本文报道了一种简单且低成本的银染方案，仅需三种试剂并经过7分钟处理即可完成，适用于遗传分析中快速获得高质量的SSR数据。
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方法文章
一种快速银染方案，可利用非变性聚丙烯酰胺凝胶简单高效地检测SSR标记
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
简单序列重复（SSR）是植物和动物遗传研究及分子育种项目中应用最广泛的分子标记之一。银染法是一种广泛用于聚丙烯酰胺凝胶中检测SSR标记的方法。然而，传统的银染实验流程在技术上要求较高且耗时较长。与其他许多生物学实验技术类似，银染流程已逐步优化以提高检测效率。本文报道一种简化的银染方法，可显著降低试剂成本，并提高检测分辨率和图像清晰度。该新方法仅需两个主要步骤（浸渍和显影）和三种试剂（硝酸银、氢氧化钠和甲醛），对非变性聚丙烯酰胺凝胶的处理时间仅需7分钟。与先前报道的实验方案相比，该新方法操作更简便、速度更快，且使用的化学试剂更少。因此，这种简单、低成本且高效的银染方案将有助于通过快速生成SSR标记数据来推动遗传作图和标记辅助育种研究。
引言
基于PCR的分子标记开发已彻底改变了植物遗传学与育种科学1。简单序列重复（SSR）标记是最常用且最具多功能性的DNA标记之一。除了能够检测杂合基因型的共显性遗传特性外，SSR标记还具有广泛的基因组覆盖性、高丰度、基因组特异性和可重复性等优点2。已有许多研究利用SSR标记分析遗传多样性、追踪亲缘关系、构建遗传连锁图谱，并对具有重要经济价值的性状相关基因进行定位3,4。
SSR标记的PCR产物通常通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，随后通过银染法或溴化乙锭染色后在紫外光下观察。聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的银染法比其他染色方法更灵敏5,6，已广泛用于检测SSR标记等DNA片段7。
与许多生物学实验技术一样，聚丙烯酰胺凝胶的银染技术自1979年首次被报道作为一种片段可视化方法以来，已得到持续改进8。该技术最初由Bassam et al.6于1991年修改用于DNA片段的检测，随后在1994年由Sanguinetti及其同事9进一步改进。在过去的几十年中，该方法得到了进一步优化6,7,9,10,11,12,13,14,15。然而，大多数这些更新后的方案仍存在一些缺点，例如技术要求高，以及固定和制片过程耗时较长6，这限制了这些方案的应用7,11。目前迫切需要一种将低成本与高检测效率相结合的优化方案，以实现银染技术在生物研究中的常规应用。
此外，聚丙烯酰胺凝胶可分为变性聚丙烯酰胺凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶，两者均可用于银染法检测SSR标记。两种凝胶的效果和分辨率无显著差异，但非变性聚丙烯酰胺凝胶更易于操作且耗时更短16。
根据先前的研究15，本研究的目的是详细描述一种优化的银染方法，用于在非变性聚丙烯酰胺凝胶中快速、简便且低成本地检测SSR标记。
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方案
1. SSR标记PCR产物的制备
- 准备PCR反应所需的所有化学试剂和试剂，包括模板DNA（30 ng/µL）、2× PCR预混液（包含2× PCR缓冲液、每种dNTP 0.4 mM、MgCl2 3 mM、Taq DNA聚合酶0.1 U/µL及染料）、每种正向和反向引物10 µM，以及蒸馏水或去离子水（dH2O）。
注意：本研究中使用的SSR标记包括烟草的PT51333（正向引物序列：5'-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3'，反向引物序列：5'-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3'）和PT50903（正向引物序列：5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3'，反向引物序列：5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3'），以及开花大白菜的CX-43（正向引物序列：5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3'，反向引物序列：5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3'）和CX-157（正向引物序列：5'-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3'，反向引物序列：5'-GGACAGCTTCACACATTTGC-3'）。 - 在反应体系中加入2 µL模板DNA、5 µL 2× PCR预混液、每种正向和反向引物各0.2 µL以及2.6 µL dH2O，配制总体积为10 µL的PCR反应混合液。
