本方案概述了从大型动物淋巴结组织中分离RNA以进行转录组分析的操作流程，包括家畜和野生动物淋巴结的识别与切除步骤、在多个动物间保持一致性的取样方法，以及采集后RNA分析所需的保存与处理注意事项和代表性结果。
本文内容
摘要
摘要
大型动物（包括家畜和野生动物）是人畜共患病原体的重要储存宿主，包括 布鲁氏菌, Mycobacterium bovis, 沙门氏菌，以及 E. coli，并且可用于研究细菌在自然宿主中的致病机制和/或传播过程。鉴于淋巴结在宿主免疫反应中的关键作用，淋巴结组织可作为下游转录组分析的潜在RNA来源，以评估感染过程中细胞基因表达的时间动态变化。本文概述了家畜淋巴结采集、组织取样及后续RNA处理的流程，以牛（*Bos taurus*）为例进行说明。关键词：淋巴结采集，组织取样，RNA提取，转录组分析，感染模型，家畜，牛Bos taurus) 作为模型，并以美洲野牛（Bison bison）。该方案包含了有关从动物体内多个关键部位进行淋巴结定位、识别和摘除的信息。此外，还介绍了一种活检取样方法，可实现跨多个动物个体的一致性取样。文中讨论了多种样本保存的注意事项，包括制备适用于下游技术（如RNA测序和RT-PCR）的RNA。由于大型动物研究中固有的长时间延迟问题 与 小鼠时间序列研究，本文展示了来自野牛和牛淋巴结组织的代表性结果，用以描述此类组织中RNA降解的时间进程，并结合以往关于其他组织中RNA降解方法学研究的综述进行阐述。总体而言，本方案对于启动大型动物样本转录组研究的兽医研究人员，以及希望学习相关技术的分子生物学家均具有实用价值。 体内 组织取样和 体外 处理。
引言
对淋巴结转录组进行RNA测序分析，可为研究动物对多种病原体的免疫应答提供机会。尽管该方法已在小鼠中得到广泛应用，但近年来相关研究正逐步扩展至大型哺乳动物1,2。家畜或大型动物的淋巴结可用于表征宿主对感染的应答，不仅可用于疫苗研发、遗传易感性研究以及药物开发靶点的鉴定，还可作为研究人畜共患病的人类疾病模型系统。例如，对于布鲁氏菌病（一种每年影响全球约五十万人的人畜共患细菌性疾病），尽管研究成本显著增加，但在绵羊或山羊中开展的研究相较于实验室动物模型，更贴近人类感染情况和人类疫苗的研发。小鼠感染模型虽能模拟网状内皮系统的感染过程，但无法再现其特征性临床症状3。
与实验室动物研究相比，在大型动物实验中，组织采样过程必然存在安乐死后与组织采集之间更长的延迟，这给高质量RNA的保存带来了潜在挑战。完整的RNA对于生成具有生物学意义的转录组数据至关重要。在生物安全 containment 设施中开展的大型动物病原体研究中，从组织样本中获取高质量RNA尤为关键。此类研究本身实施难度较大，不仅需要经过批准的设施和高度训练的专业人员，还涉及显著的经济成本，根据具体工作的不同，费用可能从数万到数十万美元不等。这类研究通常还需要跨学科协作与跨学科知识的整合，进一步增加了其复杂性。因此，对样本采集与保存流程进行系统化培训、开发并严格执行标准化操作，将为感染动物组织的后续分子生物学研究带来显著优势。
与小鼠淋巴结的类似取样相比，获取较大的淋巴结在组织采集方面带来了额外的挑战。样本切除前的准备工作需要对淋巴结的解剖结构有基本了解，包括相关的内部构造。淋巴结的结构由淋巴小叶组成，周围环绕着充满淋巴液的窦腔，整个结构被一层坚韧的纤维性被膜所包裹4。淋巴小叶是“淋巴结的基本解剖和功能单位”，由滤泡、深层皮质区以及髓索和髓窦构成4（图 1A）。B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞分别定位于滤泡和深层皮质区。这些结构提供了三维支架，并促进淋巴细胞与抗原或抗原呈递细胞之间的相互作用。
肉眼观察时，滤泡和深层皮质单位在切面上可被识别，因其含有较致密的网状结构，颜色较深，而窦部结构由较纤细的网状组织构成，颜色较浅（图1B）。按照惯例，病理学家将淋巴结的区域分为浅层皮质（滤泡）、副皮质（深层皮质单位）和髓质（髓索和窦）。在淋巴结的常规病理学检查指南中，对这三个区域进行全面检查被认为是最佳实践5。需要注意的是，即使在同一动物体内，淋巴结的质地、大小和颜色也存在显著差异。随着动物年龄增长，其淋巴结通常会逐渐缩小并变得更为坚实，这通常与结缔组织增加以及正常淋巴组织结构减少有关6,7。
图1. 淋巴结的解剖结构。（A）此示意图展示淋巴结的解剖结构，描绘了关键结构。（B）此图片显示一个牛淋巴结的横切面。肉眼可见的相关结构/层次已被标出。请点击此处查看该图的放大版本。
根据实验问题的不同，用于采集和分析的淋巴结也会有所差异。外周淋巴结位于皮下组织深层。在牛中，临床和实验实践中常用的外周或浅表淋巴结包括腮腺淋巴结、下颌下淋巴结、咽后淋巴结、肩前淋巴结、股前淋巴结（胫前淋巴结）以及浅腹股沟淋巴结（雌性为乳房上淋巴结，雄性为阴囊淋巴结）（图2）。在 表1 中，列出了牛体系统中所述主要浅表淋巴结的特性8。以下列出了一些针对牛细菌性传染病研究的潜在淋巴结采集方案，可作为开展研究的起点。
