大型动物淋巴结的采集与处理以用于RNA分析：为大型动物物种淋巴结转录组学研究做准备

摘要

本方案概述了从大型动物淋巴结组织中分离RNA以进行转录组分析的操作流程，包括家畜和野生动物淋巴结的识别与切除步骤、在多个动物间保持一致性的取样方法，以及采集后RNA分析所需的保存与处理注意事项和代表性结果。

摘要

大型动物（包括家畜和野生动物）是人畜共患病原体的重要储存宿主，包括 布鲁氏菌, Mycobacterium bovis, 沙门氏菌，以及 E. coli，并且可用于研究细菌在自然宿主中的致病机制和/或传播过程。鉴于淋巴结在宿主免疫反应中的关键作用，淋巴结组织可作为下游转录组分析的潜在RNA来源，以评估感染过程中细胞基因表达的时间动态变化。本文概述了家畜淋巴结采集、组织取样及后续RNA处理的流程，以牛（*Bos taurus*）为例进行说明。关键词：淋巴结采集，组织取样，RNA提取，转录组分析，感染模型，家畜，牛Bos taurus) 作为模型，并以美洲野牛（Bison bison）。该方案包含了有关从动物体内多个关键部位进行淋巴结定位、识别和摘除的信息。此外，还介绍了一种活检取样方法，可实现跨多个动物个体的一致性取样。文中讨论了多种样本保存的注意事项，包括制备适用于下游技术（如RNA测序和RT-PCR）的RNA。由于大型动物研究中固有的长时间延迟问题 与 小鼠时间序列研究，本文展示了来自野牛和牛淋巴结组织的代表性结果，用以描述此类组织中RNA降解的时间进程，并结合以往关于其他组织中RNA降解方法学研究的综述进行阐述。总体而言，本方案对于启动大型动物样本转录组研究的兽医研究人员，以及希望学习相关技术的分子生物学家均具有实用价值。 体内 组织取样和 体外 处理。

引言

对淋巴结转录组进行RNA测序分析，可为研究动物对多种病原体的免疫应答提供机会。尽管该方法已在小鼠中得到广泛应用，但近年来相关研究正逐步扩展至大型哺乳动物^1,2。家畜或大型动物的淋巴结可用于表征宿主对感染的应答，不仅可用于疫苗研发、遗传易感性研究以及药物开发靶点的鉴定，还可作为研究人畜共患病的人类疾病模型系统。例如，对于布鲁氏菌病（一种每年影响全球约五十万人的人畜共患细菌性疾病），尽管研究成本显著增加，但在绵羊或山羊中开展的研究相较于实验室动物模型，更贴近人类感染情况和人类疫苗的研发。小鼠感染模型虽能模拟网状内皮系统的感染过程，但无法再现其特征性临床症状³_。

与实验室动物研究相比，在大型动物实验中，组织采样过程必然存在安乐死后与组织采集之间更长的延迟，这给高质量RNA的保存带来了潜在挑战。完整的RNA对于生成具有生物学意义的转录组数据至关重要。在生物安全 containment 设施中开展的大型动物病原体研究中，从组织样本中获取高质量RNA尤为关键。此类研究本身实施难度较大，不仅需要经过批准的设施和高度训练的专业人员，还涉及显著的经济成本，根据具体工作的不同，费用可能从数万到数十万美元不等。这类研究通常还需要跨学科协作与跨学科知识的整合，进一步增加了其复杂性。因此，对样本采集与保存流程进行系统....

方案

本文所示的动物尸检程序均在中国爱荷华州艾姆斯国家动物疾病中心经批准的IACUC方案涵盖范围内进行。所有实验均依照批准的动物护理与福利指南开展。

1. 尸检前的准备工作

1. 在进行剖检前，准备以下材料并运送至剖检室：
   1. 装有约 1.0 mL RNA 保存液的 1.5 或 2 mL 微量离心管，置于试管架或转运容器中。务必遵循制造商关于保存液体积与组织体积比例的指导说明。
   2. 一次性解剖刀片和洁净、经高压灭菌的镊子：一套用于皮肤解剖，另一套专门用于采集淋巴结（每只动物每个淋巴结使用一套），以防止皮肤及环境微生物群对淋巴结组织造成交叉污染。
   3. 3 mm 打孔活检工具、剖检刀、用于盛装使用过的解剖刀片和活检工具的锐器盒，以及用于淋巴结解剖的砧板或一次性托盘。
   4. 穿戴个人防护装备，包括根据该系统所要求的相应生物安全等级（BSL）规定的个人防护装备。
   5. 使用器具/干物灭菌程序，在剖检前将可重复使用的金属工具（包括镊子）置于金属托盘中进行高压灭菌。

