本文介绍了一种全面的评估流程 体外 经典肿瘤血管生成是否存在于血管母细胞瘤（HBs）中及其在HBs中的作用。结果强调了HB新生血管形成的复杂性，并表明这种常见的血管生成形式仅是HB新生血管化的一种辅助机制。
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摘要
摘要
Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因的失活在人中枢神经系统（CNS）血管母细胞瘤（HBs）的发生发展中起着关键作用。然而，HBs的细胞起源及其演化过程（包括新生血管形成）仍存在争议，且基于经典HB血管生成机制的抗血管生成疗法在VHL相关HBs的临床试验中效果不佳。抗血管治疗在临床转化中面临的主要障碍之一，是对这种富血管肿瘤中新生血管形成机制缺乏全面深入的理解。本文介绍了一套系统的实验方案，用于评估 体外 HBs中是否存在经典的肿瘤血管生成及其在HBs中的作用。通过该方法，研究人员可准确理解HB新生血管形成的复杂性，并明确这种常见血管生成形式在HBs中的功能。这些方案可用于评估最具前景的肿瘤抗血管治疗策略，对于肿瘤治疗具有较高的转化潜力，也可为未来优化HBs抗血管生成治疗提供参考。结果表明，HB新生血管形成具有复杂性，提示这种常见的血管生成形式仅是HB新生血管化的一种辅助机制。
引言
血管母细胞瘤（HBs）是仅发生于人类中枢神经系统（CNS）内的良性血管性肿瘤。此类肿瘤可出现在Von Hippel-Lindau（VHL）病患者中，也可表现为散发性病变。由于该遗传性疾病常导致肿瘤复发和多发病灶，VHL相关血管母细胞瘤（VHL-HBs）难以通过手术完全治愈1。尽管VHL肿瘤抑制基因的失活被认为是VHL-HBs发生发展的根本原因，但HBs的细胞起源（包括新生血管形成）及其演化过程仍存在较大争议2。因此，深入理解HB新生血管的生物学机制，可能为VHL-HBs提供最具前景的抗血管治疗策略提供重要线索。
近期研究表明，血管母细胞瘤（HB）的新生血管形成与胚胎期血管发生过程相似3,4,5。传统的由血管内皮生长因子（VEGF）介导、起源于血管内皮并由VHL基因功能缺失所驱动的血管生成机制，可导致细胞增殖和新生血管形成，但这一机制已受到质疑6。1965年，Cancilla和Zimmerman通过电子显微镜观察发现，血管母细胞瘤起源于内皮组织7。随后研究进一步发现，间质细胞来源于血管形成成分8。1982年，Jurco 等 研究证实，这些间质细胞具有内皮来源特征9。因此，我们提出假设：人血管内皮细胞是HB新生血管形成的原始细胞10。尽管使用来自VHL患者手术标本的原代HB细胞培养更为理想，但我们的前期研究显示，HB原代培养物稳定性较差，难以建立稳定的细胞系3。此外，在三维环境中进行的原代培养无法明确HB新生血管形成的细胞学起源，因其包含了HB血管成分的前体细胞10,11。因此，作为内皮细胞的一种原始且经典的模型，人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）可作为研究血管母细胞瘤的替代性细胞模型。
球形体出芽实验是组织工程学中的一种新模型12,13. 在本文中，一种基于三维胶原的共培养系统 体外 利用球状体出芽实验进行研究，旨在全面评估经典肿瘤血管生成是否存在于肝母细胞瘤（HBs）中，以及其在HBs中的作用。
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方案
本方法严格遵循复旦大学华山医院伦理委员会批准的指南和规定进行。每一步骤均采取了相应的标准安全措施。示意图请参见图1。
1. 细胞培养与质粒构建
- 在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）、100单位/毫升青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）常规培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。
- 用ApaI和EcoRI酶切PLKO.1质粒，用于合成shRNA片段。确保VHL shRNA载体的寡核苷酸序列为CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14。
- 然后将20 µΜ体系混合：5 µL正向寡核苷酸、5 µL反向寡核苷酸、5 µL 10x NEB缓冲液和35 µL ddH2O（总体积为50 µL）。在98 °C加热4分钟，随后数小时内缓慢冷却至室温。
- 将退火后的寡核苷酸与PLKO.1质粒在4 °C下用T4连接酶连接过夜。16小时后，将5 µL连接混合物加入25 µL感受态DH5α细胞中。随后筛选成功连接的质粒，并通过测序验证插入片段。
2. 慢病毒包装与感染
- 总共将 10 µg 的 PLKO.1-shVHL 或 PLKO.1-shScramble 载体、7.5 µg 的包装质粒 psPAX2 和 2.5 µg 的包膜质粒 pMD2.G 混合于 500 µL 无胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中，孵育 25 分钟。
- 向上述溶液中加入 7 mL 无 FBS 的 DMEM 培养基。
- 将 293FT 细胞培养于无 FBS 的 DMEM 培养基中，使用 10 cm 直径的组织培养皿。使用细胞计数仪确保 293FT 细胞数量为 1 × 107。
- 将 1 mL 上述制备的溶液加入 293FT 细胞培养基中进行转染。
注意： 293FT 细胞系源自 293F 细胞系，并稳定表达 SV40 大 T 抗原，因此是慢病毒生产的合适宿主细胞。 - 转染 6 小时后，更换为含 10% FBS 的 DMEM 培养基。
- 转染后 48 小时，用移液器收集培养基。
注意： 病毒存在于含 10% FBS 的 DMEM 中，死亡细胞漂浮在培养基表面。使用 0.45 µm 无菌滤膜过滤去除死细胞和杂质。通常无需检测感染复数（MOI），因为本实验旨在建立稳定细胞系。在最后一步中，所有未成功感染的活细胞将被嘌呤霉素杀死。shScramble 组和 HUVEC 细胞作为对照组。需确保在 72 小时内，所用浓度的嘌呤霉素可使所有 HUVEC 对照细胞完全死亡。每个孔中的细胞数量应保持一致。 - 将 HUVEC 细胞在慢病毒培养基中培养 72 小时，然后向 HUVEC 细胞培养基中加入浓度为 2 µg/mL 的嘌呤霉素，作用 24 小时。以未经任何处理的 HUVEC 细胞作为对照组。确保此时所有对照组细胞均已死亡。
