Method Article

一种快速的银染色协议, 能够使用非变性聚丙烯酰胺凝胶对 SSR 标记进行简单而有效的检测

DOI:

10.3791/57192

⸱

April 20th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Guangzhou University, 2Hard Winter Wheat Genetics Research Unit, United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service, 3The UWA Institute of Agriculture, University of Western Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们报告一个简单和低成本的银染色协议, 只需三试剂和7分钟的处理, 并适合快速生成高质量的 SSR 数据的遗传分析。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

简单序列重复 (SSR) 是植物和动物遗传研究和分子育种项目中最有效的标记之一。银染色是一种广泛应用于聚丙烯酰胺凝胶中 SSR 标记检测的方法。然而, 传统的银染色协议在技术上要求和耗时。与许多其他生物实验室技术一样, 银染色协议已稳步优化, 以提高检测效率。在这里, 我们报告一个简化的银染色方法, 大大降低试剂成本, 提高检测分辨率和图像清晰度。新的方法需要两个主要步骤 (浸渍和开发) 和三试剂 (硝酸银, 氢氧化钠和甲醛), 和只有7分钟的加工为非变性聚丙烯酰胺凝胶。与以前报告的协议相比, 这种新方法更容易、更快, 并且使用较少的化学试剂进行 SSR 检测。因此, 这种简单、低成本、有效的银染色协议将通过快速生成 SSR 标记数据, 有利于遗传图谱和标记辅助育种。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR 标记技术的发展使植物遗传学和育种学的研究发生了革命性的改变1。简单序列重复 (SSR) 标记是最常用和最多才多艺的 DNA 标记之一。其广泛的基因组覆盖率, 丰度, 基因组特异性和重复性是 SSR 标记的优点, 除了它们的呈共显性遗传检测异型基因型2。一些研究已经使用 SSR 标记来调查遗传多样性, 跟踪祖先, 构建基因连锁图, 并映射经济重要性状的基因3,4。

SSR 标记的 PCR 产物通常用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离, 然后用银染色或紫外光溴溴化物染色。聚丙烯酰胺凝胶中 DNA 片段的银染色比其他染色方法更敏感5,6 , 并已广泛用于检测 dna 片段, 如 SSR 标记7。

与许多生物实验室技术一样, 聚丙烯酰胺凝胶的银染色已稳步改善, 因为它第一次被报告为片段可视化技术在 1979年8。该技术最初被修改为检测 DNA 片段的巴萨姆et 等。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SSR 标记 PCR 产物的制备

  1. 准备所有的化学试剂和 PCR 反应, 包括模板 DNA (30 ng/µL), 2× pcr 大师组合 (包含 2× pcr 缓冲器, 每 dNTP 的0.4 毫米, 3 毫米氯化镁2, 0.1 U/µL Taq 脱氧核糖核酸聚合酶和染料), 10 µM 每向前和反向引物、蒸馏或去离子水 (dH2O)。
    注: 本研究使用的 SSR 标记为 PT51333 (正向底漆序列: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3 ' 和反向引物序列: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3 ') 和 PT50903 (正向底漆序列: 5 '-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3 ' 和反向底漆序列: 5 '-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') 为烟草和 CX-43 (向前底漆序列: 5 '-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3 ' 和反向引物 sequence:5 '-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3 ') 和 CX-157 (向前底漆序列: 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 "和反向引物序列: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3 ') 为开花大白菜。
  2. 通过添加2µL 模板 DNA、5µL 2× pcr 总混合、每向前底漆和反向底漆0.2 µL 和 dH2.6O 的2µL....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用相应的 SSR 引物对 amplicons 甘蓝和烟草进行了 PCR 制备。电泳后, 采用上述银染色协议对聚丙烯酰胺凝胶进行染色, 明确检测到 SSR 标记的带状模式 (图 1)。

为了比较不同银染色协议的检测效率, 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离了烟草和开花白菜中 SSR 标记的 PCR 产物, 并用五的银染色方法进行了可视化。协议9,11,12,13,14和新协议。所有六协议都检测到烟草和开花大白菜基因型的 SSR 带型 (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

浸渍后的凝胶洗涤是一个关键步骤。洗涤时间和水量不足, 可能导致板材和凝胶表面的浸渍液不完全去除, 造成暗背景。适当的开发时间是另一个关键步骤, 过度开发可能导致黑褐色背景与低对比度图像的 DNA 片段。此外, 浸渍步骤显著影响 DNA 片段的染色效率。虽然在浸渍溶液中延长浸渍时间超过5分钟或增加 AgNO3量, 但不会显著改善染色质量, 将浸渍时间减少到少于3分钟或减少 AgNO3 (< 1 克) 可能导致灰色或浅黑色 DNA 片段。

一个快速和容易的操作, 以有效的 DNA 检测是可取的银染色方法。本研究开发的新协议避免了其他协议6、9、10、11、12、1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明他们没有竞争的财政利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作由中国广东自然科学基金 (2015A030313500)、省级重点国际合作研究平台和广东省高等教育重点科研项目 (2015KGJHZ015)、科学与广东省烟草专卖管理技术方案 (201403、201705)、广东省科技计划 (2016B020201001)、全国大学生创新培训项目 (201711078001)。在本出版物中提及商号或商业产品, 纯粹是为了提供具体信息, 并不意味着美国农业部的建议或认可。美国农业部是一个平等机会提供者和雇主。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PCR 预混液（Green Taq Mix）Vazyme Biotech Co. Ltd， China#P131-03
50-2000 bp DNA LadderBio-Rad， USA#170-8200
DL500 DNA markerTakara Bio Inc.， Japan#3590A
Tris 碱基Sangon Biotech Shanghai， China#77-86-1
硼酸Sangon Biotech Shanghai， China#10043-35-3
EDTA-Na2广州化学试剂厂#6381-92-6
丙烯酰胺桑贡生物科技有限公司 中国上海#79-06-1
N，N'-亚甲基-双丙烯酰胺桑贡生物科技有限公司 中国上海#110-26-9
N，N，N'，N'，N'-四甲基乙二胺桑贡生物科技有限公司 中国上海#110-18-9
过硫酸铵广州化学试剂厂#7727-54-0
结合硅烷Solarbio 中国北京#B8150
AgNO3国药化学试剂北京有限公司#7761-88-8
甲醛天津大茂化学试剂厂#50-00-0
NaOH中国广州化学试剂厂#1310-73-2
醋酸广州化学试剂厂#64-19-7
Na2CO3天津大毛化学试剂厂#497-19-8
乙醇广州化学试剂厂#64-17-5
HNO3中国广州化学试剂厂#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O国药化学试剂北京有限公司#10102-17-7
Eriochrome black T（EBT）天津大毛化学试剂厂， 中国#1787-61-7
塑料托盘上海逸晨塑料有限公司 中国-
TS-1 摇床麒麟贝特 江苏-
明基 M800 扫描仪明基-
DYY-6C 电源北京柳艺仪器厂 中国-
高高全立式凝胶系统， JY-SCZF北京屯义电泳有限公司，中国-
中国 中国

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
  2. Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
  3. Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Silver StainingSSR MarkersNon denaturing GelPolyacrylamide GelGenetic ResearchMarker DetectionImpregnation DevelopmentDNA Fragment AnalysisGel ElectrophoresisChemical Reagents

Related Articles