大动物淋巴结的采集与处理 RNA 分析: 大动物 Transcriptomic 淋巴结的制备研究

摘要

本议定书概述了从大型动物的淋巴结组织 transcriptomic 分析中分离 RNA 的程序, 包括从家畜和野生动物中鉴别和切除淋巴结的步骤, 取样方法为了在多个动物之间提供一致性, 并考虑到收集后保存和处理 RNA 分析的代表性结果。

摘要

大型动物 (牲畜和野生动物) 是人畜共患病病原体的重要储集物, 包括布鲁氏杆菌、牛分枝菌、沙门氏菌和大肠杆菌, 并有助于研究发病机制和/或细菌在天然寄主中的传播。随着淋巴结在宿主免疫应答中的关键作用, 淋巴结组织作为潜在的 RNA 来源, 为下游 transcriptomic 分析, 以评估在细胞感染过程中基因表达的时间变化。本文概述了在家畜的淋巴结收集, 组织取样和下游 RNA 处理的过程, 使用牛 (金牛座) 作为模型, 并提供了更多的例子, 美国野牛 (野牛野牛).该协议包括有关人体内多个关键部位淋巴结的位置、识别和清除的信息。此外, 还提出了一种活检抽样方法, 允许在多个动物之间进行抽样的一致性。讨论了样品保存的几个考虑因素, 包括 rna 序列和 rt-pcr 等下游方法的生成。由于大型动物vs小鼠时间课程研究中固有的长时间延迟, 提出了野牛和牛淋巴结组织的代表性结果来描述这种组织类型中退化的时间过程, 在审查其他组织中 RNA 降解的以前的方法学研究。总的来说, 这项议定书将是有益的两个兽医研究员开始转录项目的大型动物样本和对学习技术的分子生物学家感兴趣的体内组织取样和体外处理。

引言

RNA 序列分析的淋巴结转录提供了机会, 以描述动物的免疫反应的各种病原体。虽然这种方法已广泛应用于小鼠, 但最近的分析已经扩展到较大的哺乳动物^1,2。牲畜/大型动物淋巴结可用于鉴定宿主对感染的反应, 不仅用于疫苗或遗传易感性研究以及确定药物发展目标, 而且还作为人类研究的模范系统。关于人畜共患病。例如, 在布鲁氏菌病 (每年影响全世界100万人的人畜共患病细菌疾病) 的情况下, 尽管费用大大增加, 但绵羊或山羊的研究与人类感染和人类疫苗的相关性更大。发展比实验动物模型。老鼠感染模型重述了内皮系统感染, 但没有特点的临床标志³_.

在大型动物实验中, 与实验动物研究相比, 组织收获的过程必然涉及安乐死与组织收集之间的较长延迟, 这给保存高质量的 RNA。完整的 RNA 是产生生物相关 transcriptomic 数据的必要条件。从组织样本中生成高质量的 RNA 对于在密闭设施中进行的大型动物病原体研究尤其重要。这种研究在本质上更难执行, 因为它们不仅需要核定的设施和训练有素的人员, 而且还要承担重大的财政费用, 这取决于工作, 可以从数以万计的美元不等。这些类型的研究还涉及跨学科协作和跨学科的知识, 以完成他们的工作, 增加他们的复杂性。因此, 对样本收集和保存的简化系统进行培训、开发和遵守....

方案

这里描述的动物尸检程序是在国家动物疾病中心, 艾姆斯, IACUC 批准的协议范围内。所有实验都是按照批准的动物护理和福利准则进行的。

1. 尸检前的预规划

1. 在尸检之前, 准备以下材料运输到尸检套件:
   1. 1.5 或2毫升离心管填充1.0 毫升的 RNA 保存溶液, 在机架或运输容器中。确保按照制造商的指导方针, 保存液体积与组织体积的比值。
   2. 一次性手术刀和清洁, 蒸压钳: 一组用于解剖皮肤和另一套收集淋巴结 (一个为每个淋巴结, 每种动物), 从而防止皮肤和环境菌群的交叉污染与淋巴结组织。
   3. 3毫米冲压活检工具, 尸检刀, 用于手术刀和活检工具的锋利容器, 以及用于淋巴结清扫的切割板或一次性托盘。
   4. 使用个人防护设备, 包括为系统适当的 BSL 级别工作所需的 PPE。
   5. 可重复使用的金属工具, 包括镊子, 在尸检前的金属锅中, 采用器皿/干品设置。