布鲁氏菌 abortus/布鲁氏菌 melitensis：标准尸体解剖用于 B. abortus-感染的牛和 B. melitensis在中国台湾的国家动物疾病中心，对感染山羊采集肩上、肩前和腮腺淋巴结组织，用于细菌计数的研磨处理以及宿主RNA表达谱分析的RNA提取。 B. abortus 在实验感染的牛中，可定期从上述每个淋巴结中回收到9. 可在每种类型的淋巴结中检测到细菌的存在 B. melitensis-感染山羊体内至少九个月，采用本研究中的基于RNA的方法学（Boggiatto 等，未发表）。 沙门氏菌 sp.：肩前、髂下（股前）和肠系膜淋巴结在对牛胴体进行特征分析时具有重要价值 沙门氏菌 患病率10,11,12 并且可能对转录组学研究具有潜在意义。 E. coli O157:H7肠系膜淋巴结（位于中段小肠和远端小肠处）可能是感染犊牛中偶尔分离出细菌的部位（但在感染的成年牛中则未见）。13. 钩端螺旋体病（钩端螺旋体 sp.在乳腺引流淋巴结中已观察到细菌的长期持续存在14. Mycobacterium bovis: 在牛中，实验感染后已从犊牛的纵隔和气管支气管淋巴结中分离出该细菌15此外，淋巴结RNA已被用于研究大型动物宿主对病毒的应答，例如猪繁殖与呼吸综合征病毒2. 图2 展示了这些主要淋巴结在牛体内的部分位置。
图2： 示意图展示家牛（Bos taurus）部分淋巴结的位置。图中编号的淋巴结已作标注。请点击此处查看该图的放大版本。
在本文及相关的视频中，我们介绍了一种用于RNA研究的大型动物淋巴结分离方案，旨在为从事大型动物感染转录组学研究的分子生物学家提供参考。首先，我们以牛和野牛组织取样为例，概述了淋巴结分离的操作流程。配合视频展示的内容，提供了一套可重复的组织取样工作流程，用于RNA提取。接下来，我们详细说明了处理感染性淋巴结时的重要注意事项，重点包括安全性、操作一致性以及RNA质量的保障。
使用酸化酚-胍基异硫氰酸盐试剂从组织中提取RNA的方法基于Chomczynski和Sacchi16,17的原始方法，并结合Vogelstein和Gillespie18开创的在变性剂存在下通过基于硅胶的离心柱进行纯化的技术。我们还探讨了从采用不同保存方法的牛淋巴结中回收用于转录组学研究的RNA的可能性。最后，我们研究了时间变量对大型动物尸体解剖中RNA质量的影响，包括一个代表性实验，展示从安乐死到采样之间时间延长对野牛和牛淋巴结中回收RNA谱型的影响。本文不仅对分子生物学家，也对刚开始开展转录组学研究的兽医研究人员具有参考价值。
方案
本文所示的动物尸检程序均在中国爱荷华州艾姆斯国家动物疾病中心经批准的IACUC方案涵盖范围内进行。所有实验均依照批准的动物护理与福利指南开展。
1. 尸检前的准备工作
- 在进行剖检前，准备以下材料并运送至剖检室：
- 装有约 1.0 mL RNA 保存液的 1.5 或 2 mL 微量离心管，置于试管架或转运容器中。务必遵循制造商关于保存液体积与组织体积比例的指导说明。
- 一次性解剖刀片和洁净、经高压灭菌的镊子：一套用于皮肤解剖，另一套专门用于采集淋巴结（每只动物每个淋巴结使用一套），以防止皮肤及环境微生物群对淋巴结组织造成交叉污染。
- 3 mm 打孔活检工具、剖检刀、用于盛装使用过的解剖刀片和活检工具的锐器盒，以及用于淋巴结解剖的砧板或一次性托盘。
- 穿戴个人防护装备，包括根据该系统所要求的相应生物安全等级（BSL）规定的个人防护装备。
- 使用器具/干物灭菌程序，在剖检前将可重复使用的金属工具（包括镊子）置于金属托盘中进行高压灭菌。
2. 牛和野牛淋巴结的鉴定与采样
图 3．牛头部与颈部的淋巴结。（A）该示意图展示了Bos taurus头部和颈部的部分淋巴结。（B）该图像显示了腮腺淋巴结的横切面（左），并与腮腺唾液腺的横切面（右）进行对比。请注意两种组织类型在质地上的差异。请点击此处查看此图的放大版本。
- 牛和野牛肩前淋巴结的分离
- 根据当地IACUC方案对动物（牛或野牛，根据实验需要选择适当年龄）实施安乐死。按照机构IACUC方案中具体描述的方法确认动物死亡，包括无心跳、无呼吸及角膜反射消失。将动物转移至解剖区域。
注意：在大型动物的实验室实践中，存在多种人道安乐死方法。然而，静脉注射戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液是最常被批准和使用的方法。请参考美国兽医协会（AVMA）发布的动物安乐死指南。19
注意：须遵守所在机构尸体解剖相关的全部生物安全规程，包括将一次性手术刀使用后产生的锐器废弃物置于防刺穿容器中安全处置，以及对可重复使用的金属刀具和镊子进行去污处理。本方案使用一次性手术刀会产生锐器废弃物。应根据机构规定穿戴个人防护装备，包括靴子、防护服、手套和眼部防护装置。 - 确定3名参与者负责动物组织的处理工作。
注意：此处，解剖员1负责对目标动物组织进行大范围切段，解剖员2负责从不同动物组织段中回收淋巴结，解剖员3则在另一张实验台上操作，分离各淋巴结的组织片段并将其转移至含有保存液的离心管中。 - 首先将动物置于侧卧位。
- 通过将前肢在膝关节（腕关节）水平向后移动来伸展肩部；该动作可使肩部后移，便于更轻松地触诊淋巴结。触摸以感知淋巴结“肿块”的存在。
注意：在疾病状态下，可能出现淋巴结肿大，这会使淋巴结的识别更加容易，但这一过程也可能影响淋巴结的质地、组成及结构。 - 找到位置后，保持肩部仍处于伸展状态，使用手术刀或解剖刀沿肩部轮廓进行皮肤切口。
注意：即使已找到淋巴结，也不要限制切口的大小 通过 触诊。较大的切口可更方便地接触到深层组织，并使解剖者更容易切除淋巴结。 - 使用一对镊子将皮肤拉开，以暴露肩部和颈部肌肉的交界处。
注意：肩前淋巴结常位于皮下脂肪中，尤其是在营养状况过佳的动物中。 - 再次触诊淋巴结的位置（图 3A).
