膜蛋白对洗涤剂敏感相互作用的检测

Summary

我们描述了一个协议, 以检测在膜蛋白之间的洗涤剂敏感的相互作用, 使用结合的排序受体, sortilin, 到第一个腔内循环的葡萄糖转运蛋白, GLUT4, 作为一个例子。

Abstract

我们探索蛋白质与蛋白质相互作用的能力是理解细胞中调控连接的关键。然而, 在许多情况下, 检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用与重大的实验挑战有关。特别地, 排序感受器与他们的蛋白质货物在膜隔间的腔内相互作用经常以洗涤剂敏感的方式, 使这些蛋白质的共同免疫沉淀不可用。分类受体 sortilin 对葡萄糖转运体 GLUT4 的结合可以作为膜蛋白间弱腔相互作用的一个例子。在这里, 我们描述了一个快速, 简单, 廉价的检测, 以验证 sortilin 和 GLUT4 之间的相互作用。为此, 我们设计和化学合成了与 GLUT4 内腔部分的潜在 sortilin 结合表位对应的 c-myc 标记肽。Sortilin 标记六 histidines 的哺乳动物细胞, 并从细胞裂解物使用钴珠分离。在不同 pH 值下, 用多肽溶液在珠上固定 Sortilin, 用洗脱材料进行了分析。这种检测可以很容易地适应研究其他洗涤剂敏感的蛋白质-蛋白质相互作用。

Introduction

GLUT4 是一种葡萄糖转运蛋白, 主要表现在脂肪和骨骼肌细胞中, 它介导胰岛素对膳食后血糖清除的影响¹。GLUT4 是一种非常稳定的蛋白质, 它是在平移后的水平上调节的。在没有胰岛素的情况下, GLUT4 在很大程度上被排除在血浆膜上 (因此葡萄糖的基底通透性较低), 主要在小胰岛素应答性囊泡 (IRVs) 和反式高尔基网络 (TGN) 的细胞内进行定位, 这可能代表IRV 捐赠舱在胰岛素的管理, IRVs 保险丝与等离子膜, 并提供 GLUT4 到其功能的地方。这增加了血浆膜的渗透率为葡萄糖, 因此葡萄糖吸收从血液入脂肪细胞和骨骼肌肌细胞膜上升10到40倍。胰岛素退出后, GLUT4 被内化成早期/排序内涵体, 然后检索到 TGN 的 IRVs 重新形成。GLUT4 路径中的两个排序步骤,即从外围早期内涵体到核周 TGN 的检索, 以及 IRVs 捐赠膜 TGN 的形成是由 Vps10p 家庭成员 sortilin 启用的, 它表示类型 i跨膜蛋白和分选受体。根据一个模型, sortilin 工作作为跨膜支架蛋白: 它结合 GLUT4 在内涵体和 TGN 的流明, 并招募 retromer 或网格蛋白适配器的细胞质侧的供体膜通过其^C总站² ,³. 这促进了 GLUT4 在胞内隔间植物常常将 GLUT4 的水泡载体的分布。

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Protocol

1. 肽的处理

1. 肽的设计与排序
   1. 选择所需的肽序列, 并添加一个标记, 如 c-myc 表位 (EQKLISEED) 在其 N 或 C 终点。
   2. 用肽溶解度计算器 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php 检查水中肽的预测溶解度。如果溶解度低, 尝试添加另一个水溶性标签, 以改变电荷平衡。
      注意: 我们使用了与第一个腔圈 (fll) 相对应的肽, 在 N 总站 (Myc-fll-GLUT4) 上标记了 GLUT4 的 c-myc 表位 (粗体): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA 具有 "良好" 预测水中溶解度.
   3. 订购具有至少75% 纯度的自定义肽, 这是足够的化验, 并要求提供者的溶解度测试。将该顺序分成至少两个整除数, 以防在溶解肽时出现意外问题。
      注: Myc-fll-GLUT4 在两个整除数中被订购。其报告的溶解度在超纯水是≤10毫克/毫升。
2. 溶解肽
   注: 超纯水是最好的溶剂。如果肽似乎不是水溶性的, 请参考 http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html 的说明。
   1. 在超纯水或选择缓冲器中制备100x 的肽溶液, 浓度为100微克/毫升。....

Results

裂解物是由 3T3 L1 细胞稳定转染的 Sortilin-c-myc/他的5和从野生 3T3 L1 细胞, 用作负控制.两个裂解物在 ph 值6或 ph 值8和彻底洗涤的钴珠孵化。然后在 Myc-fll-Glut4 的溶液中孵化出固定蛋白的珠子。经过仔细的洗涤, 与珠子绑定的蛋白质与0.25 米咪唑洗脱。样品被接受了, 连同原始的裂解物, 到 SDS 页在一个 10-20% Tricine 梯度凝胶跟随西部印迹与抗 c-myc 抗体, 允许检测 sortilin-c-myc 或他 (110 kd) 和 Myc-fll-GLUT4 (5 kd) (图1).

Myc-fll-GLUT4 (10 ng) 在凝胶的第一条车道被装载了作为参考。由于肽的纯度只有 75%, 污染物是明显的 (更高的波段)。原始细胞裂解物从 Sortilin 和他的表达细胞包.......

Discussion

Sortilin 是一种进化保守的多配体蛋白受体, 涉及两个信号在等离子膜和细胞内排序事件^6,7。然而, 寻找正宗 sortilin 的配体 (其中一些是腔内或整体膜蛋白) 是复杂的, 因为 sortilin 与它的一些结合伙伴的相互作用似乎对洗涤剂敏感。因此, 一种简单而广泛的方法来研究蛋白质-蛋白质相互作用, 共同免疫沉淀, 不能轻易地应用。一些研究组使用免疫沉淀来演示 sortilin 及其潜在配体之间的交互作用 8, 9.然而, 这些实验是在0.1% 海卫一或0.6% 章中进行的, 这对膜增溶的完整性产生怀疑。

其他研究人员通过表面等离子体共振^10,11, 研究了 sortilin 及其配体之间的相互作用。虽然表面等离子共振可.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8849	用于纯化组氨酸标签蛋白
磷酸盐缓冲盐水	康宁	21-040-CV	PBS
1mL 胰岛素注射器 U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA 蛋白检测试剂盒	Pierce	23228
洗涤缓冲液	波士顿生物产品	BP-234	用于 His 标签蛋白纯化
HisPur 钴树脂	Thermo Scientific	89964
Tricine 样品缓冲液	Bio-Rad	161-0739	含 SDS，应加入 b硫醇
脱 缓冲液	Boston BioProducts	BP-236	用于 His 标签蛋白纯化，含 250 mM 咪唑
Mini-Protean Tris-Tricine 预制胶 10-20%	Bio-Rad	456-3115	用于分离肽和小蛋白
Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液	Bio-Rad	161-0744
转移缓冲液	波士顿生物产品	BP-190	添加 20% 甲醇
酸纤维素膜  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
牛血清白蛋白	Sigma	A9647	BSA
抗 Myc 抗体	细胞信号传导	2272	兔
肽	Genscipt		定制订购
Precision Plus Protein 双色 Standarts	BioRad	161-0374