，以 16,000 x g 离心 10 分钟，处理细胞裂解液。
    7. 将上清液转移至新标记的相同标签试管中。
    8. 使用BCA蛋白检测试剂盒或其他试剂盒分析蛋白浓度。
    9. 使用裂解缓冲液调节四种裂解物的蛋白浓度至相等。
    10. 分离一小份（约 取每种裂解液20 µL，于-20 °C保存，以备对照实验和/或问题排查使用。

3. His标签蛋白与HisPur钴珠的结合

  1. 使用市售的洗涤缓冲液或自行配制（50 mM Na2HPO4/NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 8），并置于 4 °C 保存。
  2. 用 HCl 滴定 pH 8 的洗涤缓冲液至 pH 6，配制 pH 6 的洗涤缓冲液，并置于 4 °C 保存。
  3. 轻轻摇动钴珠试剂瓶，使其形成均匀的悬浮液。
  4. 将 40 µL 钴珠悬浮液分别加入四个已标记的 1.5 mL 离心管中（见步骤 2.2.4）。
  5. 向每管中加入 1 mL 裂解缓冲液，在 1000 × g 条件下离心 5 秒，吸除上清液，并向沉淀的珠子中加入 40 μL 裂解缓冲液。
  6. 将细胞裂解液分别加入对应的离心管中。
  7. 将离心管置于 4 °C、20 rpm 的旋转仪上孵育 90 分钟。
  8. 在 1000 × g 条件下离心 5 秒，收集上清液，并将上清液置于 4 °C 保存。
  9. 向对应的离心管中加入 500 µL pH 8 或 pH 6 的洗涤缓冲液，轻轻重悬珠子。
  10. 在 1000 × g 条件下离心 5 秒，弃去上清液。
  11. 重复步骤 3.9 和 3.10 共四次。

4. 肽与珠上固定的 His 标签蛋白的结合

  1. 使用该多肽的100倍工作液（步骤1.2.1），在pH 6或pH 8洗涤缓冲液中分别配制1倍工作液（每种各取两份100 µL，浓度为1 µg/mL）。
  2. 向已洗涤的磁珠中加入100 μL相应pH的1x肽溶液。
  3. 将珠子在 4 °C 下于 20 rpm 的试管旋转仪中孵育 30 分钟。
  4. 将离心管在1,000 × g下离心5秒，收集上清液并于-20 °C保存。
  5. 重复步骤 3.9 和 3.10，共四次。
    注意：为了降低可能的背景信号，以下步骤可替代步骤 4.4 & 4.5.
  6. 取四个带有30 μm孔径的微型柱，按2.2.4步骤进行标记，并将微型柱放入收集管中。
  7. 完成步骤4.3后，将孵育混合物转移至柱中，依靠重力使溶液流过。收集的流穿液置于-20 °C保存。
  8. 通过重力作用将 500 µL pH 6 或 pH 8 的洗涤缓冲液分别流经相应的层析柱。弃去流出液。
  9. 重复步骤 4.8 四次。
  10. 最后一次洗涤后，将柱子在1,000 × g离心15秒。

5. 钴珠洗脱

  1. 使用商用Tricine上样缓冲液（200 mM Tris-HCl，40%甘油，2% SDS，0.04%考马斯亮蓝，pH 6.8），并加入β-巯基乙醇至终浓度为2%。
  2. 向洗涤后的磁珠中加入40 µL含β-巯基乙醇的Tricine上样缓冲液，涡旋混匀样品。
  3. 将样品在100 °C加热10分钟，再次涡旋混匀，然后以1,000 × g离心5秒。
    注意：为减少洗脱过程中可能的非特异性结合，以下步骤可替代步骤5.1–5.3。
  4. 向洗涤后的磁珠中加入40 μL洗脱咪唑缓冲液（50 mM Na2HPO4/NaH2PO4，300 mM NaCl，0.25 M 咪唑），涡旋混匀后室温孵育20分钟。
  5. 以3,000 × g离心30秒，收集上清液（洗脱样品）并转移至新的标记管中。
  6. 向每管中加入40 μL Tricine上样缓冲液，100 °C加热10分钟，涡旋混匀后以1,000 × g离心5秒。
    注意：若使用微量离心柱，将洗脱缓冲液加入洗涤后的磁珠中，孵育20分钟 ，然后以8,000 × g离心2分钟收集洗脱液。
    注意：样品可在–20 °C保存，直至进行电泳分析。

6. 电泳与蛋白质印迹

注意：样品已准备好进行 SDS-PAGE 分离及后续的蛋白质印迹（Western blotting）。请遵循凝胶电泳方案（https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot），并作如下修改。