注意：与皮下脂肪不同，触诊时淋巴结会保持其形状。此外，淋巴结由一层薄的纤维囊包绕，不与周围任何组织相连。 - 找到肩前淋巴结后，使用解剖刀和镊子仔细剥离周围的皮下脂肪组织，并分离出淋巴结。
- 观察是否存在如图所示的薄纤维囊 图1B，以区分淋巴结与脂肪组织；淋巴结不与周围任何组织相连。
- 将淋巴结转移至淋巴结解剖台，使用塑料托盘转移组织，以进行后续切片。
注意：这些淋巴结在美洲野牛体内的外观相似。相关视频展示了从美洲野牛右侧肩部解剖出的肩前淋巴结的外观。
- 根据当地IACUC方案对动物（牛或野牛，根据实验需要选择适当年龄）实施安乐死。按照机构IACUC方案中具体描述的方法确认动物死亡，包括无心跳、无呼吸及角膜反射消失。将动物转移至解剖区域。
- 牛和野牛腮腺淋巴结的分离
关键词：腮腺淋巴结，牛，野牛，淋巴结分离，免疫学，组织采集
- 首先将动物置于解剖台面上呈侧卧位。定位颞下颌关节（TMJ）。
- 如果难以定位，可缓慢移动下颌，确定下颌与颅骨相连的位置，此处即为颞下颌关节（TMJ）。
- 使用解剖刀小心地在皮肤上做切口。从关节背侧开始切口，沿下颌线向下/垂直延伸。
- 分离皮肤以暴露皮下组织。由于腮腺体积较大、表面呈分叶状且呈红色，因此将首先显露。
- 使用镊子和手术刀将腮腺唾液腺移开，以找到位于唾液腺头侧和内侧的腮腺淋巴结（图 3A）。在进一步处理前，检查腮腺淋巴结组织的质地。
注意：面部淋巴结（腮腺和下颌下淋巴结）与唾液腺相关联，这可能干扰淋巴结的分离。与淋巴结相比，唾液腺体积更大，表面呈分叶状。此外，切面观察时，唾液腺组织质地均一，不具有淋巴结典型的皮质和髓质结构特征。图3B). - 用手术刀切除腺体，并使用塑料托盘将组织转移至淋巴结解剖台，以进行进一步切片。
- 首先将动物置于解剖台面上呈侧卧位。定位颞下颌关节（TMJ）。
- 雌性牛和野牛乳房上淋巴结的分离
- 将动物置于侧卧位。
- 抬高后肢以暴露腹股沟区域，并定位乳房。
注意：在健康的非泌乳动物中，这些淋巴结可能无法通过触诊感知。在泌乳动物中，这些淋巴结可能位于乳房基底部后缘，可通过触诊感知。 - 使用手术刀在乳房背侧稍上方做一切口，沿大腿上部延伸，以暴露乳腺上腺。
- 解剖皮下组织，寻找位于皮下脂肪薄层中的乳腺上淋巴结。若肉眼不易分辨，可通过触诊暴露的组织，检查皮下脂肪中是否存在质地较硬的结构。
- 使用镊子和手术刀，仔细从脂肪组织中分离出淋巴结。将其转移至淋巴结解剖台，可使用塑料托盘进行组织转移，以便进一步切片。
3. 淋巴结的切片与保存
- 将解剖器2中分离出的淋巴结转移至位于主解剖区旁侧解剖台上的解剖器3。将每个淋巴结置于切割板的新鲜区域上。预先在切割板的不同区域按淋巴结类型进行标记，以便连续接收多个淋巴结。对于具有感染性的样本，应使用一次性托盘。
- 使用镊子和一次性手术刀或解剖刀，取一段淋巴结组织。用锋利的刀片沿矢状面切开淋巴结。
- 检查淋巴结内部，尤其是来自感染动物的样本，观察是否存在不对称、病变或颜色差异， 等等。 记录观察结果。
- （选项1）小组织切片
- 使用一次性手术刀切取厚度小于5 mm的各淋巴结组织块，并用洁净镊子将每块组织转移至含有RNA保存液的离心管中。
- （选项2）淋巴结活检或切片技术
注：当对不同动物的不同淋巴结的平行淋巴结切片应用活检或切片方法时，可为大规模RNA分析提供组织取样的一致性。- 楔形切片法
- 在检查矢状切面以获取跨越淋巴结剖面的细胞后，从淋巴结中心至外层被膜切除一块楔形组织。对于直径2 cm（标准大小；参见 表1)，一个切至中心、外弧长为 4 mm、厚度为 5 mm 的楔形组织块湿重约为 100 mg。
- 使用解剖刀将组织楔形块切成小块，每块厚度不超过5 mm，湿组织重量约为50 - 100 mg。
注意：为保持一致性，应将单个淋巴结的所有楔形组织样本统一在同一批次中处理，或分别在不同管中处理后再进行RNA合并，以获得具有代表性的目标淋巴结RNA表达谱。 - 用镊子将组织块放入含有至少10倍于组织体积的RNA保存液的离心管中。
- 活检穿孔法
- 如果目标是采集特定区域（如淋巴结中的特定毛囊），应选择环钻活检工具。所选工具应与所需采集样本的大小相匹配。环钻活检工具的直径范围一般为1至8 mm。
- 在淋巴结中目视定位待取样的感兴趣区域。
- 使用穿孔活检工具切除目标组织区域，将工具压入组织并旋转以获取组织芯。用镊子将组织块转移至含有至少10倍体积RNA保存液的离心管中。若组织厚度超过5 mm，需用镊子和手术刀进一步将其分割成更小的组织块。
- 楔形切片法
- 样本转移至保存液后（例如，RNALater），在室温下运回实验室。
- 将样品储存于 4 °C 过夜以促进组织渗透。
- 第二天，倒掉过量的RNA保存液，并将组织样本置于 -80 °C尽可能在冷冻样本前去除保存液。使用 P1000 和/或 P200 微量移液器吸头高效移除 RNA 保存液。
警告：应根据所用病原体的感染特性以及保存液在安全数据表中注明的化学和环境危害，妥善处理倾倒出的保存液。
注意：此处提供的指南适用于文中所述的RNA保存液 材料表若使用其他保存液，请参考生产商的使用说明。
4. 从RNA淋巴结进行处理
注意：进行处理步骤时，需穿戴实验服、手套和适当的眼部防护装备。
注意：此处使用的基于苯酚的试剂在材料表中有说明（该方案基于生产商的指导）20。使用其他基于苯酚的试剂可能需要根据所购特定产品的生产商建议对步骤进行相应调整。
- 在接触样本前，预先将已冷却的（4 °C使用移液器将基于苯酚的试剂加入匀浆管（每管1.5 mL）。
注意：苯酚具有毒性、腐蚀性，且对健康有害。氯仿具有毒性，且对健康有害。请在通风橱内完成步骤 4.1–4.9 的全部操作，并佩戴手套以避免接触化学品。在美国，氯仿属于危险废物；含危险废物的离心管须根据当地及机构规定进行处置。对感染病原体的动物组织样本，须在相应的 BSL-2、BSL-3 或 BSL-4 实验室安全等级规范下进行处理。 - 一旦可用洁净镊子将样品从微量离心管中松动，立即转移约50 - 100 mg的保存组织至含有酚类试剂的匀浆管中。
- 在将样品加入基于苯酚的试剂之前，应限制其解冻。当从冷冻机中取出多个样品进行处理时，应使用干冰保存。
- 盖紧管盖，将管子置于匀浆器上，使用转子-定子组织匀浆器在基于苯酚的试剂中匀浆样品。整个操作在室温下完成。匀浆完成后，检查样品是否呈浑浊外观，以确认组织已成功匀浆；组织应分散成浑浊的悬浮液。
注意：采用2 min的RNA提取程序（即针对所述匀浆器预设的RNA_02_1程序） 材料清单；适用于冷冻组织）。本方案中指定的转子-定子（见下文） 材料表）具有较大的齿状结构，适用于多种组织类型（包括纤维性材料）的均质化处理。RNA_02_01 设置专为冷冻（而非新鲜）组织设计。由于淋巴结含有纤维性结缔组织成分，建议采用类似优化的转子-定子匀浆器以实现有效的组织解离。参见美国国家环境卫生科学研究所21 有关均质化建议的更多信息。- 如果匀浆后仍有较大的组织块残留，请重复匀浆步骤。为了高效回收RNA，组织必须充分解离。
- 对于纤维较多的淋巴结组织，应使用镊子和剪刀在转移至匀浆管前先将淋巴结切成若干较小的组织块。如引言中所述，来自较老年动物的淋巴结组织可能纤维含量更高。
注意：如果需要对宿主和病原体RNA进行双重分析，可能需要额外处理（例如珠磨均质化），以提高组织中细菌RNA的回收率，特别是当存在革兰氏阳性病原体时。
- 立即用 P1000 移液器将匀浆后的样品从管中取出，转移至无 RNase 的微量离心管（2.0 mL 规格）中。
- 在 12,000 × g 条件下离心样品 5 分钟 4 °C 以去除任何样本碎片。使用 P1000 微量移液器吸头，将上清液转移至新的微量离心管中，保留沉淀。
- 室温孵育上清液5分钟。将每个样品均分至两个1.5 mL微量离心管中。
- 每1 mL酚类试剂中加入0.2 mL氯仿即，1.5 mL 样品使用 0.3 mL）；用手颠倒离心管 1 - 2 分钟以混匀各相，切勿涡旋震荡。室温孵育 2 分钟。
- 在 12,000 x g 条件下离心 15 分钟 4 °C.