2. 牛和野牛淋巴结的鉴定和取样

结果

使用本文中提出的考虑因素 (《议定书》 1-4 步) 将有助于从大型动物标本中恢复 RNA, 这些样本适合于宿主基因表达研究的下游分析。下游应用的 RNA 质量由多种标准措施评估。对于分光光度,₂₆₀/₂₈₀比值提供了对蛋白质污染的度量, 而₂₆₀/₂₃₀比值提供了另一种纯度评估方法, 可检测苯酚等化学污染物。在每种情况下, 2.0 的比率是高质量 RNA 的证据, 而降低比率则是污染的证据。重要的是, 这些比率没有提供任何关于 RNA 降解的信息, 可以定性地评估 (步骤 4.15-4.17) 和定量 (步骤 4.18, 如通过 RNA 完整性数字或玲评分)。

重要的是要注意到, 从淋巴结组织切片中恢复的 rna 的预期质量水平, 平均而言, 低于从牛白细胞样本中恢复的 rna。在从牛组织和细胞系的综合系列 RNA 提取中, Fleige 和 Pfaffl³⁰发现, 平均 (RNA 完整性数字 Bioanalyzer) 在空肠和瘤胃组织的 <.......

讨论

大多数的 transcriptomic 研究和相关的协议集中在老鼠, 老鼠, 或验尸后的人类样本。然而, 对牲畜和野生动物的调查为对疾病的免疫反应的定性提供了广泛的机会, 无论是适用于兽医医学, 还是关于人畜共患病, 人类公共卫生。该协议提供了一个概要的关键考虑的高完整性 RNA 提取从组织从大型动物, 如牛, 野牛, 山羊和绵羊。动物的大小, 以及样本收集的条件, 使恢复更广泛的过程, 更长的验尸后处理时间比小鼠淋巴结恢复。同样, 这些淋巴结的大面积需要从不同的动物中恢复平行样本的协议, 以及代表淋巴结内免疫学/病理变化的样本。本协议中样本收集的建议提供了完整的 RNA 的恢复以及基于淋巴结切片的代表性剖面。

为了证明标准化抽样策略和协议的重要性, 我们从 PubMed 中央数据库中调查了25篇论文, 其中描述了家畜淋巴结的 transcriptomes。一篇论文指出, 一次大淋巴结的处理, 一个讨论了特定的激光捕获显微切割方法, 其中一个提到 "代表性样本" 收集从淋巴结, 只有一纸⁴⁶表明所收集的淋巴结 (10 毫米^3.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNA 保存溶液（我们在所有实验中使用 RNALater）	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml 或 2 ml 聚丙烯微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129
一次性手术刀	Daigger Scientific	EF7281
组织镊子，大鼠牙齿	Fisher Scientific	12-460-117	其他可用的组织镊子，包括弯曲的尖端、锥形边缘等，取决于用户的喜好
3 毫米穿刺活检针	Fisher Scientific	NC9949469
锐器容器（小巧且可携带用于尸检）	Stericycle	8900SA	此处显示的1夸脱尺寸
砧板或一次性托盘	Fisher Scientific	09-002-24A	有多种尺寸可供选择，取决于用户的喜好
个人防护设备			因病原体而异（手套、呼吸面罩、护目镜等）
基于苯酚的 RNA 提取试剂（我们在所有实验中使用 TRIzol 试剂）	ThermoFisher	15596026
硅胶柱式 RNA 提取试剂盒（我们在所有实验中使用 PureLink RNA Mini 试剂盒）	ThermoFisher	12183018A	设计用于高达 100 mg 的组织
100% 乙醇（分子生物学的 200 证明）	Sigma-Aldrich	E7023
带有封闭均质管的组织匀浆器（我们在所有实验中使用了 gentleMACS 解离器）	Miltenyi Biotec	130-093-235
琼脂糖（通用，用于凝胶电泳）	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	也可以在实验室中从头开始制作
去离子甲酰胺	EMD Millipore	S4117
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	114391
二甲苯蓝	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA（乙二胺四乙酸）	Sigma-Aldrich	EDS
紫外-可见分光光度计（我们使用 NanoDrop 分光光度计）	ThermoFisher	ND-2000
用于定量 RNA 评估的装置（我们使用生物分析仪，以及相关组件和方案）	安捷伦	G2939BA
FFPE RNA 提取试剂盒（我们使用 RecoverAll 总核酸分离试剂盒用于福尔马林固定、石蜡包埋组织）	ThermoFisher	AM1975
塑料撒布机（L 形撒布机）	Fisher Scientific	14-665-231	仅需要对受感染动物的样品进行无菌测试
尸检刀	畜牧概念	WI-0009209