本文报道了一种简单且低成本的银染方案，仅需三种试剂并经过7分钟处理即可完成，适用于遗传分析中快速获得高质量的SSR数据。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
一种快速银染方案，可利用非变性聚丙烯酰胺凝胶简单高效地检测SSR标记
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
简单序列重复（SSR）是植物和动物遗传研究及分子育种项目中应用最广泛的分子标记之一。银染法是一种广泛用于聚丙烯酰胺凝胶中检测SSR标记的方法。然而，传统的银染实验流程在技术上要求较高且耗时较长。与其他许多生物学实验技术类似，银染流程已逐步优化以提高检测效率。本文报道一种简化的银染方法，可显著降低试剂成本，并提高检测分辨率和图像清晰度。该新方法仅需两个主要步骤（浸渍和显影）和三种试剂（硝酸银、氢氧化钠和甲醛），对非变性聚丙烯酰胺凝胶的处理时间仅需7分钟。与先前报道的实验方案相比，该新方法操作更简便、速度更快，且使用的化学试剂更少。因此，这种简单、低成本且高效的银染方案将有助于通过快速生成SSR标记数据来推动遗传作图和标记辅助育种研究。
引言
基于PCR的分子标记开发已彻底改变了植物遗传学与育种科学1。简单序列重复（SSR）标记是最常用且最具多功能性的DNA标记之一。除了能够检测杂合基因型的共显性遗传特性外，SSR标记还具有广泛的基因组覆盖性、高丰度、基因组特异性和可重复性等优点2。已有许多研究利用SSR标记分析遗传多样性、追踪亲缘关系、构建遗传连锁图谱，并对具有重要经济价值的性状相关基因进行定位3,4。
SSR标记的PCR产物通常通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，随后通过银染法或溴化乙锭染色后在紫外光下观察。聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的银染法比其他染色方法更灵敏5,6，已广泛用于检测SSR标记等DNA片段7。
与许多生物学实验技术一样，聚丙烯酰胺凝胶的银染技术自1979年首次被报道作为一种片段可视化方法以来，已得到持续改进8。该技术最初由Bassam et al.6于....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. SSR标记PCR产物的制备
- 准备PCR反应所需的所有化学试剂和试剂，包括模板DNA（30 ng/µL）、2× PCR预混液（包含2× PCR缓冲液、每种dNTP 0.4 mM、MgCl2 3 mM、Taq DNA聚合酶0.1 U/µL及染料）、每种正向和反向引物10 µM，以及蒸馏水或去离子水（dH2O）。
注意：本研究中使用的SSR标记包括烟草的PT51333（正向引物序列：5'-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3'，反向引物序列：5'-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3'）和PT50903（正向引物序列：5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3'，反向引物序列：5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3'），以及开花大白菜的CX-43（正向引物序列：5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3'，反向引物序列：5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3'）和CX-157（正向引物序列：5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3'，反向引物序列：5'-GGACAGCTTCACACATTTGC-3'）。 - 在反应体系中加入2 µL模板DNA、5 µL 2× PCR预混液、每种正向和反向引物各0.2 µL以及2.6 µL dH2O，配制总体积为10 µL的PCR反应混合液。
- 在PCR仪中进行扩增反应，程序设置....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
利用相应的SSR引物对在开花的中国白菜和烟草中扩增出PCR产物。电泳后，采用上述银染方法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色，清晰地检测到SSR标记的条带模式（图1）。
为了比较不同银染方案的检测效率，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离烟草和菜心SSR标记的PCR产物，并利用五种已发表的银染方案9,11,12,13,14以及新方案进行显色。所有六种方案均能检测到烟草和菜心基因型的SSR条带模式（图2），但本研究中的新方案背景噪音最低.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
浸渍后对凝胶的洗涤是一个关键步骤。洗涤时间不足或用水量不够，可能导致平板表面和凝胶表面的浸渍溶液去除不完全，从而产生较深的背景。适当的显影时间是另一个关键步骤，过度显影会导致背景呈深棕色，DNA片段图像对比度降低。此外，浸渍步骤显著影响DNA片段的染色效率。尽管将浸渍时间延长至5分钟以上或增加浸渍液中AgNO3的用量并不能显著提高染色质量，但将浸渍时间缩短至3分钟以下或减少AgNO3的用量（<1 g），则可能导致DNA片段呈现灰色或浅黑色。
一种理想的银染方法应具备快速简便的操作流程，以实现高效的DNA检测。本研究开发的新方案避免了其他方案中所描述的固定、终止以及多次洗涤步骤。6,9,10,11,12
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由国家自然科学基金广东联合基金（2015A030313500）、广东省重点国际科技合作研究平台及广东省高等教育重大科研项目（2015KGJHZ015）、广东省烟草专卖局科技计划项目（201403，201705）、中国广东省科技计划项目（2016B020201001）以及国家大学生创新创业训练计划项目（201711078001）资助。本出版物中提及的商标名称或商业产品仅用于提供具体信息，不意味着美国农业部对其有任何推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PCR预混液（绿色Taq预混液） | Vazyme Biotech Co. Ltd, 中国 | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, 美国 | #170-8200 | |
| DL500 DNA标记物 | Takara Bio Inc., 日本 | #3590A | |
| Tris碱 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #77-86-1 | |
| 硼酸 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | 广州化学试剂厂，中国 | #6381-92-6 | |
| 丙烯酰胺 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #79-06-1 | |
| N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #110-18-9 | |
| 过硫酸铵 | 广州化学试剂厂，中国 | #7727-54-0 | |
| 结合硅烷 | 索莱宝科技有限公司，北京，中国 | #B8150 | |
| AgNO3 | 国药集团化学试剂有限公司，北京，中国 | #7761-88-8 | |
| 甲醛 | 天津大茂化学试剂厂，中国 | #50-00-0 | |
| NaOH | 广州化学试剂厂，中国 | #1310-73-2 | |
| 乙酸 | 广州化学试剂厂，中国 | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | 天津大茂化学试剂厂，中国 | #497-19-8 | |
| 乙醇 | 广州化学试剂厂，中国 | #64-17-5 | |
| HNO3 | 广州化学试剂厂，中国 | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | 国药集团化学试剂有限公司，北京，中国 | #10102-17-7 | |
| 铬黑T（EBT） | 天津大茂化学试剂厂，中国 | #1787-61-7 | |
| 塑料托盘 | 上海亿晨塑料制品有限公司，中国 | - | |
| TS-1摇床 | 江苏麒麟比尔伯科技有限公司，中国 | - | |
| BenQ M800扫描仪 | 明基电通有限公司，中国 | - | |
| DYY-6C电源 | 北京六一仪器厂，中国 | - | |
| 高通量垂直凝胶电泳系统，JY-SCZF | 北京通用电泳设备有限公司，中国 | - |
参考文献
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