- 用移液枪头（P1000 或 P200）小心吸取上层透明的水相，该相将形成上层，注意不要扰动中间相或下层红色的苯酚-氯仿层。将其转移至新的微量离心管中。
- 加入等体积的100%乙醇，通过倒置离心管4–5次充分混匀。管内溶液通常会呈现浑浊状态。
- 使用微量移液器吸头，将液体转移至基于硅胶的商用离心柱中，按照制造商说明书进一步纯化并洗脱RNA22. 将从约 50 mg 组织中提取的 RNA 洗脱至 50 - 100 µl 无RNase水。
注意：虽然基于酚类试剂的提取可去除有机相中的 DNA，但为了在 qRT-PCR 和/或 RNA 测序应用中下游使用 RNA，建议对 RNA 样本进行额外的 DNase 处理。 - 将洗脱的RNA分装至不同的离心管中，用于后续定量和质量评估，以减少主RNA样品的冻融次数。将离心管转移至 -80 °C 用于储存。
- 对于源自感染人畜共患病原体动物的淋巴结样本，特别是在生物安全三级（BSL-3）防护条件下，若需将样本转移至较低生物安全等级的区域进行质量分析、逆转录PCR 和/或RNA测序文库制备，则必须验证所获得的RNA样本中无人畜共患病原体。
注意：必须考虑当地的法规要求，若涉及美国疾病控制与预防中心（CDC）关于特定病原体操作的灭活指南，则研究人员需在本地实验室对所有灭活程序进行验证。- 移除十分之一th 步骤4.12中每份洗脱RNA样本的体积即, 5 µl 从 50 µl 总RNA）中。采用无菌技术，将样品与 100 µl 在无菌的1.5 mL微量离心管中加入细菌生长培养液。使用无菌塑料涂布棒，将RNA-培养液混合物均匀涂布于琼脂平板表面。
注意：选择与动物所感染病原体生长需求相一致的肉汤类型和琼脂平板。 - 在适合病原体生长的特定条件下培养琼脂平板。在将样本移出三级生物安全实验室（BSL-3）前，检查是否未检出回收的细菌。
注意：所得洗脱的RNA在定量和完整性检测后，适用于下游应用，包括RNA测序和RT-PCR分析。
- 移除十分之一th 步骤4.12中每份洗脱RNA样本的体积即, 5 µl 从 50 µl 总RNA）中。采用无菌技术，将样品与 100 µl 在无菌的1.5 mL微量离心管中加入细菌生长培养液。使用无菌塑料涂布棒，将RNA-培养液混合物均匀涂布于琼脂平板表面。
- 使用分光光度计评估RNA的回收率和纯度。为评估RNA质量，上样1 - 2 µl 将洗脱的RNA样品加入分光光度计进行分析。记录样品在紫外（UV）范围内的吸收光谱。
- 根据紫外光谱，记录A260/A280 比率，A260/A230 比例，以及 A260 样品的吸光度值（A = Absorbance）。
- 作为单链RNA，浓度为 40 µg/mL 在260 nm处的吸光度为1.0时，计算RNA浓度（µg/mL) 通过将 A 相乘260 x 40，用于纯化后的样品。
- 作为一种快速评估RNA完整性的方法，为排除任何已降解的样本不再进行后续分析，混合 2 µl 每份RNA样本的 4 µl 含1.5倍体积上样染料的溶液［95%去离子甲酰胺，0.025%（w/v）溴酚蓝，0.025%（w/v）二甲苯蓝FF，5 mM EDTA（pH 8.0），0.025%（w/v）SDS］置于1.5 mL微量离心管中23,24.
- 加热试管 70 °C 1 分钟，然后将离心管转移至冰上放置 1 分钟。
- 将样品上样至用1x TBE配制的1%琼脂糖凝胶中（关于RNA的天然琼脂糖凝胶电泳的完整描述，请参见Rio, Ares Jr., Hannon, and Nilsen）24采用标准凝胶电泳方法分离样品，并确认28S和18S核糖体RNA条带的存在。
- 通过定量分析方法对凝胶电泳进行后续分析，以确定RNA完整性例如，生物分析仪及RIN（RNA完整性数值）分析]，具体方法如所述 代表性结果 以及在 Mueller, O. 中 等25 和 Schroeder, A. 等26.