- 在PCR仪中进行扩增反应，程序设置为：94 °C预变性5分钟；随后进行38个循环，每个循环包括94 °C变性45秒、55 °C退火45秒、72 °C延伸1分钟；最后72 °C终延伸10分钟；反应结束后将PCR产物保存于4 °C以备后续使用。
2. 聚丙烯酰胺凝胶制备溶液的配制
- 通过将54 g Tris碱和27.5 g硼酸溶解于dH2O中，加入20 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0），再用dH2O定容至1,000 mL，配制1 L的5×TBE缓冲液。
注意：TBE缓冲液可在室温下保存数月。 - 取200 mL 5×TBE缓冲液，用dH2O定容至2 L，配制2 L的0.5×TBE缓冲液，并于室温保存。
- 通过将29 g分子生物学级丙烯酰胺和1 g分子生物学级N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶解于0.5×TBE缓冲液中，定容至500 mL，配制6%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液。将溶液瓶用铝箔包裹，4 °C保存以备后续使用。
注意：丙烯酰胺被认为是一种强效神经毒素，操作时应格外小心。称量粉末及处理含丙烯酰胺溶液时，务必佩戴手套。 - 将2 g过硫酸铵（APS）溶于dH2O中，定容至10 mL，配制20%过硫酸铵（APS）溶液。该溶液可在-20 °C保存数月。
注意：为方便使用，可将10 mL 20% APS溶液分装至1.5 mL或2 mL离心管中，于-20 °C保存。使用前需充分解冻并混匀。 - 将3 µL结合硅烷溶于含0.5%乙酸的95%乙醇997 µL中，配制稀释的结合硅烷溶液。该溶液可在4 °C保存数周。
注意：结合硅烷具有毒性，操作时应佩戴手套，并保持室内通风。
3. 电泳用聚丙烯酰胺凝胶的制备
- 用自来水加洗涤剂清洗一套玻璃板和垫片，然后用去离子水（dH2O）彻底冲洗。将玻璃板置于晾干架上自然晾干。
- 用移液器将1 mL结合硅烷溶液（bind-silane solution）均匀涂布于矩形玻璃板的内表面，干燥5分钟。
注意：若结合硅烷溶液在玻璃板表面涂布不均，凝胶在染色过程中可能发生脱落，导致染色效果不理想。 - 用棉签将1 mL抗粘硅烷（repel-silane）涂布于带缺口玻璃板的内表面，用纸巾擦去多余的抗粘硅烷，然后室温晾干5分钟。
注意：若抗粘硅烷未能均匀覆盖玻璃板表面，可能导致凝胶局部剥离而受损。 - 将带缺口的玻璃板置于上方，与垫片一起组装玻璃板，并用制胶夹具夹紧两侧。
- 取适量（40 mL）6%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入烧杯中，适用于尺寸为33 cm宽 × 10 cm高、垫片厚度为1.5 mm的玻璃板组合；加入20 µL四甲基乙二胺（TEMED）和200 µL新鲜配制的20%过硫酸铵（APS），轻轻混匀。
注意：所用凝胶溶液体积（40 mL）根据两块玻璃板之间的内部容积（30 cm × 8.5 cm × 0.15 cm）计算得出。关于凝胶聚合所需的TEMED和APS用量，可依据文献17中的标准比例确定。上述凝胶溶液通常储存于4°C；若凝胶溶液储存于室温，则应使用20 µL TEMED和100 µL 20% APS。使用玻璃棒轻轻搅拌混合液，避免产生气泡。 - 立即沿带缺口玻璃板边缘小心地将溶液倒入已组装好的玻璃板之间，填充至接近顶部，插入梳子，并在梳子上方覆盖少量凝胶溶液。
注意：保持玻璃板水平，防止凝胶泄漏。如有必要，使用除泡钩去除气泡。 - 室温下静置30分钟，使凝胶充分聚合。
注意：聚合时间可能因凝胶溶液及环境温度的变化而有所不同。 - 凝胶完全聚合后，取下制胶夹具，将玻璃板组件放入电泳槽中，使带缺口的玻璃板朝向上层缓冲液室，并使用大夹具将玻璃板组件固定在电泳槽上。
- 向上、下两个电泳槽室各加入1 L 0.5× TBE缓冲液。拔出梳子，并用移液器或注射器以缓冲液充分冲洗所有加样孔。
注意：确保玻璃板底部的凝胶夹层完全浸没于缓冲液中，且无气泡残留。
4. 凝胶电泳
- 将约 1 µL 的 PCR 产物加入聚丙烯酰胺凝胶的每个孔中。在凝胶两侧加载 DNA 分子量标记物，并与 PCR 产物样品一同上样。将安全盖固定到上层缓冲液室。
- 将导线连接至电源，红色接红色，黑色接黑色，按颜色编码匹配。以 110 V 恒定电压电泳，直至染料迁移至指定位置，通常运行约 70 分钟。
注意：可根据 PCR 产物的大小调整电压和电泳时间。
5. 在非聚丙烯酰胺凝胶中通过银染检测SSR标记
- 电泳结束后，将上层室中的缓冲液排入一个大烧杯中 通过 阀门。取下侧边夹子，将玻璃板从装置上移除，用刮刀沿一侧小心分离带缺口的玻璃板，并确保凝胶仍附着在另一块涂有bind silane的玻璃板上。
- 通过将 1.5 g AgNO₃ 溶解于水中配制 1 L 新鲜浸渍溶液3 在 1 L 的 dH₂O 中2O. 通过将 10 g NaOH 溶解于 900 mL dH₂O 中，配制 1 L 新鲜显影液2O，加入1 mL 37%甲醛，并用dH₂O定容至1 L2O.