2. 牛和野牛淋巴结的鉴定与采样

结果

本文所述注意事项（方案中的步骤 1 - 4）将有助于从大型动物样本中提取适用于宿主基因表达研究下游分析的 RNA。通过多种标准方法评估 RNA 在下游应用中的质量。在分光光度法检测中，A₂₆₀/A₂₈₀ 比值可反映蛋白质污染程度，而 A₂₆₀/A₂₃₀ 比值则可用于评估纯度，以检测苯酚等化学污染物。通常，比值约为 2.0 表明 RNA 质量较高，比值降低则提示存在污染。重要的是，这些比值无法提供有关 RNA 降解的信息，RNA 降解情况可通过定性方法（步骤 4.15 - 4.17）和定量方法（步骤 4.18，例如通过 RNA 完整性数值或 RIN 评分）进行评估。

需要注意的是，从淋巴结组织切片中回收的RNA质量水平通常低于从牛外周血白细胞样本中回收的RNA。在Fleige和Pfaffl开展的一系列针对牛组织和细胞系的RNA提取研究中³⁰ 发现平均RIN（在Bioanalyzer上测得的RNA完整性数值）在不同样本间存在差异 < 5 用于空肠.......

讨论

大多数转录组学研究及相关实验方案主要关注小鼠、大鼠或死后人类样本。然而，对家畜和野生动物的研究为表征免疫系统对疾病的应答提供了广泛的机会，这些研究不仅适用于兽医学，也与人畜共患疾病的公共卫生密切相关。本实验方案概述了从牛、野牛、山羊和绵羊等大型动物组织中提取高完整性RNA的关键注意事项。由于动物体型较大，且样本采集条件复杂，使得组织获取过程更为耗时，其死后处理时间也比小鼠淋巴结的获取更长。同样，这些淋巴结体积较大，因此需要采用能够从不同动物中平行获取样本、并能代表淋巴结内免疫学/病理学变化的实验方案。本方案中关于样本采集的建议，有助于获得完整的RNA，同时通过淋巴结分段取样，确保获得具有代表性的分子谱型。

为了说明此处所介绍的标准化取样策略和方案的重要性，我们从 PubMed Central 数据库中检索了 25 篇表征家畜淋巴结转录组的研究论文。其中一篇论文提到一次性处理大块淋巴结组织，一篇讨论了特定的激光捕获显微切割方法，一篇提到从淋巴结中采集了“"代表性样本"”，仅有一篇论文⁴⁶ 明确指出所采集的淋巴结.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNA保存液（本实验均使用RNALater）	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml或2 ml聚丙烯微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129
一次性手术刀	Daigger Scientific	EF7281
组织镊，鼠齿型	Fisher Scientific	12-460-117	也可选用其他类型的组织镊，如弯头、锥形边缘等，视用户偏好而定
3 mm穿刺活检针	Fisher Scientific	NC9949469
锐器盒（小型且便于携带，用于解剖）	Stericycle	8900SA	图示为1夸脱规格
切片板或一次性托盘	Fisher Scientific	09-002-24A	有多种尺寸可选，视用户偏好而定
个人防护装备			根据病原体不同而异（手套、呼吸器面罩、护目镜等）
酚类RNA提取试剂（本实验均使用TRIzol试剂）	ThermoFisher	15596026
基于二氧化硅柱的RNA提取试剂盒（本实验均使用PureLink RNA Mini试剂盒）	ThermoFisher	12183018A	适用于最多100 mg组织
100%乙醇（分子生物学级，200 proof）	Sigma-Aldrich	E7023
配备封闭式匀浆管的组织匀浆仪（本实验均使用gentleMACS解离仪）	Miltenyi Biotec	130-093-235
琼脂糖（通用型，用于凝胶电泳）	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	也可在实验室自行配制
去离子甲酰胺	EMD Millipore	S4117
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	114391
二甲苯青	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA（乙二胺四乙酸）	Sigma-Aldrich	EDS
紫外-可见分光光度计（本实验使用NanoDrop分光光度计）	ThermoFisher	ND-2000
用于RNA定量分析的设备（本实验使用Bioanalyzer及其配套组件和方案）	Agilent	G2939BA
FFPE组织RNA提取试剂盒（本实验使用RecoverAll总核酸分离试剂盒，适用于甲醛固定、石蜡包埋组织）	ThermoFisher	AM1975
塑料涂布棒（L形涂布棒）	Fisher Scientific	14-665-231	仅用于感染动物样本的无菌检测
解剖刀	Livestock Concepts	WI-0009209