5. 来自福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织的替代提取方法
注意：尽管福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织保存法并非核酸保存的最理想方法，但当其他保存方式的组织不可获得时，下述方案仍可用于研究某些转录水平的变化。
- 通过将福尔马林分装至塑料容器中，配制用于组织保存的福尔马林试剂。组织应以20:1的体积/重量比（福尔马林:组织）保存于福尔马林中。
警告：福尔马林是一种已知的人类致癌物，尽管不具急性毒性，但长期暴露（通常通过吸入蒸气）可能对健康构成重大危害。必须采取适当的通风措施和个人防护装备（i.e.，使用丁腈手套，并在初次接触后15分钟内更换），以最大限度降低健康风险。有关暴露监测和风险评估的更多信息，请参阅美国职业安全与健康管理局（OSHA）甲醛标准（29 CFR 1910.1048）。
注意：使用过少的福尔马林可能影响组织在保存液中完全固定的能力。 - 在分离出目标组织后，使用镊子小心地将组织修剪至厚度小于5 mm。
- 使用镊子将修剪后的组织小心浸入福尔马林中，以尽量减少飞溅。
注意：组织必须完全浸没于福尔马林中，以确保充分固定。确保组织所有表面均被福尔马林完全覆盖至关重要。
- 使用镊子将修剪后的组织小心浸入福尔马林中，以尽量减少飞溅。
- 组织浸入福尔马林后，在室温下静置至少24小时以完成固定过程。
注意：福尔马林对组织的渗透速度较慢，从各个表面每小时约渗透1 mm27,28。因此，将组织切片厚度控制在5 mm以下，可实现整个组织的快速固定。 - 固定完成后，将组织转移至适当的试剂中，用于石蜡包埋。
注意：例如，本研究中所检测的组织在包埋前被转移至70%乙醇中。 - 将组织包埋于石蜡中。29
- 将组织切片厚度调整为10–80 µm（若需提取miRNA，则使用10–20 µm切片）29。
- 使用手术刀和镊子，从每个待处理样本中取出40 mg的组织块，并置于无菌、无核酸酶的微量离心管中。
- 使用专为脱蜡和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中核酸回收而设计的商用试剂盒，从保存的样本中提取RNA。
注意：材料表中提及的试剂盒采用二甲苯和乙醇洗涤去除石蜡，随后进行蛋白酶处理，并使用玻璃纤维滤膜纯化RNA。
结果
本文所述注意事项（方案中的步骤 1 - 4）将有助于从大型动物样本中提取适用于宿主基因表达研究下游分析的 RNA。通过多种标准方法评估 RNA 在下游应用中的质量。在分光光度法检测中，A260/A280 比值可反映蛋白质污染程度，而 A260/A230 比值则可用于评估纯度，以检测苯酚等化学污染物。通常，比值约为 2.0 表明 RNA 质量较高，比值降低则提示存在污染。重要的是，这些比值无法提供有关 RNA 降解的信息，RNA 降解情况可通过定性方法（步骤 4.15 - 4.17）和定量方法（步骤 4.18，例如通过 RNA 完整性数值或 RIN 评分）进行评估。
需要注意的是，从淋巴结组织切片中回收的RNA质量水平通常低于从牛外周血白细胞样本中回收的RNA。在Fleige和Pfaffl开展的一系列针对牛组织和细胞系的RNA提取研究中30 发现平均RIN（在Bioanalyzer上测得的RNA完整性数值）在不同样本间存在差异 < 5 用于空肠和瘤胃组织 > 9，用于白细胞和黄体；淋巴结的RIN值居中，平均为6.9。总体而言，Fleige和Pfaffl30 请注意，固体组织产生的RIN评分范围为6 - 8，且富含较多结缔组织的组织表现出更高的平均降解程度。淋巴结中结缔组织密度较高，加之该组织类型固有的RNase水平，可能导致无法稳定回收RIN评分较高的RNA > 9 来自淋巴结。
然而，图4A展示了使用本方法从美洲野牛乳房上淋巴结中提取RNA的Bioanalyzer分析图谱示例，显示所获得的RNA其RIN值为8.6（主要为完整状态，适用于几乎所有下游应用）。采用本方法制备的RNA已成功用于构建RNA测序文库；该方案可常规地从美洲野牛和牛的淋巴结中分离出RIN值 > 8（且通常 > 9）的RNA样品。在一组共八个提取的RNA样品中，260 nm/280 nm的平均吸光度比值为2.1，260 nm/230 nm的平均吸光度比值为2.1，分别表明蛋白质污染较低以及酚等化学物质污染较少。每次提取的平均核酸回收量为97 ± 10 µg（每约100 mg组织），即淋巴结组织RNA产率约为1 µg RNA/mg。
图4。 代表性RNA质量图谱，展示不同提取方法所得RNA的质量情况。（A）该图显示采用本文所述方法从美洲野牛淋巴结提取的高质量总RNA的图谱。（B）该图显示选自表4的一个牛FFPE样本的图谱，显示RNA严重降解。请点击此处查看该图的高清版本。
由于从大型尸体（尤其是野生动物）中快速分离组织存在困难，安乐死后至组织样本置入RNA保存液之间的延迟时间可能对分析结果产生影响，这一问题值得关注。目前文献中关于淋巴结组织RNA稳定性的信息尤其有限。因此，为了提供组织采集可接受参数的相关信息，本研究对野牛在安乐死后淋巴结中RNA的稳定性进行了表征。
本实验中，将动物因心跳停止且角膜反射消失而被判定死亡的时刻记为0时。在将尸体转移并开始剖检后，约15分钟时采集了第一个淋巴结样本（根据我们的观察，野外动物样本回收通常耗时15–20分钟；具体时间因地点不同而有所差异）。首先识别出乳房上淋巴结，切取一小块组织并置于室温保存。随后每隔约15分钟取样一次，并立即转移至RNA保存液中；在时间序列的中间阶段，从动物体内再次获取另一份淋巴结样本，用于该系列中第二组4个时间点的检测（图5A；实心圆，图5C）。采用上述方法平行提取各淋巴结组织片段中的RNA。该持续1小时的实验表明，淋巴结RNA在整个时间过程中保持了大部分完整性，仅在实验结束时RIN值出现轻微下降（图5B 和 5C）。类似地，牛肩前淋巴结和腮腺淋巴结的RNA在死亡后约1小时的时间范围内，其完整性也通过RIN值得以证实（图5C；动物信息见表2）。此外，还从死亡8小时后采集的乳房上淋巴结组织片段中提取RNA，将完整组织片段分别置于室温或37 °C的细胞培养基中保存，以模拟动物尸体中组织的滞留状态。即使在保存8小时后，仍可观察到核糖体RNA（图5D）。
图5。美洲野牛死后不同时间采集的淋巴结样本中RNA质量分析。（A）本图展示了1小时时间序列实验的整体设计流程。（B、C）这些图显示了从一头美洲野牛分离的乳腺上淋巴结在1小时内不同时间点采集样本的RNA质量检测结果。凝胶图像显示RNA样本在甲酰胺中变性后，在1%非变性凝胶上进行电泳分离的结果。图（C）展示了各样本RIN值的变化情况。图中还叠加了在牛肩前淋巴结和腮腺淋巴结上进行的其他实验数据，如图所示。（D）本图展示了与图（B）所用凝胶方法相同的RNA凝胶示例，样本为乳腺上淋巴结组织在细胞培养基中分别于室温（第1道）或37 °C（第2道）孵育8小时后处理所得。请点击此处查看该图的放大版本。