  1. 使用市售的 10 - 20% Tricine 梯度凝胶。
  2. 在凝胶上分别上样 20 µL 洗脱样品和 20 µL 裂解液（步骤 2.2.10）。为便于故障排查，建议同时上样 20 µL 未结合组分（步骤 3.8）和 10 ng 肽；上样前，向这些样品中加入等体积的 Tricine 上样缓冲液。
  3. 使用市售的 Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液（100 mM Tris，100 mM Tricine，0.1% SDS，pH 8.3）进行电泳。
  4. 使用含有 20% 甲醇的转移缓冲液（25 mM Tris 碱，192 mM 甘氨酸，pH 8.4），将凝胶中的蛋白转移至 0.45 µm 硝酸纤维素膜上。
  5. 用 3% 牛血清白蛋白（BSA）在室温下封闭膜 1 小时。以预染蛋白分子量标记物为参考，将膜水平切割，用抗 HisP 抗体孵育上半部分，用抗 myc 表位抗体孵育下半部分，以鉴定带 myc 标签的肽。
    注意：在本实验特定情况下，无需切割膜，因为 HisP 和 Myc-fll-GLUT4 均可用抗 myc 抗体检测。

7. 结果分析

  1. 使用成像系统或ImageJ软件定量所有Western印迹信号的强度。
  2. 在两种pH值下，将Myc标签肽段的信号相对于HisP的信号进行归一化处理。

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结果

使用稳定转染了Sortilin-myc/His5的3T3 L1细胞以及野生型3T3 L1细胞（作为阴性对照）制备裂解液。将两种裂解液分别在pH 6或pH 8条件下与钴珠孵育，并充分洗涤。随后，将结合有固定化蛋白的珠子与Myc-fll-Glut4溶液孵育。经过仔细洗涤后，用0.25 M咪唑洗脱与珠子结合的蛋白。样品连同原始裂解液一同在10-20% Tricine梯度凝胶中进行SDS-PAGE电泳，随后使用抗Myc抗体进行Western blot检测，以同时检测Sortilin-myc/His（110 kD）和Myc-fll-GLUT4（5 kD）（图1）。

将 Myc-fll-GLUT4（10 ng）加样至凝胶的第一泳道作为参照。由于该肽的纯度仅为 75%，可见存在污染条带（上方条带）。来自野生型（WT）和表达 Sortilin-myc/His 的...

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讨论

Sortilin 是一种在进化上保守的多配体蛋白受体，参与细胞膜上的信号传导以及细胞内分选过程6,7。然而，寻找 sortilin 的真实配体（其中一些是腔内蛋白或整合膜蛋白）存在困难，因为 sortilin 与其某些结合伙伴的相互作用似乎对去垢剂敏感。因此，研究蛋白-蛋白相互作用的一种简便且广泛应用的方法——共免疫沉淀——难以直接应用。一些研究团队曾使用共免疫沉淀来证明 sortilin 与其潜在配体之间的相互作用8,9。然而，这些实验是在 0.1% Triton 或 0.6% CHAPS 条件下进行的，这引发了对膜蛋白是否被充分溶解的质疑。

其他研究人员通过表面等离子共振技术研究了sortilin与其配体之间的相互作用10,11。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）向 K.V.K. 提供的研究基金 DK52057 和 DK107498 资助。X.P. 由美国国立卫生研究院（NIH）的机构培训基金 2T32DK007201 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8849用于组氨酸标签蛋白的纯化
磷酸盐缓冲液 Corning21-040-CVPBS
1 mL 胰岛素注射器 U-100BD32965226G x 1/2
BCA 蛋白检测试剂盒Pierce23228
洗涤缓冲液Boston BioProductsBP-234用于组氨酸标签蛋白纯化
HisPur 钴树脂Thermo Scientific89964
Tricine 样品缓冲液Bio-Rad161-0739含 SDS，需添加 β-巯基乙醇
洗脱 缓冲液Boston BioProductsBP-236用于组氨酸标签蛋白纯化，含 250 mM 咪唑
Mini-Protean Tris-Tricine 预制胶 10-20% Bio-Rad456-3115用于肽段和小分子蛋白的分离
Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液 Bio-Rad161-0744
转膜缓冲液Boston BioProductsBP-190添加 20% 甲醇
硝酸纤维素膜  0.45 mmBio-Rad1620115
牛血清白蛋白SigmaA9647BSA
抗 Myc 抗体Cell Signaling2272兔源
多肽Genscipt定制订购
Precision Plus Protein 双色标准蛋白BioRad161-0374

参考文献

  1. Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
  2. Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
  3. Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
  4. Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
  5. Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
  6. Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
  7. Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
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  9. Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
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  11. Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).

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