注意：佩戴手套并小心操作上述化学品和溶液。无需将溶液及涉及这些溶液的相应步骤避光保存或操作。 - 用大量去离子水仔细冲洗凝胶和玻璃板2O 去除电泳缓冲液，然后将凝胶面向上的玻璃板置于塑料托盘中，并将凝胶浸入 1 L 浸渍液中。将托盘放在摇床中。
- 以60 r/min的速度轻轻振荡培养皿3-4分钟。
注意：震荡时间可根据凝胶厚度及浸渍液中硝酸银浓度进行调整。 - 将平板从浸渍液中取出，放入另一个托盘中。用大量去离子水冲洗平板表面和凝胶，去除残留的浸渍液。2O 两次，每次 3-5 秒。
- 将凝胶面向上的平板置于另一个托盘中，浸入1 L显影液中，然后以50 r/min轻轻振荡约3分钟。观察DNA片段的出现情况，当DNA片段信号与背景噪声的比值达到最高时停止显影（此步骤约需3分钟）。
- 用大量去离子水冲洗平板和凝胶2用纸巾将凝胶板干燥两次。
- 使用合适的扫描仪扫描凝胶。300 dpi 的分辨率可清晰显示 DNA 片段。也可使用相机对凝胶进行拍照。
- 根据图像中的DNA片段对SSR标记的带型模式进行评分。
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结果
利用相应的SSR引物对在开花的中国白菜和烟草中扩增出PCR产物。电泳后，采用上述银染方法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色，清晰地检测到SSR标记的条带模式（图1）。
为了比较不同银染方案的检测效率，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离烟草和菜心SSR标记的PCR产物，并利用五种已发表的银染方案9,11,12,13,14以及新方案进行显色。所有六种方案均能检测到烟草和菜心基因型的SSR条带模式（图2），但本研究中的新方案背景噪音最低...
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讨论
浸渍后对凝胶的洗涤是一个关键步骤。洗涤时间不足或用水量不够，可能导致平板表面和凝胶表面的浸渍溶液去除不完全，从而产生较深的背景。适当的显影时间是另一个关键步骤，过度显影会导致背景呈深棕色，DNA片段图像对比度降低。此外，浸渍步骤显著影响DNA片段的染色效率。尽管将浸渍时间延长至5分钟以上或增加浸渍液中AgNO3的用量并不能显著提高染色质量，但将浸渍时间缩短至3分钟以下或减少AgNO3的用量（<1 g），则可能导致DNA片段呈现灰色或浅黑色。
一种理想的银染方法应具备快速简便的操作流程，以实现高效的DNA检测。本研究开发的新方案避免了其他方案中所描述的固定、终止以及多次洗涤步骤。6,9,10,11,12
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由国家自然科学基金广东联合基金（2015A030313500）、广东省重点国际科技合作研究平台及广东省高等教育重大科研项目（2015KGJHZ015）、广东省烟草专卖局科技计划项目（201403，201705）、中国广东省科技计划项目（2016B020201001）以及国家大学生创新创业训练计划项目（201711078001）资助。本出版物中提及的商标名称或商业产品仅用于提供具体信息，不意味着美国农业部对其有任何推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PCR预混液（绿色Taq预混液） | Vazyme Biotech Co. Ltd, 中国 | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, 美国 | #170-8200 | |
| DL500 DNA标记物 | Takara Bio Inc., 日本 | #3590A | |
| Tris碱 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #77-86-1 | |
| 硼酸 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | 广州化学试剂厂，中国 | #6381-92-6 | |
| 丙烯酰胺 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #79-06-1 | |
| N,N'-亚甲基双丙烯酰胺 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国 | #110-18-9 | |
| 过硫酸铵 | 广州化学试剂厂，中国 | #7727-54-0 | |
| 结合硅烷 | 索莱宝科技有限公司，北京，中国 | #B8150 | |
| AgNO3 | 国药集团化学试剂有限公司，北京，中国 | #7761-88-8 | |
| 甲醛 | 天津大茂化学试剂厂，中国 | #50-00-0 | |
| NaOH | 广州化学试剂厂，中国 | #1310-73-2 | |
| 乙酸 | 广州化学试剂厂，中国 | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | 天津大茂化学试剂厂，中国 | #497-19-8 | |
| 乙醇 | 广州化学试剂厂，中国 | #64-17-5 | |
| HNO3 | 广州化学试剂厂，中国 | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | 国药集团化学试剂有限公司，北京，中国 | #10102-17-7 | |
| 铬黑T（EBT） | 天津大茂化学试剂厂，中国 | #1787-61-7 | |
| 塑料托盘 | 上海亿晨塑料制品有限公司，中国 | - | |
| TS-1摇床 | 江苏麒麟比尔伯科技有限公司，中国 | - | |
| BenQ M800扫描仪 | 明基电通有限公司，中国 | - | |
| DYY-6C电源 | 北京六一仪器厂，中国 | - | |
| 高通量垂直凝胶电泳系统，JY-SCZF | 北京通用电泳设备有限公司，中国 | - |
参考文献
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