这些代表性结果与其他组织类型和来源的 RNA 稳定性研究结果一致。 表3 提供了部分已发表论文中关于RNA在样本预保存不同时间点稳定性的研究结果汇总。请注意，表中仅包含来自RIN评分和/或rRNA凝胶观察（总RNA）的趋势信息，尽管部分论文还提供了mRNA完整性的额外分析，例如通过测定5'端与3'端的比值 与 选定RNA的3'片段例如, Fajardy 等)31然而，需要注意的是，死亡与样本保存之间的时间越长，越可能导致RNA表达谱的变化，例如胎盘组织的研究结果所示31与稳定的转录本相比，不稳定的RNA更容易被降解。因此，在动物可供解剖后，必须采用快速、简化的组织采集流程，以尽量减少延迟，从而获得最具生物学有效性的RNA表达谱。认为完整的核糖体RNA的存在即表明转录组谱无任何变化，这是一种错误观点。尽管如此，代表性结果表明，即使在大型动物取样所需处理时间延长的情况下，仍有可能从淋巴结样本中提取适用于基因表达分析的RNA。
此外，还考察了复苏后放置时间这一变量的影响；在此期间，RNA容易受到组织中核酸酶的降解作用。通过RIN评分对在步骤4.1中复苏后分别在室温下放置0或64分钟时采用本方案处理的RNA样品质量进行了测定。该实验表明，该方案对复苏后放置时间不敏感，因此在处理多个样本时具有良好的稳健性（图6A）。
图6. RNA质量参数的附加分析。（A）该图显示了在解冻后立即（0分钟）或在室温下放置64分钟后进行处理所提RNA的RNA质量结果。每组条件下的柱状图表示三个组织样本的平均值，误差线为标准差。所有组织在解冻前均保存于RNA保护液中，具体操作如实验方案所述。（B）该图显示了一个未充分匀浆的淋巴结组织样本的Bioanalyzer图谱，其中含有大量结缔组织片段。与5S区域的峰相比，28S和18S峰较小，特征明显。这种情况也可能由RNA降解引起，但5S区域与18S峰之间相对平坦的基线提示更可能是提取效果不佳所致；详见Avraham, R. et al.48 的进一步说明。请点击此处查看该图的放大版本。
为了与从淋巴结中分离RNA的方法进行比较，本研究开展了从牛肠系膜淋巴结FFPE组织切片中回收RNA的试验。如前所述，样品在福尔马林中固定1周后进行石蜡包埋，并在室温下以石蜡保存4个月。将组织切片切成五个10 µm的切片，采用FFPE提取方法，每个样品平均回收约62 ng/µL的RNA（± 14 ng/µL）。260 nm与280 nm处的吸光度比值平均为1.9，表明RNA产物中蛋白质污染水平较低；然而A260/A230比值不理想（表4）。需注意的是，这些样品的RIN评分极低（< 2），表明RNA产物已发生严重降解（表4；图4B），这与Srinivasan et al.45的描述一致。在使用qPCR的检测中，通常仅扩增RNA的短片段，或更具体地说是cDNA（< 200 bp）。因此，即使从已降解的样品中仍可实现小片段产物的扩增，qPCR分析仍可进行。例如，已可从这些FFPE回收的样品中通过qPCR扩增出核糖体蛋白S9（RPS9）转录本的一段序列。各样品间的CT值具有一致性，平均为19.2 ± 1.8。然而，使用FFPE制备的样品时需注意其固有局限性：较长的扩增产物可能并不存在，且不同样品间的降解程度可能并不一致。因此，此类材料可用于研究，但需谨慎对待，对于RNA测序等后续应用存在显著限制。
| 淋巴结类型 | 位置 | 长度 | 宽度 | 淋巴结引流区域 |
| 肩前淋巴结 | 位于肩关节内侧稍偏处；埋于皮下脂肪中，并位于肌肉层下方 | 1-10 cm | 1.5-2 cm | 颈部皮肤、肩部以及胸肢下部的皮肤、肌肉和关节（参考文献8） |
| 股前淋巴结（亦称胫前淋巴结） | 位于膝关节背侧和内侧稍偏处，约在髌骨上方12-15 cm处 | 8-10 cm | 2.5 cm | 骨盆肢皮肤、腹部以及胸廓后部区域（参考文献8） |
| 咽后淋巴结 | 位于咽部背侧中线处 | 4-5 cm | 2-3.5 cm | 舌、口腔黏膜、牙龈、嘴唇、硬腭、唾液腺以及颈部大部分肌肉 |
| 腮腺淋巴结 | 位于颞下颌关节腹侧皮下，咬肌后方（参考文献8） | 6-9 cm | 2-3 cm | 头部皮肤与皮下组织、头部大部分肌肉、眼与耳的肌肉、眼睑、泪腺以及鼻腔前部 |
| 下颌下淋巴结（可能存在1-3个） | 位于下颌角内侧皮下，与唾液腺相关联 | 3-4 cm | 2-3 cm | 吻部、嘴唇、颊部、硬腭、鼻腔前部、舌尖、头部皮肤与肌肉（参考文献8） |
| 乳房上淋巴结（雌性浅腹股沟淋巴结，通常有2个） | 位于乳腺后方和背侧 | 6-10 cm | 乳房、阴唇、阴道前庭、大腿内侧和后侧皮肤、小腿内侧表面 | |
| 阴囊淋巴结（雄性浅腹股沟淋巴结） | 位于阴囊颈周围脂肪层内，耻前腱下方 | 3-6 cm | 阴囊、包皮和阴茎 |
表1. 牛浅表淋巴结概述。
| 动物描述 | 文稿中的位置 | 年龄 | 性别 | 健康状况 |
| 视频中的 Bison bison | 视频中的野牛——淋巴结回收 | 5-6 岁 | 雌性 | 健康 |
| 视频中的 Bos taurus | 视频中的牛——淋巴结回收 | 7-8 岁 | 去势雄性 | 健康 |
| 用于 RNA 稳定性研究的 Bison bison | 图 5A-C | 5-6 岁 | 雌性 | 健康 |
| 用于 RNA 稳定性研究的 Bos taurus A | 图 5C、图 6A | 7-8 岁 | 去势雄性 | 健康 |
| 用于 RNA 稳定性研究的 Bos taurus B | 图 5C | 7-8 岁 | 去势雄性 | 健康 |
| 用于 FFPE 质量研究的 Bos taurus | 表 4、图 4B | 0.5 岁 | 去势雄性 | 健康（O157:H7 感染研究中的对照） |
| 请注意，该方法还应用于本文未特别列出的多种其他牛、野牛和山羊的淋巴结样本。 | ||||
| 此外，我们还对一头1.5 月龄雌性犊牛采集的淋巴结使用了相同的方法。 | ||||
表2. 用于预实验的动物特征。
| 组织类型 | 保存方法 | 培养条件 | 降解结论 | 参考文献 |
| 牛脂肪、骨骼肌、肝脏 | 速冻（液氮）2) | 4 °C，真空包装的组织 | 肌肉RNA更稳定（即使储存长达8天仍保持稳定）；脂肪和肝脏组织主要在24小时内保持稳定，通过rRNA条带的形态评估得出该结论 | Bahar 等（2007）32 |
| 人类结肠，结直肠癌 | RNA保存液 | 室温 | RIN 在 2 小时内保持稳定，但部分基因在 0.5 至 2 小时内表现出表达水平的变化。 | Yamagishi 等（2014）33 |
| 小鼠肝脏、脾脏 | RNA保存液，或速冻（干冰-丙酮混合物） | 小鼠尸体内部（37 °C) | 脾脏样本在1.5小时内保持稳定；肝脏样本则出现较早的降解（105分钟时RIN下降24%） | Choi 等（2016）34 |
| 小鼠肝脏 | 无（在硫氰酸胍-苯酚-氯仿中均质化的新鲜样本） | 25 °C, 37 °C | 4小时内的有限降解。 25 °C，但在 37 °C 4小时。（通过RIN评分观察得出） | Almeida 等（2004）35 |