注意： 存活的细胞即为 VHL 沉默的稳定细胞系和 shScramble 稳定细胞系。铺板密度为每 96 孔板每孔 5,000 个细胞。
3. 内皮细胞球体的生成
- 用胰蛋白酶消化 HUVECs 细胞，并重悬于含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中。对于一个 10 cm 培养皿中的适量细胞，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
- 将细胞以每孔 1 × 103 个细胞的密度接种至 3D 圆底 96 孔板中。使用可容纳 0.50 µL 类球体的孔来悬浮类球体。按照制造商说明，使用 细胞计数系统对细胞进行计数。
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下持续培养 72 小时。在此条件下，确保悬浮细胞自动形成细胞类球体。在培养 36 小时后更换一半培养基。
4. 体外 血管生成实验
- 在 4 °C 下解冻凝胶溶液，并按 1:5 的稀释比例用低血清培养基稀释。
- 用移液器从 DMEM 培养基中吸取类球体，用 5 mL 低血清培养基清洗类球体后，轻柔谨慎地将其悬浮于稀释后的凝胶中，确保无气泡产生。
- 将 300 µL 混合液嵌入 15 孔板中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时后，向每孔加入 400 µL 低血清培养基。在孔周围加入无菌水以形成湿润环境，防止蒸发。
- 随后，在 37 °C、5% CO2、100% 湿度条件下继续培养 1 小时。
- 小心吸除旧培养基，每孔更换为 600 µL 含 1% 内皮细胞生长添加剂的低血清培养基。
- 12 小时或 24 小时后，在倒置光学显微镜（40*）下拍摄图像。
5. 数据分析
- 将图像上传至在线图像分析平台以获取芽管长度数据（材料表）。
- 在网页上，通过电子邮件创建账户。
- 然后点击上传按钮上传图像。
- 点击下载按钮下载结果。
注意： 软件将生成处理后的图像和数据。数据包含五个部分：累计芽管长度、平均芽管长度、芽管长度的标准差、芽管面积和类球体面积。在处理后的图像中，每个参数以不同颜色标出，以便于识别：红色表示芽管骨架，黄色表示芽管数量，蓝色表示芽管结构，白色表示芽管末端，橙色表示类球体。
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结果
原始图像由倒置光学显微镜拍摄。对照组和VHL组的典型图像分别如图2-A1和图2-A2所示。对照组的出芽长度短于VHL组。
上传图像后，在线平台将直接提供分析结果。输出结果包括两部分：处理后的图像和相应的分析结果。对照组和VHL基因沉默组的处理图像以不同颜色标注（图2-A3 和 图2-A4）。对照组和VHL沉默组的平均出芽长度分别为65 µm和125 µm，平均累计出芽长度分别为680 µm和1250 µm，表明与对照组相比，VHL沉默组的出芽长度增加了约两倍（
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讨论
近期，血管生物学研究的多个领域因对促血管生成内皮细胞的研究而得到推动15。在本文中，我们建立了一种内皮细胞球体出芽技术，作为实验模型，用于研究由经基因操作的内皮细胞中VHL基因功能缺失所引发的血管形成过程，以鉴定血管生成级联反应中的新型候选分子。据我们所知，这是首次报道对内源性修饰内皮细胞的促血管生成效应进行研究。
组织（包括肿瘤组织）的新生血管形成是一个复杂的生理过程，其发生涉及多种细胞和分子机制的协同作用。 通过 发育过程中以及生理和病理条件下的血管生成与血管形成机制12,15,16类球体出芽实验具有复杂的事件级联特征17,18，包括内皮细胞在三维细胞基质培养系统中的自聚集，进而形成出芽并重建毛细血管的三维网络结...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到上海市科学技术委员会基金（15411951800，15410723200）的资助。作者谨此感谢复旦大学病原微生物学系的文玉梅教授和赵超教授提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人脐静脉内皮细胞 | 复旦大学IBS细胞中心 | FDCC-HXN180 | |
| 杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’s 培养基 | Gibco | 11995040 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 26400044 | |
| PLKO.1-puro 载体 | Addgene | #8453 | |
| 包装质粒 psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| 包膜质粒 pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 3D 圆底 96 孔板 | S-Bio | MS-9096M | |
| 基质胶 | BD 生物科学 | 354234 | |
| Opti-MEM 培养基 | Gibco | 31985-070 | 低血清培养基 |
| 15孔板 | Ibidi | 81501 | 凝胶中的气泡可通过平衡凝胶来减少 μ–将血管生成载玻片置于培养箱中过夜，使用前再进行滑动 |
| 内皮细胞生长添加剂 | Sciencell | #1052 | |
| 10 cm 培养皿 | 康宁 | Scipu000813 | |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A1113802 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 自动细胞计数系统 | 生物技术 | ||
| 图像分析软件 | Winmasis | http://mywim.wimasis.com |
参考文献
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