| 人体回肠 | RNA保存液，或速冻处理 | 4 °C, 37 °C | 通常在1.5 h内保持稳定。 37 °C；在6小时内保持稳定。 4 °C （通过RIN值评估观察到的结果）。请注意，作者还在表S1中提供了所选RNA稳定性资源的汇总，可为希望进一步查阅组织RNA完整性相关文献的研究者提供额外参考。 | Lee 等（2015）36 |
| 人类肝脏 | 速冻（液氮）2 或异戊烷） | 室温 | 1小时观察到降解现象（ΔRIN最高达0.85）；肝脏样本越小，降解程度越高。 | Kap 等（2015）37 |
| 人类结直肠癌 | 速冻（液氮/异戊烷） | 4 °C | 1小时即观察到降解现象；冷冻延迟90分钟后，RIN值仅为4.2 | 洪等人（2010）38 |
| 人类肝脏 | RNA保存液，也可采用速冻法（液氮）2) | 室温， 4 °C | 样品在冰上保存即使长达1天仍保持稳定；室温下放置1天后观察到降解（但放置3小时后未见降解，通过RIN评分观察得出）。 | Lee 等（2013）39 |
| 马脂肪、骨骼肌 | 速冻（液氮）2) | 13 °C | 作者建议，肌肉组织的最佳完整性应在取样后2小时内；作者根据rRNA凝胶电泳图谱观察结果，推荐脂肪组织在0.5小时内进行保存。 | Morrison 等（2014）40 |
| 鲑鱼脑、肾、肝、肌肉 | RNA保存液 | 室温 | 脑组织 RNA 在 4–8 小时内保持稳定，肾脏和肌肉组织在 8 小时时已出现部分降解（通过凝胶电泳和 RIN 值评分评估） | 西尔 & Sweeney (2008)41 |
| 兔结缔组织（韧带、肌腱、软骨） | 速冻（液氮）2) | 4 °C室温 | 死后96小时内未观察到“明显”降解，rRNA凝胶外观证实了这一点 | 马丘克等人（1998）42 |
| 大鼠脑、肺、心、肝 | 似乎是新鲜提取的 | 大鼠尸体内部 20 °C 培养箱 | 脑组织中RNA稳定性最高（死后7天仍可观察到rRNA条带，尽管已出现降解），肺和心脏中稳定性中等，肝脏中稳定性较低；通过rRNA凝胶电泳图谱观察得出 | 井上等人（2002）43 |
| 人扁桃体、结肠 | 添加或不添加RNA保存液后迅速冷冻 | 室温（22 °C), 4 °C RNA保存液、冷生理盐水或冰0 °C) | 在冰上或RNA保存液中可稳定保存至16小时；在冷生理盐水或室温下保存6或16小时时略有降解（通过RIN评分测定） | 米克等人（2006）44 |
表3. 关于死后组织样本中RNA稳定性的部分前期研究结果。条目选自文献中关于RNA稳定性的研究论文，涵盖多种组织类型，包括小鼠、人类活检及兽医领域的示例。针对每个示例，提供了样本保存方法、提取前的储存方式以及结果的简要总结。除非特别注明，样本储存条件范围从冰上至37 °C，随后进行速冻或加入RNA保存溶液处理（即在孵育期间若无特别说明，未使用RNA保存溶液进行稳定性测定）。
| 样本编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A260/A280 | 1.96 | 1.98 | 1.98 | 1.91 | 1.98 | 1.89 | 1.89 | 1.91 | 1.9 | 1.84 | 1.84 | 1.97 |
| A260/A230 | 0.67 | 0.14 | 0.19 | 0.26 | 0.61 | 0.69 | 1.33 | 0.11 | 0.21 | 0.39 | 0.1 | 0.44 |
| RIN | 1.6 | 1.1 | 1.3 | 1.2 | 1 | 1.3 | 2 | 1.1 | 1.2 | 1 | 1 | 1 |
表4. 从牛FFPE肠系膜淋巴结中分离RNA的代表性结果。该表格展示了采用本文所述方法处理的一系列FFPE牛淋巴结样本的分光光度法及质量分析结果。所有样本的RNA均呈现高度降解状态。
讨论
大多数转录组学研究及相关实验方案主要关注小鼠、大鼠或死后人类样本。然而，对家畜和野生动物的研究为表征免疫系统对疾病的应答提供了广泛的机会，这些研究不仅适用于兽医学，也与人畜共患疾病的公共卫生密切相关。本实验方案概述了从牛、野牛、山羊和绵羊等大型动物组织中提取高完整性RNA的关键注意事项。由于动物体型较大，且样本采集条件复杂，使得组织获取过程更为耗时，其死后处理时间也比小鼠淋巴结的获取更长。同样，这些淋巴结体积较大，因此需要采用能够从不同动物中平行获取样本、并能代表淋巴结内免疫学/病理学变化的实验方案。本方案中关于样本采集的建议，有助于获得完整的RNA，同时通过淋巴结分段取样，确保获得具有代表性的分子谱型。
为了说明此处所介绍的标准化取样策略和方案的重要性，我们从 PubMed Central 数据库中检索了 25 篇表征家畜淋巴结转录组的研究论文。其中一篇论文提到一次性处理大块淋巴结组织，一篇讨论了特定的激光捕获显微切割方法，一篇提到从淋巴结中采集了“"代表性样本"”，仅有一篇论文46 明确指出所采集的淋巴结组织（大小为 10 mm3 ）包含皮质和髓质区域。尽管其他论文提到处理了较小的样本（通常为 30–100 mg）用于 RNA 分析，但 84% 的论文未提及这些组织样本的取样策略。由于 RNA 测序成本仍然相对较高，在大多数情况下，对每个淋巴结进行多个切片分析在经济上并不可行，尤其是考虑到通常需要优先保证生物学重复样本以进行统计分析。通过采集矢状面切开淋巴结的楔形组织样本，可在所有样本中捕获来自富含不同类型免疫细胞的淋巴结区域的 RNA。因此，本方案可作为淋巴结转录组学研究中一种有据可依且可重复的取样策略的参考标准。
在从组织中制备RNA的过程中，存在多个需要进行操作决策的关键步骤。首先，在保存液的使用方面，方法学文献中的做法并不一致。 与 使用闪冻组织样本（以及随后的低温研磨）。特别是在大型动物尸检的情况下，采用本方案中包含的保存液具有多种潜在的操作优势。首先，组织样本可在尸检过程中直接保存在保存液中，无需立即将样本管转移至液氮中。其次，在进行RNA提取前的样本处理阶段，保存液可提供额外保护，尤其当样本在均质化前发生部分或短暂解冻时。结果表明 图6A 表明这种保护作用也适用于淋巴结组织。相比之下，速冻样品必须始终保持在冷冻状态，直至使用含酚缓冲液进行匀浆的瞬间。最后，对于大型动物的野外尸检，若无法 readily 获得液氮，样品可暂时保存在保存液中，直至送回实验室。
该方案中分子组分的其他优势包括：在初始组织处理过程中含有苯酚，可在对感染动物样本进行匀浆（产生气溶胶的过程）时起到消毒作用；同时采用离心柱法去除样本中残留的苯酚和异硫氰酸胍。代表性结果表明，该方案所提取的RNA质量较高，经A260/A280 和 A260/A230 比率、凝胶电泳和RIN值，并且在应对家畜和野生动物取样时间序列挑战时具有较强的稳健性。组织保存的配对（例如，置于RNALater中），在基于苯酚的试剂中进行匀浆处理（例如，TRIzol）和硅胶柱纯化方法已在文献中成功用于分析感染胃肠道线虫的绵羊真胃淋巴结中的基因表达模式46 以及感染了疱疹病毒的牛淋巴结47，RIN 分值分别大于 8 和大于 7，且覆盖所有样本。
如果获得的RNA在后续分析中RIN值不理想，应评估以下RNA处理过程中的标准变量：死后总处理时间、组织状态、解冻后的处理时间/延迟、RNA提取操作技术以及提取后的RNA操作过程。尤其当组织来源于自然死亡而非安乐死的动物时，应特别关注死后总处理时间。如上所述，淋巴结中的RNA相对稳定，但过长的处理延迟仍可能导致RNA降解，特别是对于不稳定的转录本。若比较在野外放置时间差异较大的尸体样本，可能存在混杂的时间变量。应评估组织的状态，因为感染相关的病理变化所导致的组织完整性破坏可能降低RNA的稳定性。例如，在感染动物的胎盘子叶中已观察到RNA质量下降的情况。 布鲁氏菌-流产后感染动物（Boggiatto 等，已提交）。如本方案所述，使用保存液可减轻解冻后的处理时间/延迟。务必确保组织块的厚度足够小，以允许保存液充分且快速地渗透入组织中< 5 mm 厚度，使用前述提及的防腐剂处理 材料表）。在RNA提取过程中，所用缓冲液应为无RNase的，且必须避免与手套及其他可能被污染的物品接触（皮肤上存在RNase）。在研磨淋巴结组织时，潜在RNase的主要来源是组织本身，但在实验操作的各个阶段均应尽量减少外源性污染物的引入。根据本方案所述，在提取后的RNA处理过程中，应将RNA样品分装至离心管中，再进行-80°C冷冻保存，以避免后续为进行质量与定量分析而反复冻融样品。
除了RNA样本降解外，产量低还可能源于第4.3步中淋巴结组织匀浆不充分。请注意，RNA保存溶液中的孵育可能会改变组织的质地（增加硬度），尽管在预实验中，大多数淋巴结组织使用此处所述的大齿型转子-定子解离器均能有效解离。如步骤4.3.1所述，若解离不完全，应重复在基于苯酚的试剂中进行匀浆。对于无法获得符合上述规格匀浆仪的实验室，另一种替代方法是使用研钵和研杵研磨组织，随后将研磨后的样本重悬于基于苯酚的试剂中。然而，使用一次性离心管进行匀浆相比在研钵和研杵中研磨冷冻组织具有多项潜在优势，包括处理多个样本时操作流程更简便、耗时更短，避免研磨过程中的样本损失，无需清洁步骤，以及在处理来自感染动物的组织时，可避免与粉末状样本的潜在接触。
Avraham 等48 指出，最终RNA产物中出现明显的5S RNA峰，同时28S和18S核糖体RNA回收率较低，可能是细胞裂解不完全的迹象（对于淋巴结处理而言，这可能是由于组织解离不充分所致）。 图6B 展示了从一块富含结缔组织且未能有效均质化的牛腮腺淋巴结组织中获得的RNA图谱示例。应计算并监测同一批次中各样本的RNA得率，以确认每毫克组织获得的RNA回收量相近；用于RNA测序直接比较的样本应统一进行批量处理，并对所有样本采用相同的均质化策略。需注意，楔形取样法还有助于避免采集到完全由大量结缔组织构成的区域样本。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。所有研究均由美国农业部农业研究局内部资金资助。提及特定产品仅出于实验可重复性的目的，不代表联邦政府对这些产品有任何 endorsement。
致谢
作者谨此感谢 James Fosse 在所有视频拍摄和视频处理方面所做的出色工作；感谢 Michael Marti 在生成数字化牛图像方面的出色贡献；感谢 Lilia Walther 在 RNA 提取和 Bioanalyzer 检测中的帮助；感谢 Mitch Palmer 和 Carly Kanipe 对淋巴结图像提供的有益审阅和反馈；同时感谢国家动物疾病中心的动物护理和兽医团队在动物饲养以及剖检准备工作中的辛勤付出与协助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNA保存液（本实验均使用RNALater） | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1.5 ml或2 ml聚丙烯微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 一次性手术刀 | Daigger Scientific | EF7281 | |
| 组织镊，鼠齿型 | Fisher Scientific | 12-460-117 | 也可选用其他类型的组织镊，如弯头、锥形边缘等，视用户偏好而定 |
| 3 mm穿刺活检针 | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| 锐器盒（小型且便于携带，用于解剖） | Stericycle | 8900SA | 图示为1夸脱规格 |
| 切片板或一次性托盘 | Fisher Scientific | 09-002-24A | 有多种尺寸可选，视用户偏好而定 |
| 个人防护装备 | 根据病原体不同而异（手套、呼吸器面罩、护目镜等） | ||
| 酚类RNA提取试剂（本实验均使用TRIzol试剂） | ThermoFisher | 15596026 | |
| 基于二氧化硅柱的RNA提取试剂盒（本实验均使用PureLink RNA Mini试剂盒） | ThermoFisher | 12183018A | 适用于最多100 mg组织 |
| 100%乙醇（分子生物学级，200 proof） | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 配备封闭式匀浆管的组织匀浆仪（本实验均使用gentleMACS解离仪） | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| 琼脂糖（通用型，用于凝胶电泳） | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | 也可在实验室自行配制 |
| 去离子甲酰胺 | EMD Millipore | S4117 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| 二甲苯青 | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA（乙二胺四乙酸） | Sigma-Aldrich | EDS | |
| 紫外-可见分光光度计（本实验使用NanoDrop分光光度计） | ThermoFisher | ND-2000 | |
| 用于RNA定量分析的设备（本实验使用Bioanalyzer及其配套组件和方案） | Agilent | G2939BA | |
| FFPE组织RNA提取试剂盒（本实验使用RecoverAll总核酸分离试剂盒，适用于甲醛固定、石蜡包埋组织） | ThermoFisher | AM1975 | |
| 塑料涂布棒（L形涂布棒） | Fisher Scientific | 14-665-231 | 仅用于感染动物样本的无菌检测 |
| 解剖刀 | Livestock Concepts | WI-0009209 |
参考文献
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